葉酸代謝通路基因在肝癌中的表達(dá)及意義

孫文文 張凌云

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，其中最主要的組織學(xué)類型的是肝細(xì)胞癌。肝臟是人體最重要的消化器官之一，是包括糖類、蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì)的代謝場(chǎng)所。葉酸是一種人體必需的B族維生素，它在人體中經(jīng)過轉(zhuǎn)化變成四氫葉酸，而四氫葉酸能夠攜帶一碳單位參與核苷酸和脫氧核苷核酸的合成，可見葉酸在保持基因組穩(wěn)定方面具有重要作用。分析葉酸代謝通路發(fā)現(xiàn)，甲硫氨酸合成酶(MTR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、亞甲基四氫葉酸脫氫酶1(MTHFD1)、MTHFD2、線粒體系氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶1(SHMT1)和SHMT2在葉酸代謝中起著重要的作用。本研究主要通過生物信息學(xué)分析的方法，分析上述6種葉酸代謝通路的關(guān)鍵基因在肝癌組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，研究其與臨床預(yù)后、免疫調(diào)控之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究葉酸代謝在肝癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的意義提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、在線數(shù)據(jù)庫基因表達(dá)水平分析

Oncomine數(shù)據(jù)庫(www.oncomine.org)和基因表達(dá)譜分析(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)對(duì)葉酸代謝通路的關(guān)鍵基因在人肝癌組織及正常肝組織中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析比較。以P<0.05、差異倍數(shù)>1.5倍為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、GEPIA預(yù)后分析

采用在線工具Kaplan-Meier生存曲線(www.kmplot.com)和GEPIA評(píng)估葉酸代謝通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的預(yù)后價(jià)值。

二、基因改變頻率分析

采用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(http://www.cbioportal.org)分析肝癌患者中葉酸代謝通路關(guān)鍵基因改變的情況。

三、生物信息學(xué)分析

STRING(https://string-db.org/)和GeneMANIA(http://www.genemania.org)中分析葉酸代謝通路關(guān)鍵基因與其他基因或蛋白間的互作關(guān)系。

四、免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性分析

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫中分析葉酸代謝通路關(guān)鍵基因在肝癌中與免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

結(jié) 果

一、葉酸代謝通路相關(guān)基因在肝癌組織中的表達(dá)

采用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析葉酸代謝通路關(guān)鍵基因(MTR、MTHFR、MTHFD1、MTHFD2、SHMT1和SHMT2)在人肝癌組織與正常肝組織中的表達(dá)。在肝癌組織中MTR的mRNA表達(dá)水平是肝臟正常組織的2倍，肝癌組織中MTHFD2的mRNA表達(dá)水平是肝臟正常組織的1.6倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫對(duì)這些基因進(jìn)行分析，其表達(dá)趨勢(shì)與Oncomine數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)基本一致，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。

圖1 葉酸代謝關(guān)鍵基因在Oncomines和GEPIA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)

二、葉酸代謝通路關(guān)鍵基因的改變

cBioPortal數(shù)據(jù)庫中分析肝癌中葉酸代謝關(guān)鍵基因的改變，結(jié)果顯示基因改變主要包括基因擴(kuò)增、缺失突變和錯(cuò)義突變。MTR、MTHFR、MTHFD1、SHMT1和SHMT2均存在基因擴(kuò)增改變，基因缺失突變也是MTHFR和SHMT1常出現(xiàn)的基因變異，其中MTR中存在8%的基因突變。除SHMT1外，這些葉酸代謝基因均存在不同程度的錯(cuò)義突變(圖2)

三、葉酸代謝通路關(guān)鍵基因在肝癌預(yù)后中的價(jià)值

Kaplan-Meier生存分析顯示，MTHFR的高表達(dá)與肝癌預(yù)后不良相關(guān)(HR=1.49，P=0.04)；而MTHFD1和SHMT1的高表達(dá)則表示肝癌患者的預(yù)后良好(HR=0.63，P=0.008 9和HR=0.52，P=0.000 31；圖3A)。MTHFD2和SHMT1的高表達(dá)均與肝癌患者的無病進(jìn)展期呈正相關(guān)(HR=0.72，P=0.028和HR=0.53，P=1.9e-05；圖3B)。在進(jìn)一步對(duì)葉酸代謝基因與肝癌患者不同病理分期相關(guān)性分析中，發(fā)現(xiàn)SHMT1與肝癌患者臨床分期相關(guān)，其表達(dá)水平在不同的肝癌分期中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 415；圖3C)，而其他基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、葉酸代謝通路關(guān)鍵基因的互作圖

在STRING(圖4A)和GeneMANIA(圖4B)數(shù)據(jù)庫中分析葉酸代謝通路基因之間的相互作用關(guān)聯(lián)圖，可見除了各基因之間相互作用外，還與其他很多基因存在關(guān)聯(lián)。在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)葉酸代謝通路關(guān)鍵基因與ATIC基因存在相互作用。

