辣椒炭疽病菌效應(yīng)因子NIS1-PCR-RFLP標(biāo)記系統(tǒng)的建立

歐陽(yáng)超，劉思珍，滿益龍，盛家偉，陳岳，張?chǎng)危瑒⒂?，張德詠，譚新球

摘要：【目的】基于辣椒炭疽病菌種群復(fù)雜、田間復(fù)合侵染種群組成不清，導(dǎo)致防控相對(duì)困難的問(wèn)題，建立一種快速直觀的辣椒炭疽病菌區(qū)分標(biāo)記系統(tǒng)，為其病害田間防控提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坷胷DNA-ITS通用引物克隆田間分離的22株辣椒炭疽病菌rDNA-ITS，通過(guò)其序列比對(duì)分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，初步確定22株供試菌株的種類和分類地位;選用效應(yīng)因子NIS1基因?yàn)榘袠?biāo)，根據(jù)辣椒膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和黃瓜炭疽菌（C. orbiculare）NIS1基因比對(duì)分析，設(shè)計(jì)NIS1基因簡(jiǎn)并引物，克隆22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因，利用其序列比對(duì)分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析比較rDNA-ITS和NIS1基因區(qū)分供試菌株的差異，進(jìn)而對(duì)22株不同辣椒炭疽病菌NIS1基因進(jìn)行分析，選擇限制性內(nèi)切酶，分析NIS1基因的PCR產(chǎn)物限制性片段多態(tài)性（RFLP）差異，建立NIS1-PCR-RFLP標(biāo)記系統(tǒng)?！窘Y(jié)果】rDNA-ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化分析表明22株辣椒炭疽病菌屬于5種炭疽病菌，即膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、短孢炭疽菌（C. brevisporum）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）、平頭炭疽菌（C. truncatum）和黑點(diǎn)炭疽菌（C. capsici），其序列同源性為85.6%～99.8%，但C. capsici和C. truncatum處于同一混合組群;22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因兩端序列較保守，中間存在可變區(qū)，與已報(bào)道的C. orbiculare的NIS1基因同源性在34.6%～78.9%;NIS1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹能將22株辣椒炭疽病菌分成5個(gè)組群，C. capsici和C. truncatum處于不同組群，表明其區(qū)分度優(yōu)于rDNA-ITS;NIS1-PCR- RFLP主要差異片段顯示C. gloeosporioides和C. brevisporum的最大片段均為210 bp，但片段數(shù)目不同，而C. acutatum為292 bp，C. capsici為685 bp，C. truncatum為345 bp，參照菌株C. orbiculare為497 bp，能夠直觀觀察區(qū)分?！窘Y(jié)論】研究建立的NIS1-PCR-RFLP標(biāo)記系統(tǒng)可簡(jiǎn)便、直觀地區(qū)分不同辣椒炭疽病菌的差異，有望發(fā)展成為真菌新的分子標(biāo)記應(yīng)用于田間辣椒炭疽病菌種群的快速鑒定。

關(guān)鍵詞： 辣椒炭疽病菌;效應(yīng)因子NIS1;PCR-RFLP;標(biāo)記系統(tǒng);核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）

中圖分類號(hào)： S436.418.11? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）09-2473-09

Development of NIS1-PCR-RFLP marker system to effectors of Colletotrichum spp. from infected pepper plants

OUYANG Chao1，2， LIU Si-zhen1，2， MAN Yi-long3， SHENG Jia-wei2，4， CHEN Yue2，

ZHANG Xin2， LIU Yong1，2， ZHANG De-yong1，2， TAN Xin-qiu1，2*

（1Long Ping Branch，Graduate School of Hunan University， Changsha? 410125， China; 2Plant Protection Institute，Hunan Academy of Agricultural Sciences，Changsha? 410125， China; 3Biotechnology Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha? 410125， China; 4Agricultural University of Hunan， Changsha? 410000， China）

