基于BSA和SLAF-Seq技術(shù)對大豆主莖節(jié)數(shù)QTL精細(xì)定位

楊玉花 白志元 衛(wèi)保國 雷 陽 張瑞軍

(1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太原 030031)

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上重要的農(nóng)作物之一，也是食用油、植物蛋白和飼料的主要來源，由于目前大豆的供需極度不平衡，因此高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)是大豆育種的最重要目標(biāo)[1]。大豆主莖節(jié)數(shù)是從子葉節(jié)以上至主莖頂端的有效節(jié)數(shù)，是一個相對穩(wěn)定的數(shù)量性狀，且遺傳力較高[2]。該性狀不僅是影響大豆株型的主要性狀，同時也是影響大豆產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。因此，應(yīng)用高通量測序技術(shù)快速精準(zhǔn)定位大豆主莖節(jié)數(shù)相關(guān)位點(diǎn)，開發(fā)與大豆主莖節(jié)數(shù)位點(diǎn)緊密連鎖的且易于操作和低成本的分子標(biāo)記，從而加速大豆主莖節(jié)數(shù)分子標(biāo)記輔助育種，促進(jìn)大豆高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。傳統(tǒng)遺傳學(xué)方面得到一定的研究進(jìn)展，如王芳[3]研究發(fā)現(xiàn)大豆主莖節(jié)數(shù)與單株莢數(shù)和每莢粒數(shù)等產(chǎn)量農(nóng)藝性狀相關(guān)性較高，暗示通過更直觀的主莖節(jié)數(shù)也可以洞察植株產(chǎn)量等性狀。李玉清[4]研究發(fā)現(xiàn)大豆主莖節(jié)數(shù)性狀具有一定的母體效應(yīng)，可以早代選擇。同時前人在大豆主莖節(jié)數(shù)數(shù)量性狀(quantitative trait locus，QTL)分子遺傳定位方面做了很多研究，目前有37 個與大豆主莖節(jié)數(shù)相關(guān)的QTL定位結(jié)果(https:/ /soybase.org/)[5－12]。如Zhang 等[7]以Kefeng 1 號和Nannong1138－2 為親本雜交構(gòu)建含有184 個株系的重組自交系(recombinant inbred lines-RIL) 群體，利用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat，SSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，共檢測到10 個與大豆主莖節(jié)數(shù)相關(guān)的QTL。Chen等[8]以美國大豆品種Charleston×東農(nóng)594 的F2:10代154 個株系的重組自交系為材料，檢測到7 個主莖節(jié)數(shù)QTL。Liu 等[9]利用Jinpumkong 2×SS2－2 (J×S)和Iksannamulkong×SS2－2 (Ⅰ×S)兩個重組自交系群體構(gòu)建遺傳連鎖圖，共檢測到2 個主莖節(jié)數(shù)QTL。由前人研究報(bào)道可知，大豆主莖節(jié)數(shù)的QTL 定位研究較少，并且對大豆主莖節(jié)數(shù)分子方面的研究較淺薄。由于前人定位所采用的標(biāo)記大多數(shù)是SSR 標(biāo)記(可開發(fā)的大豆SSR 標(biāo)記較少)，所以定位的區(qū)間都比較大。隨著大豆全基因組測序信息的公布，利用重測序技術(shù)可以更精確檢測與主莖節(jié)數(shù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)和基因，重測序緊密連鎖的分子標(biāo)記是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，但是SNP 標(biāo)記不能直接運(yùn)用，必須基于SNP 多態(tài)轉(zhuǎn)化成酶切擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS)或者衍生 CAPS 標(biāo)記( derived cleaved amplified polymorphic sequences，dCAPS)才能應(yīng)用。但由于標(biāo)記的轉(zhuǎn)化過程耗時長，且轉(zhuǎn)化成本高，因此利用雙親間的插入缺失核酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)InDel 標(biāo)記作為與大豆主莖節(jié)數(shù)緊密連鎖的分子標(biāo)記具有可行性，并且InDel 標(biāo)記與SSR 標(biāo)記同樣具有變異穩(wěn)定，多態(tài)性強(qiáng)，成本低的優(yōu)點(diǎn)。

