Ⅱ型鯉皰疹病毒ORF6多克隆抗體的制備與鑒定

南星羽，馮梓釗，費(fèi)越越，余路，羅揚(yáng)，許丹

摘要：【目的】制備Ⅱ型鯉皰疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗體，為深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潛伏感染過(guò)程中的作用機(jī)制提供技術(shù)支持?！痉椒ā坷肕EGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在線軟件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息，采用PCR從CyHV-2基因組中擴(kuò)增ORF6基因片段，將其連接至原核表達(dá)載體pET-28a后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和尿素洗滌純化獲得融合蛋白。以純化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制備ORF6多克隆抗體，并通過(guò)Western blotting和間接免疫熒光技術(shù)鑒定ORF6多克隆抗體的特異性?！窘Y(jié)果】CyHV-2的ORF6基因全長(zhǎng)3003 bp，與CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%，其中與CyHV-3的相似性高達(dá)39.36%;其抗原表位最可能存在于第1～300位氨基酸序列中。將PCR擴(kuò)增獲得的ORF6基因片段連接至原核表達(dá)載體pET-28a可成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h即獲得融合蛋白ORF6;原核表達(dá)的融合蛋白ORF6主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)，其分子量為17.13 kD，經(jīng)6 mol/L尿素洗滌純化后的濃度為0.1 mg/mL。以純化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制備獲得的ORF6多克隆抗體能特異性識(shí)別融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的異育銀鯽尾鰭細(xì)胞（GiCF）;利用制備的ORF6多克隆抗體對(duì)CyHV-2感染GiCF細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光分析，結(jié)果在CyHV-2感染GiCF細(xì)胞周圍能觀察到特異性綠色熒光，而在未感染CyHV-2的GiCF細(xì)胞周圍未觀察到特異性綠色熒光，進(jìn)一步說(shuō)明ORF6多克隆抗體可特異性識(shí)別CyHV-2?！窘Y(jié)論】制備獲得的ORF6多克隆抗體能與CyHV-2感染GiCF細(xì)胞發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，即可用于鑒定CyHV-2感染，為探究ORF6蛋白功能是否與CyHV-2潛伏感染相關(guān)打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： Ⅱ型鯉皰疹病毒（CyHV-2）;ORF6蛋白;潛伏感染;多克隆抗體;間接免疫熒光

中圖分類號(hào)： S941.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）09-2562-10

Preparation and identification of polyclonal antibody

against cyprinid herpesvirus-2 ORF6

NAN Xing-yu， FENG Zi-zhao， FEI Yue-yue， YU Lu， LUO Yang， XU Dan*

（National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals/Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources Aquaculture， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/National Experimental Teaching Demonstration Center

