水牛熱休克蛋白70基因克隆及其表達分析

湯玉燕，姚順，濮黎萍，趙秀玲，陳東榮，張鵬飛，張明

摘要：【目的】克隆水牛熱休克蛋白70基因（HSP70）并進行生物信息學分析，同時明確HSP70基因在水牛成熟卵母細胞（MII期）和2-細胞期胚胎中的表達情況，為研究HSP70在水牛卵母細胞成熟及著床前早期胚胎發(fā)育中的作用機理提供理論依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)NCBI已公布的水牛HSP70基因mRNA預測序列（MH814759.1）設計引物，通過RT-PCR克隆水牛HSP70基因，運用DNAStar、MEGA 7.0、TMHMM 2.0及SignalP 4.1 Server等在線軟件進行生物信息學分析;同時采用細胞免疫熒光分析HSP70在水牛成熟卵母細胞及2-細胞期胚胎中的表達情況?！窘Y果】水牛HSP70基因編碼區(qū)（CDS）長度為1926 bp，共編碼641個氨基酸殘基?？寺～@得的水牛HSP70基因序列與NCBI已公布水牛HSP70基因mRNA預測序列（MH814759.1）的相似性高達97.7%;與牛、家犬、山羊、小鼠、綿羊和大鼠的HSP70基因序列具有較高的相似性，其中與牛的相似性高達99.1%。基于HSP70基因核苷酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也顯示，水牛與牛的親緣關系最近。水牛HSP70分子量為70.27 kD，分子式為C3088H4967N8670972S15，理論等電點（pI）為5.67，不穩(wěn)定系數(shù)為32.84，屬于穩(wěn)定蛋白;不存在跨膜結構及信號肽，主要定位于細胞質（60.9%）、細胞核（30.4%）及線粒體（8.7%），其親水性較強;水牛HSP70蛋白結構以α-螺旋和β-折疊為主。HSP70在水牛成熟卵母細胞及2-細胞期胚胎中均有表達，且主要集中在細胞質?！窘Y論】水牛HSP70基因在進化過程中具有高度的保守性，在水牛成熟卵母細胞和 著床前早期胚胎中均有表達，且主要集中在細胞質，屬于結構型HSP70。

關鍵詞： 水牛;熱休克蛋白70（HSP70）;基因克隆;表達分析;細胞質

中圖分類號： S823.83? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）09-2599-09

Cloning and expression analysis of buffalo heat

shock protein 70 gene

TANG Yu-yan， YAO Shun， PU Li-ping， ZHAO Xiu-ling， CHEN Dong-rong，

ZHANG Peng-fei， ZHANG Ming*

（Animal Reproduction Institute/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangxi University， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】The heat shock protein 70 gene of buffalo（HSP70） was cloned and analyzed by bioinformatics.Meanwhile， its expression was analyzed in buffalo mature oocytes（MII stage） and 2-cell stage embryos， which provided a theoretical basis for studying the mechanism of HSP70 in the maturation of oocytes and pre-implantation embryos development. 【Method】Primer was designed according to the published mRNA sequence of buffalo gene HSP70（MH814759.1） in GenBank. Bioinformatics analysis was performed using online software such as DNAStar， MEGA 7.0， TMHMM 2.0， and SignalP 4.1 Server. Meanwhile， the immunofluorescence assay was used to detect the expression of HSP70 in mature oocytes and 2-cell stage embryos. 【Result】The coding region（CDS） of buffalo gene HSP70 was 1926 bp，and 641 amino acids were encoded. The cloned buffalo gene HSP70 had 97.7% homology with the published buffalo HSP70 mRNA prediction sequence（MH814759.1）. And it had high homology with that of Bos taurus， Canis lupus familiaris， Capra hircus， Mus musculus， Ovis ariesis， Rattus norvegicus， among which the homology of B. taurus was as high as 99.1%. The phylogenetic tree based on the similarity of the nucleotide sequence of? HSP70 also showed that the relationship between the buffalo and the B. taurus was the closest. The molecular weight of buffalo HSP70 was 70.27 kD， molecular formula was C3088H4967N8670972S15，the theoretical isoelectirc point （pI） was 5.67， which showed the HSP70 belonged to stabilized protein （instability index was 32.84）. There was no transmembrane structure and signal peptide， mainly located in the cytoplasm （60.9%）， nucleus（30.4%） and mitochondria（8.7%）， and its hydrophilicity was strong. The structure of buffalo HSP70 protein was mainly α-helix and β-sheet. HSP70 was expressed in buffalo MII oocytes and 2-cell stage embryos， and was mainly concentrated in the cytoplasm. 【Conclusion】The buffalo gene HSP70 is highly conserved du-ring the evolution process. It is expressed in mature buffalo oocytes and early embryos before implantation， and is mainly concentrated in the cytoplasm. It belongs to structural HSP70.