本研究以大豆品種中119 和C025 為親本構(gòu)建RIL 群體，利用傳統(tǒng)分群分析法(bulk segregant analysis，BSA)和全基因組特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測序手段(specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-Seq)關(guān)聯(lián)與大豆主莖節(jié)數(shù)相關(guān)位點(diǎn)。同時利用雙親的25×重測序，檢測雙親在關(guān)聯(lián)區(qū)間的InDel遺傳變異。依據(jù)關(guān)聯(lián)區(qū)間開發(fā)的InDel 標(biāo)記信息對主效區(qū)間進(jìn)行精細(xì)定位。本研究結(jié)合BSA-SLAF-Seq高通量測序技術(shù)和親本重測序信息，并開發(fā)InDel 標(biāo)記加密關(guān)聯(lián)區(qū)間，旨在實(shí)現(xiàn)大豆主莖節(jié)數(shù)位點(diǎn)的精細(xì)定位，為大豆主莖節(jié)數(shù)候選基因的克隆奠定基礎(chǔ)，同時加速定向改良大豆主莖節(jié)數(shù)分子標(biāo)記輔助育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料田間試驗(yàn)和性狀考察

本研究利用山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所收集的C025(少主莖節(jié)數(shù))大豆為母本，中119(多主莖節(jié)數(shù))大豆為父本雜交獲得F1，自交獲得188個單株的F2群體，并記錄F2表型。然后通過5 代自交獲得102 個單株/系的RIL 分離群體。2017年和2018年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽基地種植父母本、F1和RIL 群體并考察主莖節(jié)數(shù)性狀。田間試驗(yàn)按照完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3 次重復(fù)，每個小區(qū)2 行，株距為50.0 cm，行距為13.5 cm。大豆成熟時，每個小區(qū)選擇10個代表單株人工統(tǒng)計(jì)主莖節(jié)數(shù)(從主莖節(jié)到頂端之間的所有節(jié)數(shù))，并計(jì)算其平均值[13]。

1.2 SLAF 文庫構(gòu)建測序以及SLAF 標(biāo)簽的開發(fā)和SNP 標(biāo)記檢測

利用北京百邁客生物科技有限公司自主研發(fā)的酶切預(yù)測軟件對大豆參考基因組(Wm82.a2.v1)進(jìn)行酶切預(yù)測，最終確定本研究采用的限制性內(nèi)切酶為RsaI＋HaeIII，對檢測合格的4 個樣品(父、母本，少主莖節(jié)混池和多主莖節(jié)混池)基因組DNA 分別進(jìn)行酶切。然后通過PCR 擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段等，最后利用Illumina HiSeqTM2500 平臺完成測序。

特異長度擴(kuò)增片段測序(specific length amplified fragment sequencing，SLAF-Seq)測序數(shù)據(jù)分析參照Sun等[14]操作程序處理?；谛蛄邢嗨贫葘λ芯哂星逦饕畔⒌腟LAF 雙端讀取進(jìn)行聚類，并在BLAST 中采用一對一的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示平均比對效率均在91.47%以上，說明本研究各個樣品測序數(shù)據(jù)正常。通過3′端加A 處理、連接Dual-index[15]測序接頭對每個樣品的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。通過評估序列質(zhì)量和數(shù)據(jù)量對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。然后將clean reads 與參考基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，并開發(fā)SLAF 標(biāo)簽和SNP 標(biāo)記[16]。通過相關(guān)分析確定與大豆主莖節(jié)數(shù)密切相關(guān)的SNP，并根據(jù)相關(guān)閾值確定候選區(qū)間。最后，進(jìn)行基因功能注釋和生物途徑富集分析，以確定候選區(qū)間的基因。