for Fishery Sciences/Shanghai Ocean University， Shanghai? 201306， China）

Abstract：【Objective】The polyclonal antibody of ORF6 of cyprinid herpesvirus-2（CyHV-2） was prepared to provide a technical means for further investigation of the function of ORF6 in CyHV-2 acute infection or a latent infection process.【Method】The ORF6 gene sequenceof CyHV-2 was analyzed by online softwares such as MEGA 6.0， Adobe Illustrator CS6 and BepiPred-2.0. The ORF6 gene was amplified from the CyHV-2 genome by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector PET-28a. The recombinant expression plasmid was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）， after that， expression was induced by IPTG. The recombinant protein was purified by urea method， Babl/chealthy mice were immunized with purified recombinant ORF6 protein， serum was collected to prepare polyclonal antibody against ORF6 protein. Finally， the specificity of antibody was identified by Western blotting and indirect immunofluorescence technique（IFA）. 【Result】The full-length ORF6 gene of CyHV-2 was 3003 bp， and the amino acid sequence similarity with CyHV-3 and ORF6 of CyHV-1 was higher than 30.00%， and the similarity with CyHV-3 was 39.36%. Its antigenic epitope was most likely to exist in amino acid sequences 1-300. ORF6 gene fragment obtained by PCR was ligated to the prokaryotic expression vector pET-28a to construct the recombinant plasmid pET-28a-ORF6， which was transformed into BL21（DE3） competent cells and induced by IPTG for 4 h to obtain the fusion protein ORF6， it was mainly expressed in the form of inclusion bodies， and its molecular weight was 17.13 kD. The concentration of ORF6 purified by 6 mol/L urea washing was 0.1 mg/mL. The ORF6 polyclonal antibody prepared by immunizing Babl/c mice with purified fusion protein ORF6 could specifically recognize the fusion protein ORF6 and the Carassius auratus gibelio caudal fin cell（GiCF） infected by CyHV-2. The prepared ORF6 polyclonal antibody was used for indirect immunofluorescence analysis of GiCF infected with CyHV-2. The results showed that specific green fluorescence could be observed around GiCF infected with CyHV-2， while no specific green fluorescence was observed around GiCF cells not infected with CyHV-2， which further indicated that ORF6 polyclonal antibody could specifically recognize CyHV-2. 【Conclusion】The prepared ORF6 polyclonal antibody can specifically react with CyHV-2 infected GiCF， which can be used to identify CyHV-2 infection， and lay a foundation for later exploration of whether ORF6 protein function is related to CyHV-2 latent infection.

Key words： cyprinid herpesvirus-2（CyHV-2）; ORF6 protein; latent infection; polyclonal antibody; indirect immunofluorescence

Foundation item： “Blue Granary Science and Technology Innovation” of the National Key Research and Development Program of China（2019YFD0900101）