Key words： buffalo; heat shock protein 70（HSP70）; gene cloning; expression analysis; cytoplasm

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960660）; Guangxi Natural Science Foundation （2018GXNSFAA294144）;Open Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources（SKLCUSA-b201914）

0 引言

【研究意義】近年來，針對動物抵抗熱應激反應方面的研究主要集中于熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）。HSP能促使細胞適應環(huán)境的逐漸變化，在環(huán)境應激適應和熱平衡中發(fā)揮關鍵作用，同時在細胞穩(wěn)態(tài)及信號轉導中扮演重要角色（S?rensen et al.，2003;黃建芳等，2015;祁磊等，2019）。熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）是一種應激蛋白，是HSP家族中功能最重要、結構最保守以及對應激條件最敏感的一員（陳強等，2007;李小紅等，2017）。HSP70高度保守，不同來源的HSP70氨基酸序列具有很高的相似性（50%～90%）（姜忠玲，2006;牛楊莉等，2019），且具有分子伴侶、抗細胞凋亡、刺激自身免疫反應及參與炎癥反應等生物學功能。作為分子伴侶，HSP70可與新生肽鏈結合，促進肽鏈折疊，完成蛋白跨膜運輸，通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin proteasome system，UPS）或溶酶體介導的自噬，將錯誤折疊的蛋白傳遞至降解部位進行降解（da Silva and Borges，2011），在保護細胞免受熱應激及受損蛋白的清除過程中發(fā)揮作用（Parsell and Lindquist，1993）。HSP70還能與核受體、激酶和轉錄因子發(fā)生短暫結合，而調(diào)控這些因子的生物活性（Mayer and Bukau，2005）。此外，在胚胎發(fā)育過程中需要HSP70發(fā)揮分子伴侶功能及對細胞凋亡進行調(diào)控（Baehrecke，2002）。因此，開展水牛HSP70基因克隆及其表達規(guī)律研究，對揭示水牛卵母細胞成熟及著床前胚胎發(fā)育機理具有重要意義。【前人研究進展】Ritossa（1962）將果蠅幼蟲置于32 ℃高溫環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)果蠅唾液腺染色體上有明顯的膨突，表明此處的基因較一般基因更易轉錄。在此基礎上，Ritossa等（1974）通過SDS-PAGE分離獲得由熱應激反應產(chǎn)生的一組新蛋白質，并命名為熱休克蛋白（HSP）。由于對細胞產(chǎn)生損害的各種化學和物理因素均能促使HSP產(chǎn)生或增加，因此又被稱為應激蛋白。吳偉忠等（2000）利用蛋白層析法從熱休克處理的小鼠肝癌H22細胞中分離出高純度的HSP70，以其免疫小鼠具有抗肝癌作用。金歡勝等（2005）采用RT-PCR成功克隆出小鼠HSP70基因（1990 bp），并通過構建真核表達重組質粒HSP70/pAAV-MCS成功表達出融合蛋白HSP70，為深入研究HSP70在腎臟缺血預適應的作用及其機制打下了基礎。劉波等（2011）通過對吉福羅非魚進行急性冷刺激試驗，結果發(fā)現(xiàn)其肝臟內(nèi)的HSP70基因表達水平明顯上調(diào)。至今，有關HSP70與疾病相關性的研究越來越多，如血漿中的HSP70水平與動脈粥樣硬化嚴重程度存在直接聯(lián)系（Xie et al.，2016），與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和胃癌的發(fā)生也密切相關（Morii et al.，2010）。吳庚香等（2015）通過免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)，患多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）大鼠卵巢中的HSP70表達水平較正常大鼠顯著提高，且主要表達于卵泡膜細胞和顆粒細胞中。沈愛群等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜細胞與HSP70共培養(yǎng)后，上皮細胞標志物和HSP70表達水平顯著降低，而間皮細胞標志物和HSP70表達水平明顯上升，說明HSP70對子宮內(nèi)膜細胞上皮間質化有促進作用，有利于異位內(nèi)膜細胞種植轉移。Witkin等（2017）研究證實，卵巢受氧化應激、無菌性炎癥等過度刺激或將其暴露在環(huán)境毒素中均會引起卵巢內(nèi)HSP70表達水平上升，進而抑制自噬，提高卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）和妊娠并發(fā)癥發(fā)生的可能性?！颈狙芯壳腥朦c】水牛是熱帶亞熱帶地區(qū)主要的畜牧資源，相對于其他牛種更適應于高溫高濕的環(huán)境，但在此環(huán)境下水牛的泌乳、發(fā)情和受胎等生理功能也會受到一定程度的影響，尤其是隨著全球氣候變暖，提高水牛的耐高溫性能已成為主要育種目標之一。目前，有關牛源HSP70基因及其功能的研究主要以荷斯坦奶牛為對象，而針對水牛的相關研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】利用RT-PCR克隆水牛HSP70基因，通過在線軟件進行生物信息學分析，同時明確HSP70基因在水牛成熟卵母細胞（MII期）和2-細胞期胚胎中的表達情況，為研究HSP70在水牛卵母細胞成熟及著床前早期胚胎發(fā)育中的作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