Abstract：【Objective】Based on the complex population of pepper anthracnose and unclear composition of compound infection population in the fields， it was relatively difficult to control capsicum anthracis. Therefore， a rapid and intuitive marking system for pepper anthracnose was established to provide scientific basis for field control of the disease. 【Me-thod】The rDNA-ITS primers were used to clone 22 isolates of pepper Colletotrichum spp. isolated from field. The phylogenetic tree was constructed by sequence alignment analysis， and the species and taxonomic status of 22 isolates were preliminarily determined. An effector NIS1 gene as target， its alignment was performed between Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum orbiculare to design degenerate primers of NIS1 by genome database. NIS1 gene was isolated and cloned of 22 different strains of pepper Colletotrichum spp.， and phylogenetic tree of NIS1 gene was constructed with their NIS1 sequences alignment. Analyzed and compared the genes of rDNA-ITS and NIS1 gene to distinguish the diffe-rence of the tested strains， and then analyzed the NIS1 gene of 22 different strains of pepper Colletotrichum spp.， selected restriction endonuclease， analyzed the difference of PCR product restriction fragment length polymorphism （RFLP） of NIS1 gene， and established the NIS1-PCR-RFLP labeling system. 【Result】Phylogenetic analysis of rDNA-ITS sequences showed that 22 strains of Colletotrichum spp. belonged to 5 species of C. gloeosporioides， C. brevisporum， C. acutatum， C. truncatum and C. capsici， and their sequences homology was 85.6%-99.8%， but C. capsici and C. truncatum were in the same mixed group. The NIS1 gene sequences of 22 strains of Colletotrichum spp. were conserved， and there was varia-ble region in the middle， which was 34.6%-78.9% homologous with the NIS1 gene of C. orbiculare. The NIS1 gene phylogenetic tree could divide 22 strains of Colletotrichum spp. into 5 groups， and C. capsici and C. truncatum were in diffe-rent groups， indicating that their differentiation was better than rDNA-ITS. NIS1-PCR-RFLP showed that the maximum fragments of C. gloeosporioides and C. brevisporum were both 210 bp， but the number of fragments was different， while those of C. acutatum， C. capsici and C. truncatum were 292， 685， and 345 bp， respectively. The reference strain C. orbiculare was 497 bp， which can be visually distinguished. 【Conclusion】The NIS1-PCR-RFLP marking system was established in this study， it can easily and directly distinguish the differences of different Colletotrichum spp. infected pepper plants， Therefore， the NIS1-PCR-RFLP marking system is expected to be developed into a new fungal molecular marker for rapid identification of Colletotrichum spp. from infected pepper plants in field.

Key words： pepper Colletotrichum spp.; effector NIS1; PCR-RFLP;marker system; rDNA internal transcribed spacers （rDNA-ITS）

Foundation item： General Project of National Natural Science Foundation of China（31972223）; Youth Fund of National Natural Science of China（31701814）; Hunan Agriculture Science and Technology Innovation Fund Project（2020CX39， 2020CX43）