0 引言

【研究意義】Ⅱ型鯉皰疹病毒（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）隸屬于魚皰疹病毒科（Alloherpesviridae）鯉皰疹病毒屬（Cyprinivirus），呈橢圓形，具有囊膜（徐進(jìn)等，2013;趙欣，2016），是引起鯽魚（Carassius auratus）和金魚造血器官壞死?。℉erpesviral haematopoietic necrosis，HVHN）的病原體，具有高傳染性及高死亡率的特點(diǎn)（余琳等，2019）。HVHN自1992年首次在日本金魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)后（Jung and Miyazaki，2010），于1995年由進(jìn)口金魚傳入我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)（Chang et al.，2009），2011—2013年在我國(guó)江蘇、湖北和廣東等鯽魚主要養(yǎng)殖區(qū)大規(guī)模暴發(fā)，給我國(guó)的鯽魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（Doszpoly et al.，2011）。在人工感染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，CyHV-2感染模型分為急性感染和潛伏感染，后者能在鯽魚體內(nèi)長(zhǎng)期存在且不發(fā)病。自然養(yǎng)殖過(guò)程中也存在潛伏感染狀態(tài)，當(dāng)外界環(huán)境尤其是氣溫改變時(shí)，攜帶有病毒的潛伏感染轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙愿腥径┌l(fā)HVHN。因此，亟待開(kāi)展CyHV-2潛伏感染相關(guān)基因的研究，解決前期判斷是否為潛伏感染并進(jìn)行預(yù)防，或采取措施改變其潛伏感染狀態(tài)，以降低HVHN暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CyHV-2的顆粒直徑在100～110 nm，其基因組全長(zhǎng)約290304 bp，共編碼156個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）（Podok et al.，2014;袁銳等，2019）。王璐（2012）對(duì)江蘇地區(qū)的CyHV-2進(jìn)行分類鑒定;晏文巖等（2017）研究發(fā)現(xiàn)CyHV-2的非結(jié)構(gòu)蛋白ORF4可能參與病毒復(fù)制，是病毒復(fù)制感染周期的特征性指示蛋白之一;葉元士等（2017）進(jìn)行CyHV-2全基因組測(cè)序和注釋分析，發(fā)現(xiàn)CyHV-2感染對(duì)異育銀鯽的腸道黏膜組織基因表達(dá)產(chǎn)生影響，尤其對(duì)膽固醇與膽汁酸的合成代謝途徑及膽汁酸腸肝循環(huán)途徑的基因表達(dá)產(chǎn)生明顯影響;高娃等（2020）通過(guò)分析CyHV-2的重要免疫原性蛋白，獲得ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132等8種主要免疫原性蛋白;周瑤佳等（2020）對(duì)CyHV-2感染的病理學(xué)進(jìn)行研究;王姝等（2020）、聞金萱等（2020）分別建立了針對(duì)CyHV-2的快速檢測(cè)法。目前，有關(guān)CyHV-2重要功能基因及病毒致病和潛伏機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，但國(guó)際上對(duì)錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV/CyHV-3）的研究已證實(shí)CyHV-3可在錦鯉中發(fā)生潛伏感染，且通常潛伏在錦鯉的白細(xì)胞中。Reed等（2014，2017）研究表明，CyHV-3的ORF6基因是參與病毒編碼潛伏相關(guān)的基因，且在CyHV-3感染錦鯉的IgM和B細(xì)胞中均能檢測(cè)到ORF6基因，經(jīng)RNA測(cè)序分析證實(shí)是潛伏期表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄物。在國(guó)內(nèi)，劉世超（2012）基于ORF26基因建立了快速檢CyHV-3的Nested-PCR，陳俊杰等（2017）建立了快速鑒別CyHV-3急性感染和潛伏感染的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。CyHV-3的相關(guān)研究對(duì)開(kāi)展CyHV-2研究具有重要啟示作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】CyHV-2與CyHV-3的基因組序列相似性達(dá)81.55%，其中ORF6基因序列的相似性達(dá)39.36%，但ORF6基因與CyHV-2感染模型的相關(guān)性尚未明確，因此開(kāi)展CyHV-2 ORF6基因生物信息學(xué)分析并制備ORF6多克隆抗體對(duì)揭示CyHV-2潛伏感染特征及其與宿主的作用機(jī)制具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白及免疫小鼠制備ORF6多克隆抗體，并采用Western blotting和間接免疫熒光檢驗(yàn)其特異性，為深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潛伏感染過(guò)程中的作用機(jī)制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

CyHV-2由國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)（上海海洋大學(xué)）保存提供（魯建飛，2018）。異育銀鯽尾鰭細(xì)胞（GiCF）由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建獲得（Lu et al.，2018），采用M199完全培養(yǎng)基（含10% FBS）在27 ℃下進(jìn)行傳代培養(yǎng);原核表達(dá)載體pET-28a由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供;病毒提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒及大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑及His標(biāo)簽抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1. 2 生物信息學(xué)分析

根據(jù)GenBank已公布CyHV-2的ORF6基因序列（AKC01966.1），采用MEGA 6.0和Adobe Illustrator CS6對(duì)CyHV-1、CyHV-2和CyHV-3的ORF6基因進(jìn)行同源比對(duì)分析，并以BepiPred-2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）對(duì)其抗原決定簇（抗原表位）進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1. 3 ORF6基因擴(kuò)增

根據(jù)ORF6基因序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（F：5'-CGGGATCCCGTTTCTACGTGCACAGCGCGA G-3';R：5'-GCGAAGCTTGCACATGTTTTCTGAAG GGCAC-3'），并在上、下游引物序列中分別插入BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以CyHV-2感染7 d的GiCF細(xì)胞DNA為模板，進(jìn)行ORF6基因PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 μL，其中2×PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL，上、下游引物（10 nmol/L）各1.0 μL，cDNA模板（CyHV-2感染GiCF細(xì)胞的cDNA模板）1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行純化回收。

1. 4 重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6構(gòu)建及測(cè)序分析

將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-28a分別進(jìn)行雙酶切及連接轉(zhuǎn)化，最后提取重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-ORF6。