水牛卵巢取自廣西南寧市肉聯(lián)食品屠宰場。TRIzol購自美國Invitrogen公司，PrimeScriptTM RT rea-gent Kit with gDNA Eraser、2×Taq PCR Master Mix、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞及膠回收試劑盒等購自TaKaRa公司，其他生化試劑均為進口分析純。

1. 2 引物設計與合成

根據(jù)NCBI已公布的水牛HSP70基因mRNA預測序列（MH814759.1），通過Primer 5.0設計上、下游引物（5'-GAAGCTCATCTCGGAGCCGAA-3'和5'-TGGCTGATGAAAGGCAGATA-3'），并委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1. 3 總RNA提取

采用TRIzol法提取水牛卵巢組織總RNA：剪碎水牛卵巢組織加入適量液氮研磨成細小的白色粉末，加入1 mL TRIzol，上下顛倒混勻，室溫靜置5 min后4 ℃下12000×g離心5 min，取上清液，加入200.0 μL氯仿，用力振蕩15 s，室溫靜置5 min，自然分層;4 ℃下12000×g離心15 min，取上層水相500.0 μL，加入500.0 μL異丙醇，搖勻，室溫放置10 min;4 ℃下12000×g離心10 min，可見RNA沉淀;棄上清液，加入1 mL預冷75%乙醇;4 ℃下12000×g離心5 min，棄上清液，干燥乙醇，加入30.0 μL DEPC水溶解RNA沉淀;紫外分光光度計檢測總RNA含量及其完整性， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 反轉錄合成cDNA

去除基因組DNA，反應體系10.0 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，總RNA 1.0 μg，RNase Free dH2O 6.0 μL;反應條件：42 ℃ 2 min。反轉錄體系20.0 μL：5×Fastking-RT Super Mix 4.0 μL，RNA模板5.0 μL，RNase Free ddH2O 11.0 μL;反轉錄程序：42 ℃ 15 min，85 ℃ 3 min。

1. 5 PCR擴增

PCR擴增反應體系25.0 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序：98 ℃預變性3 min;98 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1. 6 PCR產(chǎn)物連接及測序分析

依照膠回收試劑盒說明回收并純化1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離的目的片段，然后與pMD18-T載體連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞，將菌液涂布至固體LB培養(yǎng)基（Amp抗性）上，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取單克隆菌斑進行菌液PCR鑒定，陽性菌液送至深圳華大基因科技有限公司測序。

1. 7 生物信息學分析

使用在線軟件對克隆獲得的水牛HSP70基因序列進行同源比對分析及構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并預測其編碼蛋白結構、親/疏水性、亞細胞定位及信號肽，具體生物信息學分析軟件見表1。