0 引言

【研究意義】辣椒炭疽病是辣椒生產(chǎn)過(guò)程中的重要真菌病害之一，其種類多、寄主范圍廣、危害重，且傳播速度快（Mongkolpn and Taylo，2018;Toporek and Keinath，2020;Naveen et al.，2021）。目前我國(guó)已報(bào)道的辣椒炭疽病菌種群主要包括膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）、平頭炭疽菌（C. truncatum）、黑點(diǎn)炭疽菌（C. capsici）和短孢炭疽菌（C. brevisporum）5種，嚴(yán)重威脅辣椒生產(chǎn)（Diao et al.，2017;魏立娟，2019）。田間采樣檢測(cè)證實(shí)辣椒炭疽病菌主要以復(fù)合侵染為主，復(fù)合侵染率高達(dá)30%～50%，這可能是田間防治困難的重要原因之一（Ren et al.，2020）。不同辣椒炭疽病菌對(duì)化學(xué)藥劑的敏感性存在巨大差異，滿益龍等（2016）研究發(fā)現(xiàn)不同炭疽病菌對(duì)化學(xué)農(nóng)藥唑菌酯的敏感性最高相差300倍，推測(cè)是田間化學(xué)防控效率低的重要原因。辣椒炭疽病菌遺傳復(fù)雜多樣，曾泉（2019）研究表明不同來(lái)源的膠孢炭疽菌種群內(nèi)存在明顯的遺傳多樣性，且不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群內(nèi)存在明顯遺傳差異;此外，菌株本身的形態(tài)學(xué)特征和致病性等也存在類似現(xiàn)象;霍建飛等（2020a）、周建波等（2020）研究也證實(shí)辣椒炭疽病菌遺傳變異與地理結(jié)構(gòu)和寄主植物存在一定的相關(guān)性。因此，尋求一種快速、有效區(qū)分不同種類炭疽病菌的方法，是實(shí)現(xiàn)田間早期辣椒炭疽病精準(zhǔn)防治的重要基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物病原真菌的分子標(biāo)記多樣，研究人員根據(jù)研究對(duì)象和基因組數(shù)據(jù)，采用不同分子標(biāo)記使相同的供試菌株遺傳多樣性展現(xiàn)得更清楚。真菌不同分子標(biāo)記系統(tǒng)具有自身的特點(diǎn)，但目前為止尚無(wú)完全統(tǒng)一的模式，基本上根據(jù)研究需要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上發(fā)展或綜合不同的標(biāo)記體系。相比較而言，國(guó)內(nèi)外構(gòu)建的炭疽菌（Colletotrichum spp.）系統(tǒng)鑒定常用的分子標(biāo)記系統(tǒng)中，rDNA-ITS因具有序列片段小、高拷貝數(shù)等特點(diǎn)在炭疽菌的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中占據(jù)重要位置，如利用rDNA-ITS對(duì)紫山藥炭疽病菌（韓曉勇等，2020）、辣椒炭疽病菌（霍建飛等，2020b）、山竹炭疽病菌（楊冬平等，2020）、油茶炭疽病菌（尹華慶等，2020）和大豆炭疽病菌（畢秋艷等，2021）等進(jìn)行鑒定和分類研究，但研究表明利用rDNA-ITS序列不能有效區(qū)分近緣種，如C. capsici和C. truncatum（曾大興，2004;滿益龍等，2016）。為此，研究人員開(kāi)發(fā)了甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）、交配型基因（MAT1-2-1）、肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、DNA裂解酶基因（APN2）、GAPDH與假設(shè)蛋白基因間間隔區(qū)（GAP 2-IGS）、鈣調(diào)素基因（CAL）、幾丁質(zhì)合成酶A基因（CHS-1）、谷氨酰胺合成酶基因（GS）、組蛋白基因（HIS3）、超氧化物歧化酶基因SOD2和β-微管蛋白基因TUB2（韓長(zhǎng)志，2015;Villafana et al.，2019）等多基因復(fù)合標(biāo)記系統(tǒng)，如劉威等（2017）采用形態(tài)學(xué)結(jié)合基于GS、TUB2和rDNA-ITS等基因序列聯(lián)合分析茶樹炭疽病原菌;Diao等（2017）利用ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2和HIS3多基因序列聯(lián)合分析全國(guó)29個(gè)?。▍^(qū)、直轄市）的典型辣椒炭疽病菌;王妮等（2019）采用ITS、ACT、TUB2、CHS1和GAPDH多基因序列聯(lián)合分析辣椒炭疽病病原菌;王雪菲等（2020）采用CAL和GS多基因序列分析核桃炭疽病病原菌。雖然多基因聯(lián)合分析可為一些炭疽病菌復(fù)合種群的分類鑒定提供最佳標(biāo)記，但在實(shí)際應(yīng)用中，其程序復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)導(dǎo)致無(wú)法廣泛應(yīng)用，且目前沒(méi)有能對(duì)所有炭疽菌種進(jìn)行有效區(qū)分的標(biāo)記。Willie等（2020）利用系統(tǒng)發(fā)育信息分析、系譜分類指數(shù)（GSI）和貝葉斯一致性分析（BCA）結(jié)合評(píng)估了13種分子標(biāo)記技術(shù)在炭疽菌屬系統(tǒng)發(fā)育中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)GAPDH、HIS3和TUB2聯(lián)合區(qū)分炭疽病菌種類具有較明顯的優(yōu)勢(shì)，但該組合對(duì)C. gloeosporioides等種群內(nèi)遺傳多樣性區(qū)分不具備明顯優(yōu)勢(shì)，繼而發(fā)展了DNA裂解酶基因與交配型基因間間隔區(qū)（APN2/MAT-IGS）標(biāo)記系統(tǒng)。遺憾的是，目前尚未能構(gòu)建出針對(duì)性強(qiáng)、簡(jiǎn)單直觀的分類標(biāo)記系統(tǒng)應(yīng)用于辣椒炭疽病菌種類區(qū)分。Yoshino等（2012）研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)壞死分泌蛋白基因（Necrosis-inducing secreted protein 1，NIS1）作為一個(gè)相對(duì)保守的效應(yīng)因子，在黃瓜炭疽病菌（C. orbiculare）中以單拷貝的形式存在，其編碼的蛋白可誘導(dǎo)本氏煙煙草細(xì)胞死亡。UniProt KB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)CoNIS1有219個(gè)假定的同源物，廣泛存在于子囊菌門和擔(dān)子菌門真菌中，表明NIS1效應(yīng)因子廣泛存在且相對(duì)保守（Hiroki et al.，2019），特別是基因兩側(cè)相對(duì)保守，存在相對(duì)>100 bp的可變區(qū)，符合作為分子標(biāo)記的基本特征。而且本課題組實(shí)驗(yàn)室分析辣椒C. gloeosporioides-CSLL11基因組發(fā)現(xiàn)NIS1基因也是以單拷貝的形式存在，基因片段大小為500 bp左右，由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成;將不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因存在片段缺失或插入，表明也可能存在生物學(xué)功能分化，這可能是病菌在環(huán)境中與寄主協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，與Hiroki等（2019）的研究結(jié)果一致，因此，推測(cè)NIS1基因可作為一種有效區(qū)分侵染辣椒的主要炭疽菌種類新的分子標(biāo)記?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對(duì)辣椒炭疽病主要病原菌的分離鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析多采用rDNA-ITS及多基因聯(lián)合分析法，而且不同研究使用不同的分子標(biāo)記系統(tǒng)，其遺傳多樣性存在一定差異。真菌功能基因一直是研究熱點(diǎn)，特別是真菌與寄主協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，致病功能基因協(xié)同進(jìn)化是真菌適應(yīng)寄主植物的重要手段，而目前關(guān)于利用重要功能基因作為真菌種類鑒定的分子標(biāo)記研究鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)克隆供試菌株的NIS1和rDNA-ITS，根據(jù)相關(guān)序列構(gòu)建NIS1和rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定NIS1基因在不同種辣椒炭疽病菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化中的區(qū)分度;比對(duì)分析不同辣椒炭疽病菌NIS1基因序列，結(jié)合PCR-RFLP分析，明確不同辣椒炭疽病菌NIS1基因的多態(tài)性差異，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、直觀、快速有效區(qū)分不同種辣椒炭疽病菌，為田間辣椒炭疽病菌種群的快速鑒定和高效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌株 供試菌株主要分離自湖南辣椒主產(chǎn)區(qū)具有典型炭疽病病癥的辣椒樣品。所有分離菌株結(jié)合各形態(tài)特征和分子標(biāo)記rDNA-ITS序列比對(duì)分析，初步證實(shí)為膠孢炭疽菌、尖孢炭疽菌、短孢炭疽菌、黑點(diǎn)炭疽菌和平頭炭疽菌。另外選取1株黃瓜炭疽病菌（C. orbiculare）作為參照菌。所有供試菌株均已接種斜面4 ℃保存，具體信息見(jiàn)表1。