1. 5 重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6誘導(dǎo)表達(dá)

將含重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6的菌液涂布至培養(yǎng)基上，挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落，接種至現(xiàn)配的LB液體培養(yǎng)基（Kana+）中，在37 ℃恒溫?fù)u床中（150 r/min）培養(yǎng)3～4 h，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)5 h;4 ℃下8500 r/min離心20 min收集菌體沉淀;PBS清洗2次并重懸，超聲波破碎處理至溶液變澄清，4 ℃下12000 r/min離心20 min收集沉淀和上清液。

1. 5. 1 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件 以重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布至LB/Kana培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。篩選陽(yáng)性克隆，將其接種至LB液體培養(yǎng)基中，室溫?fù)u床過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)的陽(yáng)性細(xì)菌液按1∶100比例轉(zhuǎn)移到配好的LB液體培養(yǎng)基（Kana+）中，在37 ℃恒溫?fù)u床（180 r/min）培養(yǎng)4 h后，分別加入終濃度為0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5 h。采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表達(dá)情況，篩選出最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度。

1. 5. 2 純化融合蛋白 在最佳誘導(dǎo)條件下，大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白;分別以2、4、6、8 mol/L尿素處理沉淀，每步均在4 ℃下8500 r/min離心20 min。然后將融合蛋白依次放入含 6、4、2和0 mol/L尿素的PBS中進(jìn)行透析，每個(gè)濃度透析處理4 h;最后采用試劑盒測(cè)量融合蛋白濃度，確定其純化程度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 6 ORF6多克隆抗體制備

選取20只健康且大小相近的8周齡Babl/c小鼠，以純化的融合蛋白ORF6免疫小鼠（100 μg/只）。首次免疫以弗氏完全佐劑與融合蛋白ORF6等比例乳化;二次免疫在首免20 d后進(jìn)行，以弗氏不完全佐劑與融合蛋白ORF6等比乳化;第三次免疫為純抗原（融合蛋白ORF6）免疫。第三次免疫1周后摘除小鼠眼球取血，37 ℃靜置1 h，4 ℃冰箱保存過(guò)夜。次日4 ℃下5000 r/min離心10 min，收集血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 7 ORF6多克隆抗體特異性評(píng)價(jià)

以純化后的抗原（融合蛋白ORF6）、CyHV-2（蔗糖梯度離心提取純病毒）和CyHV-2處理的GiCF細(xì)胞樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析及Western blotting檢測(cè)。采用電轉(zhuǎn)膜法（100 V，75 min）將樣品轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，20 mL 5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h;經(jīng)一抗（His標(biāo)簽）室溫孵育1 h后，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，其中一抗稀釋度為1∶1000。1×PBST清洗6次，每次5 min。以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗鼠IgG為二抗，稀釋度為1∶5000，室溫封閉2 h，1×PBST清洗6次，每次5 min。將PVDF膜置于二氨基聯(lián)苯胺顯色液中進(jìn)行顯色，直至目的條帶清晰即可。

1. 8 間接免疫熒光分析

傳代培養(yǎng)GiCF細(xì)胞至融合度為90%時(shí)進(jìn)行病毒感染（病毒提取自CyHV-2感染7 d的GiCF細(xì)胞），感染2 h后移除CyHV-2并加入完全培養(yǎng)基（含2% FBS），出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）后以PBS清洗除去病毒;4%多聚甲醛固定10 min，移除固定液，采用0.4% Triton X-100進(jìn)行透化處理，并以PBS清洗除去甲醛;5%脫脂牛奶封閉3 h，PBS清洗除去脫脂牛奶，ORF6多克隆抗體孵育2 h，PBS清洗;加入FITC標(biāo)記兔抗鼠IgG（二抗），PBS清洗后加入DAPI熒光染料，室溫下染色10 min，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。以未感染病毒的GiCF細(xì)胞為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ORF6基因測(cè)序分析結(jié)果