1. 8 細胞免疫熒光分析

水牛成熟期卵母細胞及2-細胞期胚胎參照濮黎萍等（2017）的方法獲得，然后以PBS將成熟卵母細胞及2-細胞期胚胎洗滌3次;在4%多聚甲醛中固定30 min，PBS洗滌3次;用1% Triton X-100通透細胞膜20 min，PBS洗滌3次，用1% BSA封閉1 h;加入一抗（Anti-Hsp70抗體[3A3]，貨號AB5439，含1% BSA的PBS，1∶200）后4 ℃孵育12 h，PBS洗滌3次，每次2 min;加入二抗（山羊抗小鼠IgG H&L，Alexa Fluor? 647，貨號AB15011，含1% BSA的PBS，1∶500）室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，每次2 min;以抗熒光淬滅劑（含DAPI）進行封片，置于熒光顯微鏡下檢測拍照，以檢測HSP70在水牛成熟卵母細胞及2-細胞期胚胎中的表達情況。同時以含1% BSA的PBS代替一抗設為對照組。

2 結果與分析

2. 1 水牛HSP70基因克隆及測序結果

以1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)在2000 bp處附近出現(xiàn)與預期結果相符的清晰條帶（圖1）。經(jīng)菌液PCR鑒定，同樣得到約2000 bp的特異性條帶，即初步判定為陽性克隆。測序結果顯示，克隆獲得的目的基因片段為2054 bp，其中編碼區(qū)（CDS）長度為1926 bp。

2. 2 同源比對分析結果

將克隆獲得的目的基因序列與水牛HSP70基因mRNA預測序列（MH814759.1）進行BLAST比對分析，結果發(fā)現(xiàn)二者的相似性達97.7%;與其他物種的HSP70基因核苷酸序列進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因序列與牛（Bos taurus，MN636872.1）、家犬（Canis lupus familiaris，NM_001003 067.2）、山羊（Capra hircus，JN604433.1）、小鼠（Mus musculus，EF100780.1）、綿羊（Ovis aries，JN604434.1）和大鼠（Ruttus norvegicus，L16764.1）的HSP70基因核苷酸序列具有較高的相似性（圖2），其中與牛的相似性高達99.1%，與野豬（Sus scrofa，NM_00112 3127.1）的相似性也有49.6%，說明HSP70基因在物種間高度保守。利用MEGA 7.0構建基于HSP70基因核苷酸序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果（圖3）也顯示，水牛與牛的親緣關系最近，其次是山羊、綿羊和家犬，而與野豬的親緣關系相對較遠。

2. 3 HSP70蛋白理化性質及其結構預測分析結果

2. 3. 1 水牛HSP70蛋白基本理化性質 將克隆獲得的水牛HSP70基因序列利用ORF Finder翻譯成相應的氨基酸序列，結果發(fā)現(xiàn)其共編碼641個氨基酸殘基（圖4）。ProtParam預測結果顯示，水牛HSP70分子量為70.27 kD，分子式為C3088H4967N8670972S15，理論等電點（pI）為5.67，不穩(wěn)定系數(shù)為32.84，屬于穩(wěn)定蛋白，含92個負電荷氨基酸[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]及83個正電荷氨基酸[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]，其中丙氨酸（Alu）和高氨酸（Leu）含量較高，分別占8.9%和7.8%。

2. 3. 2 水牛HSP70蛋白跨膜性、信號肽、亞細胞定位及親/疏水性預測結果 利用TMHMM 2.0進行蛋白跨膜性預測，結果發(fā)現(xiàn)水牛HSP70蛋白不包含跨膜結構，不屬于跨膜蛋白（圖5）。SignalP 4.1 Server預測結果顯示，水牛HSP70蛋白不存在信號肽，即不屬于分泌蛋白，在細胞內(nèi)不進行跨膜運輸（圖6）。采用PSORTⅡ對水牛HSP70蛋白亞細胞定位情況進行預測，結果顯示該蛋白主要定位于細胞質（60.9%）、細胞核（30.4%）及線粒體（8.7%）。以ProtScale預測水牛HSP70蛋白親/疏水性，發(fā)現(xiàn)該蛋白親水性較強（圖7）。