1.3 ED 值和SNP-index 關(guān)聯(lián)分析

依據(jù)RIL 群體30 株極端多主莖節(jié)數(shù)(用RR 表示)和30 株極端少主莖節(jié)數(shù)(用Rr 表示)混池表型，以及SLAF 測序后的基因型，利用歐式距離(euclidean distance，ED)算法，尋找兩個混池間存在顯著差異標(biāo)記，從而評估與主莖節(jié)數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)區(qū)間。理論上，除了BSA 測序建立的兩個混合基因庫中與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因座存在差異外，其他基因座的差異趨于一致，因此，非目標(biāo)相關(guān)基因座的ED 值等于0。ED 值估算如下:ED＝

式中，ARR、TRR、CRR、GRR分別代表RR 混池中各個堿基的頻率，而ARr、TRr、CRr、GRr分別代表在Rr 混池中各個堿基的頻率。理論上ED 值越高，越接近目標(biāo)位點(diǎn)[17]。

在進(jìn)行分析時，利用兩個混池間基因型存在差異的SNP 位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)各個堿基在不同混池中的深度，并計(jì)算每個位點(diǎn)ED 值[18]。本研究將ED 的2 次方作為關(guān)聯(lián)值以達(dá)到消除背景噪音的功能，然后采用SNPNUM 方法對ED 值進(jìn)行擬合，并根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值選擇閾值以上的區(qū)間作為與主莖節(jié)數(shù)基因相關(guān)的區(qū)間。

同時采用另一種ΔSNP-index 算法評估與主莖節(jié)數(shù)性狀分離相關(guān)的位點(diǎn)。SNP-index 統(tǒng)計(jì)公式如下:

Maa 和Paa 分別是表示父本和母本的測序深度，Mab 和Pab 分別表示混池性狀與母本一致的和混池性狀與父本一致的測序深度。通過ΔSNP-index 確定父母本與混池間的位點(diǎn)差異[19]。

1.4 InDel 標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)大豆Williams 82 (Glycine maxV2.0)的參考基因組序列，利用SLAF-BSA 高通量測序結(jié)果，確定了調(diào)控大豆主莖節(jié)數(shù)的物理區(qū)間。然后利用本研究中119 和C025 25×深度的重測序信息，使用GATK[20]軟件工具包開發(fā)目標(biāo)區(qū)間的InDel 標(biāo)記。

1.5 目標(biāo)區(qū)間精細(xì)定位

利用新開發(fā)的InDel 標(biāo)記在RIL 群體中進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)合表型分析，對目標(biāo)區(qū)間精細(xì)定位。QTL 掃描采用WinQTL Cartographer 2.5 軟件(http:/ /statgen.ncsu. edu/qtlcart/WQTLCart.htm)中的復(fù)合區(qū)間作圖法。葉片的DNA 提取采用改良的CTAB 方法[21]，PCR擴(kuò)增以及PCR 產(chǎn)物進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀參照文獻(xiàn)[22－23]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 父母本和RIL 群體主莖節(jié)數(shù)表型變異分析

多年試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)親本C025 的平均主莖節(jié)數(shù)為9.13，中119 的平均主莖節(jié)數(shù)為16.59，親本間的主莖節(jié)數(shù)相差近2 倍(表1)。本研究利用單粒傳法獲得含有102 個單株/株系的RIL 群體(F5)，2017年和2018年兩年調(diào)查RIL 群體主莖節(jié)數(shù)，發(fā)現(xiàn)分離群體主莖節(jié)數(shù)表現(xiàn)出廣泛的變異(4.03～19.19)(圖1)。

表1 雙親主莖節(jié)數(shù)表型分析Table 1 The phenotypic variation of node numbers on the main stem in parents