圖2 葉酸代謝關(guān)鍵基因在肝癌中的基因改變

A：總生存期；B：無疾病進(jìn)展期；C：臨床分期圖3 葉酸代謝關(guān)鍵基因表達(dá)與肝癌患者臨床資料的相關(guān)性分析

圖4 葉酸代謝通路關(guān)鍵基因的分子互作圖

五、葉酸代謝通路與機(jī)體免疫系統(tǒng)的關(guān)系

肝癌是一種與機(jī)體免疫系統(tǒng)息息相關(guān)的惡性腫瘤，通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析了葉酸代謝通路與機(jī)體免疫的關(guān)系。MTHFR在肝癌中的表達(dá)與B細(xì)胞(Cor=0.1558,P=4.02e-03)、CD8+T淋巴細(xì)胞(Cor=0.121,P=2.58e-02)、CD4+T淋巴細(xì)胞(Cor=0.343,P=6.44e-11)、巨噬細(xì)胞(Cor=0.302,P=1.32e-08)、中性粒細(xì)胞(Cor=0.371,P=1.04e-12)和樹突狀細(xì)胞(Cor=0.317,P=2.25e-09)的浸潤呈正相關(guān)；MTHFD2的表達(dá)與B細(xì)胞(Cor=0.466,P=6.06e-20)、CD8+T淋巴細(xì)胞(Cor=0.515,P=1.34e-24)、CD4+T淋巴細(xì)胞(Cor=0.501,P=2.66e-23)、巨噬細(xì)胞(Cor=0.608,P=7.33e-36)、中性粒細(xì)胞(Cor=0.513,P=1.41e-24)和樹突狀細(xì)胞(Cor=0.672,P=4.64e-46)的浸潤也呈正相關(guān)(P<0.05)但并未發(fā)現(xiàn)其他葉酸代謝通路基因與機(jī)體免疫浸潤細(xì)胞之間的相關(guān)性(圖5)。

討 論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥致死率中位于第五位[1]，在中國的癌癥致死率中位于第四位[2]。葉酸為DNA合成提供嘌呤和胸苷，有研究顯示葉酸缺乏或代謝障礙與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)[3]。肝臟本身是儲(chǔ)存葉酸的主要器官，所以葉酸代謝通路的異常更有可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文主要對(duì)葉酸代謝通路的關(guān)鍵基因(MTR、MTHFR、MTHFD1、MTHFD2、SHMT1和SHMT2)在肝癌中的表達(dá)、基因突變類型以及對(duì)肝癌患者預(yù)后、免疫相關(guān)性等方面進(jìn)行研究。

MTR是體內(nèi)唯一能轉(zhuǎn)化5-甲基四氫葉酸的酶，有研究顯示MTR基因的錯(cuò)義突變可從翻譯水平抑制MTR的表達(dá)[4]，導(dǎo)致MTR表達(dá)量的降低，造成DNA的低甲基化，參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中MTR基因的改變主要為基因擴(kuò)增和錯(cuò)義突變，而其表達(dá)量與肝癌患者的總生存期、無疾病進(jìn)展期等并無顯著相關(guān)性。通過這些數(shù)據(jù)可以推斷出MTR在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用可能與該基因的功能缺失有關(guān)，其表達(dá)量的增加可能并不會(huì)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。

MTHFR基因突變是引起該酶活性缺乏和降低的主要機(jī)制[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌中MTHFR基因的改變主要為缺失突變，且肝癌組織中MTHFR的相對(duì)低表達(dá)與肝癌患者的生存期延長(zhǎng)存在顯著相關(guān)性。另外，MTHFR與多種免疫細(xì)胞浸潤存在顯著相關(guān)性，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，說明MTHFR與肝癌患者的免疫微環(huán)境調(diào)控相關(guān)，也說明葉酸代謝通路在某種層面上參與機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控。

有數(shù)據(jù)表明，MTHFD2蛋白在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)[7]，這與本研究數(shù)據(jù)一致。但也有研究顯示癌組織中MTHFD1[8]和MTHFD2[7]的高表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)顯示MTHFD1的高表達(dá)與肝癌患者的總生存期存在正相關(guān)，MTHFD2與和肝癌患者的無疾病進(jìn)展期呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)之間的差異可能需要通過進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來校正。在MTHFD與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性分析中，發(fā)現(xiàn)MTHFD2與多種免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)，同MTHFR影響免疫細(xì)胞浸潤一起，這些數(shù)據(jù)表明葉酸代謝通路與機(jī)體免疫相關(guān)，提示針對(duì)肝癌的免疫治療如若聯(lián)合靶向葉酸代謝通路的藥物，可能會(huì)起到更優(yōu)的治療效果。

圖5 葉酸代謝通路關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析

SHMT包括SHMT1和SHMT2，SHMT2在多種腫瘤中高表達(dá)，抑制SHMT2的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)SHMT1在肝癌中多為基因擴(kuò)增和缺失突變，SHMT2多表現(xiàn)為基因擴(kuò)增及錯(cuò)義突變，提示肝癌中SHMT除了表達(dá)量的改變會(huì)影響肝癌的惡性生物學(xué)行為外，其基因功能的缺失也可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。

通過在線數(shù)據(jù)庫對(duì)這些基因進(jìn)行基因或蛋白質(zhì)互作分析，在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)與異硫氰酸烯丙酯(AITC)基因存在相互關(guān)聯(lián)。研究顯示AITC參與腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，與腫瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)[11]。AITC有抗細(xì)胞增殖、抗血管新生的作用，能通過影響巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)[12-14]。可以推斷，葉酸代謝通路基因可與AITC相互作用，影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上，葉酸代謝通路的關(guān)鍵基因在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，肝癌患者中這些基因的改變除了影響葉酸代謝通路的調(diào)控以外，還能夠通過影響人體的免疫微環(huán)境，以及與其他基因及代謝通路一起參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。