2. 3. 3 水牛HSP70蛋白結構 利用DNAStar Pro-tean對水牛HSP70蛋白進行二級結構預測，結果發(fā)現(xiàn)其二級結構含有26個α-螺旋、38個β-折疊、24個β-轉角及28個無規(guī)則卷曲，以α-螺旋和β-折疊為主（圖8）。利用SWISS-MODEL進行同源建模預測水牛HSP70蛋白三級結構，同樣發(fā)現(xiàn)該蛋白含有較多的α-螺旋和β-折疊結構（圖9），與其二級結構預測結果一致。

2. 4 HSP70在水牛成熟卵母細胞及2-細胞期胚胎中的表達情況

采用細胞免疫熒光檢測HSP70在水牛成熟卵母細胞及2-細胞期胚胎中的表達情況，結果顯示， HSP70在水牛成熟卵母細胞及早期胚胎中均有表達，且主要集中在細胞質（圖10）。

3 討論

HSP70家族主要包括4類蛋白：（1）誘導型HSP70，主要存在于細胞核中，細胞受到應激后迅速大量產(chǎn)生;（2）結構型HSP70，存在于細胞漿中，為組成型表達，屬于結構蛋白，其表達量與應激反應相關性不明顯;（3）葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78，位于內(nèi)質網(wǎng)中，在應激狀態(tài)下略有表達;（4）葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75，主要位于線粒體中，其表達量受細胞能量代謝的影響。HSP70作為一種重要的分子伴侶，在蛋白折疊、解聚及降解中發(fā)揮重要作用（Zuiderweg et al.，2017），尤其在多種共伴侶蛋白如HSP40s的輔助下，能促進底物由HSP70轉移至HSP90（Alvira et al.，2014），通過蛋白協(xié)同作用催化錯誤折疊的多肽展開，從而促使多肽自發(fā)重折疊（Luengo et al.，2018）。HSP70在抗細胞凋亡中也扮演重要角色，對胚胎發(fā)生、發(fā)育及維持細胞穩(wěn)態(tài)至關重要（Baehrecke，2002）。在細胞凋亡信號傳導過程中，高表達的HSP70直接或間接調(diào)節(jié)內(nèi)源（線粒體依賴）和外源（死亡受體）的凋亡途徑，HSP70基因敲低可促進細胞凋亡（Kumar et al.，2016）。

水牛具有適應性和抗病力強、耐高溫高濕、耐粗飼、易飼養(yǎng)及使用年限長等生物學特性，但其繁殖力較低，限制了其產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。在熱帶亞熱帶地區(qū)，夏季常出現(xiàn)35 ℃以上的高溫高濕天氣，高溫高濕會引起水牛熱應激，進而通過誘導氧化應激、促使細胞凋亡及阻礙細胞有絲分裂等機理抑制早期胚胎發(fā)育（屈平平等，2015）。因此，提高水牛耐熱性是水牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的重大問題，而研究抵抗熱應激相關基因對促進水牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。HSP70基因可作為荷斯坦奶牛耐熱性能和乳腺炎抗性等的評估指標（陳強等，2007;程維杰等，2008;梁學武等，2009），但至今在水牛中鮮有報道。本研究成功克隆獲得水牛HSP70基因CDS序列，并運用DNAStar、MEGA 7.0、TMHMM 2.0及SignalP 4.1 Server等在線軟件進行生物信息學分析，結果發(fā)現(xiàn)水牛HSP70基因序列與牛、家犬、山羊、小鼠、綿羊和大鼠的HSP70基因序列具有較高的相似性，其中與牛的相似性高達99.1%，說明不同物種間的HSP70基因較保守;基于HSP70基因核苷酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也顯示，水牛與牛的親緣關系最近，而與野豬的親緣關系相對較遠，種屬差異性較高，符合物種進化論學說，也說明HSP70基因具有種屬特異性。此外，本研究通過細胞免疫熒光分析HSP70在水牛成熟卵母細胞及2-細胞期胚胎中的表達情況，結果表明，HSP70在水牛成熟卵母細胞及2-細胞期胚胎中均有表達，且主要集中在細胞質，綜合其亞細胞定位分析結果，可判定為結構型HSP70，但其具體功能還有待進一步探究。

4 結論

水牛HSP70基因在進化過程中具有高度的保守性，在水牛成熟卵母細胞和著床前早期胚胎中均有表達，且主要集中在細胞質，屬于結構型HSP70。

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（責任編輯 蘭宗寶）