1. 1. 2 供試培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（索萊寶Solarbio公司）46 g，H2O 1 L。 PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 L。LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，H2O 1 L，調(diào)pH 7.2;LB固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上每升加入15 g瓊脂。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 不同辣椒炭疽病菌菌株基因組DNA提取與純化 將斜面保存的菌株接種至PDA固體培養(yǎng)基中活化，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，取直徑為0.5 cm大小的菌絲餅3～4塊于PDA液體培養(yǎng)基中28 ℃搖床培養(yǎng)3 d，雙層紗布過(guò)濾，無(wú)菌水漂洗2次，用濾紙吸除多余水分，液氮充分研磨，采用CTAB法提取其基因組DNA，并溶于適量的無(wú)菌ddH2O中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 辣椒炭疽病菌rDNA-ITS片段與NIS1基因引物設(shè)計(jì) rDNA-ITS序列引物采用通用引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'和ITS5：5'-GGAA GTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。根據(jù)已報(bào)道的C. orbiculare NIS1（AB669517.1）基因，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)NIS1氨基酸序列相對(duì)保守，但DNA序列存在一定變異。結(jié)合辣椒膠孢炭疽菌的NIS1序列DNAMAN 5.0分析，依據(jù)C. orbiculare、C. acutatum和C. gloeosporioides NIS1上下游序列分析，根據(jù)兩端保守特性設(shè)計(jì)其特異性簡(jiǎn)并引物，NIS1-F：5'-ATGCAGTTCCG（T）CG（A）CT（C）TCC A（C）T-3'，NIS1-R：5'-ACTGGCTGCC（G）GACGT AGT（G）TC（G）-3'。