CyHV-2的ORF6基因全長(zhǎng)3003 bp，其編碼蛋白分子量為110.00 kD。依據(jù)ORF6基因核苷酸序列及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，CyHV-2的ORF6蛋白與CyHV-3及CyHV-1的ORF6蛋白相比，均具有一段保守氨基酸結(jié)構(gòu)域（圖1），其氨基酸序列相似性均高于30.00%，其中與CyHV-3的相似性高達(dá)39.36%。

蛋白表面能使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的部位被稱為抗原決定簇（B細(xì)胞表位），通常是由5～8個(gè)氨基酸殘基組成。由于ORF6蛋白全長(zhǎng)抗原表位分布不均，因此有必要對(duì)其抗原決定簇表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，采用BepiPred-2.0在線預(yù)測(cè)CyHV-2的ORF6蛋白抗原決定簇（Jespersen et al.，2017），結(jié)果表明分值最高為0.63，在第1～300位氨基酸的峰值普遍較高（圖2），即ORF6蛋白的抗原表位最可能存在于第1～300位氨基酸序列中。

2. 2 ORF6基因擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)GenBank已公布CyHV-2的ORF6基因序列設(shè)計(jì)引物，并以CyHV-2感染7 d的GiCF細(xì)胞DNA為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果（圖3）表明，擴(kuò)增獲得的目的條帶大小為300 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

2. 3 重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6構(gòu)建結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與原核表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行雙酶切處理，然后通過(guò)T4 DNA連接酶將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，最后提取質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6構(gòu)建成功。以重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用于后續(xù)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)分析。

2. 4 融合蛋白可溶性分析結(jié)果

轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6的BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后，采用超聲波破碎菌體，離心后分別收集上清液及沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)菌體沉淀在17.13 kD處出現(xiàn)目的條帶（圖4），而在未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照菌體中沒(méi)有對(duì)應(yīng)的目的條帶，由此可認(rèn)定目標(biāo)蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。

2. 5 融合蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件

為了最大量誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白ORF6，分別以終濃度為0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5 h，SDS-PAGE分析結(jié)果（圖5）顯示IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L。

2. 6 融合蛋白純化效果

誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白ORF6分別以2、4、6和8 mol/L的尿素進(jìn)行溶解，然后采用Solarbio MD44透析袋進(jìn)行純化處理，SDS-PAGE分析結(jié)果（圖6）顯示，以6 mol/L尿素的洗滌純化效果最佳。采用該濃度尿素進(jìn)行純化，結(jié)果（圖7）顯示，ORF6中雜帶較少，特異性較好，其濃度為0.1 mg/mL。

2. 7 ORF6多克隆抗體制備及鑒定結(jié)果

以純化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠，在免疫后收集小鼠血清制備ORF6多克隆抗體。為鑒定ORF6多克隆抗體能否特異性識(shí)別ORF6蛋白，采用未感染CyHV-2的GiCF細(xì)胞樣品和純化融合蛋白ORF6樣品檢測(cè)其特異性，SDS-PAGE分析結(jié)果（圖8）顯示ORF6多克隆抗體可特異性識(shí)別抗原。Western blotting檢測(cè)結(jié)果（圖9）也顯示，ORF6多克隆抗體可與融合蛋白ORF6發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)能與CyHV-2感染GiCF細(xì)胞發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，即制備獲得的ORF6多克隆抗體可用于鑒定CyHV-2感染。