2.2 SLAF 測序數(shù)據(jù)分析和評估以及SALF 標(biāo)簽和SNP 標(biāo)記的開發(fā)

利用SLAF 測序?qū)﹄p親和RIL 群體多少主莖節(jié)數(shù)混池進(jìn)行序列分析，限制性內(nèi)切酶RsaI 和HaeIII 酶切的SLAF 片段長度在364～414 bp。然后通過BWA[24]軟件將樣本的測序reads 與參考基因組進(jìn)行比對，結(jié)果顯示本次試驗(yàn)雙端比對效率在90.34%，說明比對效率正常。測序結(jié)果表明，Q30 的百分比平均含量為95.35%，GC 的百分比平均含量為40.27%。父本中119(aa)過濾后的reads 數(shù)為15 123 276，Q30 的百分比含量為95.71%，GC 的百分比含量為40.10%；母本C025(ab)過濾后的reads 數(shù)為17 566 874，Q30 的百分比含量為95.67%，GC 的百分比含量為39.99%；后代RIL 極端混池(ac 和ad)過濾后的reads 數(shù)分別為25 436 458 和21 960 126，Q30 的百分比含量分別為95.30%和94.70%，GC 的百分比含量分別為40.52%和40.48%(表2)。

表2 高通量測序數(shù)據(jù)挖掘表Table 2 Mining results of the high-throughput sequencing data

本研究共開發(fā)了1 003 590 個SLAF 標(biāo)簽，父母本的平均測序深度為28.48×，而混合池的為36.16×。其中父本中119 共獲得241 118 個SLAF 標(biāo)簽數(shù)，平均測序深度為26.65×，母本C025 共獲得240 712 個SLAF標(biāo)簽數(shù)，平均測序深度為30.30×。RIL 群體兩個極端混池獲得SLAF 標(biāo)簽數(shù)分別為260 003 和261 757，平均測序深度分別為38.89×和33.43×(表3)。

表3 測序開發(fā)的SLAF 標(biāo)簽數(shù)Table 3 Sequencing data of the developed SLAF markers

SNP 的檢測主要使用GATK[18]軟件工具包和samtools[16]進(jìn)行變異檢測，以確保其準(zhǔn)確性。將以上兩種方法分別得到的變異位點(diǎn)一致的SNP 用于后續(xù)分析。雙親和RIL 群體極端混池4 個樣品的SNP 統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2 所示，共檢測到193 082 個SNP 位點(diǎn)，父母本檢測到的SNP 位點(diǎn)略低于兩個混池，但是4 個樣本間均有重復(fù)的SNP 位點(diǎn)。同時對不同染色體進(jìn)行SLAF 標(biāo)簽和SNP 標(biāo)記開發(fā)(圖3)。

2.3 主莖節(jié)數(shù)關(guān)聯(lián)分析

在關(guān)聯(lián)分析前，首先對SNP 進(jìn)行過濾，共過濾了166 530 個SNP，最終得到高質(zhì)量的可信SNP 位點(diǎn)26 552 個。然后進(jìn)行ED 值分析，統(tǒng)計(jì)各個堿基在不同混池中的深度，并計(jì)算每個位點(diǎn)ED 值，最后取所有位點(diǎn)擬合值的median＋3SD ＝0. 23 作為分析的關(guān)聯(lián)閾值[18]。根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值判定，在4 號染色體共得到28 個區(qū)間，總長度為16. 44 Mb，共包含1 287 個基因，其中非同義突變SNP 位點(diǎn)的基因共35 個(表4)。

表4 依據(jù)ED 值關(guān)聯(lián)區(qū)間信息統(tǒng)計(jì)表Table 4 The information of the association region by ED value