2. 8 間接免疫熒光分析結(jié)果

利用制備的ORF6多克隆抗體對(duì)CyHV-2感染GiCF細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光分析，顯微鏡觀察結(jié)果顯示，未感染CyHV-2的對(duì)照組GiCF細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)CPE現(xiàn)象（圖10-A），而CyHV-2感染組GiCF細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE現(xiàn)象（圖10-D）。DAPI染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組GiCF細(xì)胞（圖10-C）相比，感染組GiCF細(xì)胞出現(xiàn)大批量細(xì)胞死亡現(xiàn)象（圖10-F）;對(duì)照組GiCF細(xì)胞未能觀察到特異性綠色熒光（圖10-B），而在感染組GiCF細(xì)胞周圍能觀察到特異性綠色熒光（圖10-E），進(jìn)一步說(shuō)明ORF6多克隆抗體可特異性識(shí)別CyHV-2。

3 討論

在許多脊椎動(dòng)物及某些無(wú)脊椎動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)有皰疹病毒存在，皰疹病毒感染的獨(dú)特特征是潛伏感染（潛伏期）。潛伏期是皰疹病毒最顯著的特性，可確保在未發(fā)生急性感染的情況下在宿主中長(zhǎng)期保存其遺傳信息（Whitley and Roizman，2001）。至今，已知CyHV-2的主要免疫原性蛋白有ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132（高娃等，2020），并證實(shí)ORF66作為衣殼蛋白能激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫，具有良好的免疫原性，但是否與潛伏感染相關(guān)尚有待進(jìn)一步探究。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增CyHV-2的ORF6基因，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-ORF6，在BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得約17.13 kD的融合蛋白，且發(fā)現(xiàn)融合蛋白ORF6以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)，利用尿素洗滌純化可得到純度較高的融合蛋白;以純化融合蛋白ORF6免疫小鼠獲得的ORF6多克隆抗體能與CyHV-2發(fā)生特異性反應(yīng)，能在CyHV-2感染3～5 d有效識(shí)別病毒顆粒，為后期探究ORF6蛋白功能是否與CyHV-2潛伏感染相關(guān)打下了基礎(chǔ)。

許多皰疹病毒在潛伏感染過(guò)程中表達(dá)潛伏期相關(guān)蛋白。在鼠丙種皰疹病毒68（MHV68）中，與潛伏期相關(guān)的M2蛋白在潛伏期建立和再激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Siegel et al.，2008），但在建立潛伏期方面表現(xiàn)出劑量依賴性缺陷（Jacoby et al.，2002）。在Epstein-Barr virus（EBV）潛伏期可檢測(cè)到9種潛在蛋白（Kang and Kieff，2015）。其中，EBNA-1在潛伏期建立和再激活中具有多種作用（Sivachandran et al.，2012）;膜蛋白1（LMP1）可阻斷細(xì)胞凋亡，并在感染宿主細(xì)胞中提供生長(zhǎng)信號(hào)（Ndour et al.，2012;Brocqueville et al.，2013）;EBNA-2可保護(hù)EBV感染細(xì)胞免受特定凋亡刺激（Farrell et al.，2004）。皰疹病毒感染后，機(jī)體表達(dá)多種基因并產(chǎn)生抗體，但在潛伏期間相關(guān)基因和mRNA是否表達(dá)或沉默，以及受何種機(jī)制調(diào)控尚未明確?？úㄎ魇先饬霭捳畈《荆↘SHV）包含1個(gè)潛伏期位點(diǎn)，在潛伏期內(nèi)表達(dá)許多基因和miRNA（Ye et al.，2011;Purushothaman et al.，2016）。在KSHV的復(fù)制過(guò)程中，潛伏期相關(guān)核抗原會(huì)促進(jìn)病毒陰體與子細(xì)胞的染色體結(jié)合，從而確保其感染持久性（Barbera et al.，2004;Ballestas and Kaye，2011）。同樣，LANA2是一種潛伏蛋白，多存在于B細(xì)胞中，在潛伏期轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮有效的p53抑制劑作用（Rivas et al.，2001）。在人巨細(xì)胞病毒（HCMV）潛伏感染期間，需要潛在獨(dú)特的天然抗原（LUNA）重新激活并進(jìn)行免疫抑制（Keyes et al.，2012;Mason et al.，2013）?？梢?jiàn)，潛伏感染與急性感染在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中依然存在某些關(guān)聯(lián)，為揭示CyHV-2的潛伏感染機(jī)制提供了新思路。