采用SNP-index 方法關(guān)聯(lián)分析前需要對SNP 位點(diǎn)進(jìn)行過濾，獲得過濾后的高質(zhì)量可信26 552 個SNP 位點(diǎn)。利用SNPNUM 方法對ΔSNP-index 進(jìn)行擬合(圖4)，結(jié)合群體的理論分離比得到閾值為0.36，最終在4號染色體上關(guān)聯(lián)5 個區(qū)間，總長度為1.66 Mb，共包含120 個基因，其中非同義突變的基因共6 個(表5)。

表5 依據(jù)SNP-index 值關(guān)聯(lián)區(qū)間信息統(tǒng)計(jì)表Table 5 The information of the association region by SNP-index value

最后取兩種分析方法的結(jié)果交集，結(jié)果顯示ED值方法關(guān)聯(lián)結(jié)果包含了SNP-index 關(guān)聯(lián)分析方法，因此最終取ΔSNP-index 方法關(guān)聯(lián)結(jié)果。

2.4 關(guān)聯(lián)區(qū)間基因功能注釋以及InDel 標(biāo)記的開發(fā)

利用BLAST 軟件將相關(guān)區(qū)的120 個基因與NR[24]、SwissProt、GO[25]、COG[26]和KEGG[27]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，最終獲得113 個基因注釋信息。其中KEGG中38 個基因的注釋參與了核糖體、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、氧化磷酸化、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、谷胱甘肽代謝和泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解等8 條信號通路。

然后利用父母本C025 和中119 重測序信息，分析1.66 Mb 關(guān)聯(lián)區(qū)間雙親的基因組信息，共得到4 214 個InDel 位點(diǎn)。在第5 個關(guān)聯(lián)候選區(qū)間進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并將設(shè)計(jì)的引物在親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，最終獲得了67 對InDel 引物(圖5)。

2.5 關(guān)聯(lián)主效區(qū)間精細(xì)定位

利用每個區(qū)間開發(fā)的新Indel 標(biāo)記對雙親和F2群體進(jìn)行基因型驗(yàn)證，結(jié)果顯示在InDel 標(biāo)記Chr04－21和Chr04－55 間檢測到一個與大豆主莖節(jié)數(shù)相關(guān)的主效QTL(圖6)，同時這個位置也是關(guān)聯(lián)區(qū)間的第3 個關(guān)聯(lián)區(qū)間。因此初步將候選區(qū)間縮小到第3 區(qū)間0.9 Mb 范圍內(nèi)。

為了進(jìn)一步精細(xì)定位主效區(qū)間，本研究在第3 區(qū)間利用新開發(fā)的8 個共顯性InDel 標(biāo)記對102 個株系的RIL 群體進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果如圖7 所示，有6 種交換類型，共9 個交換單株。第一種交換類型是在Chr04－46 標(biāo)記位置發(fā)生交換，有18RIL117－3 和18RIL119－2 兩個交換單株，但這2 個單株的表型與親本C025 基本一致。第二種交換類型是在Chr04－31之前插入與親本C025 一致片段，在Chr04－38 之后插入與親本中119 一致片段，而在Chr04－31 和Chr04－38 之間插入的雜合片段，其中有一個交換單株18RIL11－3，但是在主莖節(jié)數(shù)表型上有一定的改變，主莖節(jié)數(shù)為12.40 鑒于雙親之間。第三種交換類型是在Chr04－38 之前插入與親本C025 一致片段，在Chr04－46之后插入與親本中119 一致片段，而在Chr04－38 和Chr04－46 之間插入的雜合片段，有一個交換單株18RIL65－2，主莖節(jié)數(shù)表型為14.45。第四種交換類型是在Chr04－33 之前插入與親本C025 一致片段，之后插入與親本中119 一致片段，有兩個交換單株18RIL88－2 和18RIL87－1，主莖節(jié)數(shù)分別為15.23 和16.15。第五種交換類型是在Chr04－38 之前插入與中119 一致片段，之后插入與親本C025 一致片段，有一個交換單株18RIL38－1，主莖節(jié)數(shù)為9.33。第六種交換類型是在Chr04－46 之前插入與中119 一致片段，之后插入與親本C025 一致片段，有兩個交換單株18RIL37－1 和18RIL44－2，主莖節(jié)數(shù)分別為16.71 和16.34。從以上六種交換類型可以看出第三、第四和第六種交換類型的主莖節(jié)數(shù)與親本中119 接近，而第一、第二和第五種交換類型的主莖節(jié)數(shù)與親本C025 較接近。說明Chr04－38 標(biāo)記位點(diǎn)之前插入雙親一致片段表型不會發(fā)生變化，Chr04－46 標(biāo)記位點(diǎn)之前插入雙親一致片段表型也不會發(fā)生變化，而在Chr04－38 和Chr04－46 標(biāo)記之間插入親本中119 或者雜合片段的交換單株表型都會接近中119。因此可以確定將與大豆主莖節(jié)數(shù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)定位于Chr04－38 和Chr04－46 標(biāo)記之間，物理位置為171.9 kb，包含候選基因6 個(表6)。