CyHV-2與許多其他皰疹病毒一樣，在原發(fā)感染后的宿主中具有疑似潛伏感染狀態(tài)，但CyHV-2在潛伏感染方面尚缺乏足夠的證據(jù)。CyHV-2 ORF6與CyHV-3 ORF6的氨基酸序列具有較高的相似性。Reed等（2017）研究表明，KHV（CyHV-3）在潛伏狀態(tài)下表達(dá)部分蛋白，其中ORF6是CyHV-3潛伏期產(chǎn)生的主要蛋白，且ORF6基因是在CyHV-3潛伏期檢測(cè)到的主要轉(zhuǎn)錄本。CyHV-3 ORF6蛋白既存在于體外感染，也存在于體內(nèi)潛伏性感染。ORF6蛋白可能在不同感染階段具有翻譯后修飾作用（黃鋒濤等，2010;劉玉林等，2011），且ORF6蛋白是了解皰疹病毒潛伏感染機(jī)制的關(guān)鍵蛋白（Reed et al.，2017），預(yù)示著ORF6蛋白在功能上對(duì)CyHV-2復(fù)制具有潛在的作用。本研究結(jié)果表明，制備獲得的ORF6多克隆抗體能特異性識(shí)別CyHV-2，為深入探究ORF6蛋白在CyHV-2感染過(guò)程中的潛在功能提供了研究基礎(chǔ)。當(dāng)CyHV-3為潛伏感染時(shí)，病毒僅以非整合基因組的形式存在宿主細(xì)胞核內(nèi)，在某些條件的刺激下CyHV-3能被重新激活，導(dǎo)致宿主表現(xiàn)出臨床癥狀并引起死亡（陳俊杰，2017）。此外，各種環(huán)境因子和應(yīng)急反應(yīng)均會(huì)重新誘發(fā)潛伏感染的皰疹病毒再激活。小鼠單純皰疹病毒重新被激活與白介素6（IL-6）的升高及機(jī)體免疫能力下降有關(guān)（李平等，2004）;大鼠單純皰疹病毒1型（HSV-1）神經(jīng)節(jié)的潛伏感染也呈現(xiàn)相同特征，且得到比刺激前更強(qiáng)烈的疼痛閾值（劉潤(rùn)澤等，2020）。在CyHV-2的潛伏感染中是否存在某一因子或某些因子協(xié)同作用而促使?jié)摲腥颈徽T發(fā)，也是目前值得考慮的問(wèn)題之一。

關(guān)于CyHV-2感染時(shí)病毒滴度及感染時(shí)間是否對(duì)魚體成功感染造成相應(yīng)影響，本課題組已成功建立CyHV-2實(shí)驗(yàn)室感染模型（Goodwin et al.，2009），發(fā)現(xiàn)以病毒滴度為106/mL的CyHV-2感染鯽魚72 h后，部分鯽魚開(kāi)始出現(xiàn)病發(fā)和死亡現(xiàn)象，而部分鯽魚可攜帶病毒并依然存活，推測(cè)其攜帶病毒但并未發(fā)病，即存在潛伏感染的可能性。目前，尚無(wú)足夠證據(jù)佐證CyHV-2在急性感染和潛伏感染中復(fù)制或調(diào)控途徑的差異性，也未找到潛伏感染時(shí)依舊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的基因，因此進(jìn)一步探究ORF6在不同感染模式中的表達(dá)及其調(diào)控方式，可為解析CyHV-2感染的潛伏性及其分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

制備獲得的ORF6多克隆抗體能與CyHV-2感染GiCF細(xì)胞發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，即可用于鑒定CyHV-2感染，為探究ORF6蛋白功能是否與CyHV-2潛伏感染相關(guān)打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）