表6 關(guān)聯(lián)區(qū)間6 個候選基因的注釋信息Table 6 Annotation information of 6 genes in related interval

3 討論

前人對農(nóng)作物農(nóng)藝性狀的定位研究，大多數(shù)利用的是傳統(tǒng)遺傳圖譜定位方法，從而確定與農(nóng)藝性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記[28]。本研究利用的BSA 方法是針對具有明顯極端分化的農(nóng)藝性狀，是一種快速鑒定與目標(biāo)基因(區(qū)間)連鎖分子標(biāo)記的有效方法[29]。但是用BSA 方法結(jié)合常規(guī)遺傳定位會受到DNA 分子(SSR標(biāo)記等)標(biāo)記數(shù)量少的限制[19]，低密度的標(biāo)記會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而高通量測序的發(fā)展，為揭示基因組的遺傳多樣性和加速基因定位以及分離提供了一種全面實(shí)惠的手段。本研究將SLAF-Seq 高通量測序和BSA 方法有效的結(jié)合突破了DNA 標(biāo)記有限的瓶頸，并且也不需要將群體全部基因型分型。目前該手段已經(jīng)應(yīng)用于小麥[30]、水稻[31]、高粱[32]和向日葵[33]等多種植物。本研究利用BSA-SLAF-Seq 方法在大豆中共開發(fā)了1 003 590 個SLAF 標(biāo)簽，鑒定出193 082 個SNP標(biāo)記，均具有較高的數(shù)量和質(zhì)量，并且分布在大豆每條染色體上(圖3)。經(jīng)過過濾后得到可信SNP 位點(diǎn)26 552 個，利用這些SNP 位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析與大豆主莖節(jié)數(shù)相關(guān)區(qū)間。與目前開發(fā)的SSR 標(biāo)記相比，本研究開發(fā)的SNP 位點(diǎn)為后續(xù)關(guān)聯(lián)分析提供了足夠的數(shù)據(jù)。說明SLAF-Seq 技術(shù)是一種高效、高分辨率的定位技術(shù)，具有成功率高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、成本效益高等特點(diǎn)。SLAF-Seq 技術(shù)與BSA 的結(jié)合為鑒定主莖節(jié)數(shù)相關(guān)的基因組區(qū)間提供了一種有效的方法。

近年來，分子標(biāo)記在許多作物育種中得到了廣泛的應(yīng)用[34]。與傳統(tǒng)育種方法相比，分子標(biāo)記輔助育種能夠提高育種效率，加快育種進(jìn)程。因此，開發(fā)與目標(biāo)基因(基因區(qū)間)緊密連鎖的標(biāo)記對育種具有重要意義。InDel 分子標(biāo)記被認(rèn)為是一種適應(yīng)性強(qiáng)、高效、穩(wěn)定且成本低易于普及應(yīng)用的標(biāo)記。本研究利用BSASLAF-Seq 方法確定了在4 號染色體上與大豆主莖節(jié)數(shù)相關(guān)的5 個區(qū)間，總長度為1.66 Mb，且該區(qū)間包含120 個基因(表5)。依據(jù)雙親的重測序信息，開發(fā)InDel 分子標(biāo)記并加密候選關(guān)聯(lián)區(qū)間，并精細(xì)定位大豆主莖節(jié)數(shù)。首先利用關(guān)聯(lián)區(qū)間新開發(fā)的InDel 分子標(biāo)記在F2群體掃描與主莖節(jié)數(shù)相關(guān)的QTL，結(jié)果在第三關(guān)聯(lián)區(qū)間檢測到一個峰值相關(guān)性較高的與主莖節(jié)數(shù)相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，由最初的1.66 Mb 縮小到0.45 Mb。為了更進(jìn)一步精細(xì)定位主效區(qū)間，本研究利用主效區(qū)間新開發(fā)的Indel 標(biāo)記，進(jìn)一步通過對RIL 群體全部株系進(jìn)行基因分型，最終篩選到9 個交換單株/系，將主效區(qū)間分為6 種交換類型，將大豆主莖節(jié)數(shù)精細(xì)定位到InDel 標(biāo)記Chr04－38 和Chr04－46 之間，其候選區(qū)間只有171.9 kb，包含6 個基因(表6)。然而將本研究結(jié)果與前人通過連鎖定位研究主莖節(jié)數(shù)QTL 位點(diǎn)相比較發(fā)現(xiàn)，4 號、6 號和19 號染色體與大豆主莖節(jié)數(shù)和株高相關(guān)的QTL 位點(diǎn)較多[35]，且Chang 等[36]研究發(fā)現(xiàn)大豆主莖節(jié)數(shù)與大豆分枝數(shù)存在顯著的正相關(guān)，因此同一個QTL 位點(diǎn)有可能存在多效性。如Li等[37]研究發(fā)現(xiàn)大豆株高QTL-qPH-C1－3 和主莖節(jié)數(shù)QTL- qMS-C1－1 同時位于4 號染色體(50.35～52.38 Mb)且位置有部分重疊，并且這個位置與本研究主效位點(diǎn)比較接近，該位點(diǎn)在多個研究中都有重疊，說明4號染色體末端是一個調(diào)控大豆生長和發(fā)育的熱點(diǎn)[38]。但是不同研究同樣提出大豆主莖節(jié)數(shù)和株高的遺傳機(jī)制也存在差異，有些位點(diǎn)單獨(dú)調(diào)控株高，而有些位點(diǎn)單獨(dú)調(diào)控主莖節(jié)數(shù)，說明調(diào)控大豆主莖節(jié)數(shù)和株高的遺傳機(jī)制相似但又存在一定差異[37]。

4 結(jié)論

本研究利用SLAF-Seq 技術(shù)與BSA 結(jié)合的方法鑒定與大豆主莖節(jié)數(shù)緊密關(guān)聯(lián)的區(qū)間，同時利用關(guān)聯(lián)區(qū)間的InDel 標(biāo)記將與大豆主莖節(jié)數(shù)位點(diǎn)精細(xì)定位到171.9 kb 區(qū)間內(nèi)，包含6 個候選基因，實(shí)現(xiàn)了大豆主莖節(jié)數(shù)的主效位點(diǎn)精細(xì)定位。本研究開發(fā)InDel 分子標(biāo)記Chr04－38 和Chr04－46 是與大豆主莖節(jié)數(shù)緊密相關(guān)，這兩個標(biāo)記為大豆主莖節(jié)數(shù)分子標(biāo)記輔助育種以及后期的功能評估具有一定的應(yīng)用價值。后期對該區(qū)間6 個候選基因進(jìn)一步深入研究，將為大豆主莖節(jié)數(shù)基因克隆以及功能研究奠定分子基礎(chǔ)。