1. 2. 3 ITS片段和NIS1基因的克隆 利用1.2.1的DNA為模板，1.2.2特異性引物進(jìn)行梯度PCR（52～65 ℃，設(shè)置12個(gè)梯度）以確定最佳反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系25.00 μL：包括10×Taq Buffer（含Mg2+） 2.50 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.00 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 μL，TaKaRa Taq DNA polymerase 0.25 μL，DNA模板1.00 μL（≤200 μg），ddH2O 18.75 μL;擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，退火（rDNA-ITS 56 ℃，NIS1 58 ℃）30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定最佳反應(yīng)條件。利用優(yōu)化的反應(yīng)條件，采用TaKaRa DNA片段回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物?；厥盏哪康腄NA片段連接T1載體25 ℃ 10 min，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送生工生物工程（武漢）股份有限公司測(cè)序。

1. 2. 4 基于NISI基因和rDNA-ITS片段系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建 根據(jù)生工生物工程（武漢）股份有限公司所測(cè)序列結(jié)果，將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入NCBI進(jìn)行BLAST分析。用MEGA 7.0對(duì)供試?yán)苯诽烤也【腘IS1基因和rDNA-ITS片段序列進(jìn)行比對(duì)分析，校正后采用bootstrap test（1000次重復(fù)）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，遺傳距離用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）進(jìn)行計(jì)算。

1. 2. 5 NIS1基因的RFLP分析 根據(jù)NIS1基因測(cè)序結(jié)果，利用DNAMAN 5.0對(duì)目標(biāo)基因NIS1進(jìn)行限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析，篩選限制性內(nèi)切酶。構(gòu)建酶切體系20 μL：包括6 μL PCR純化產(chǎn)物，1 μL Eco31I限制性內(nèi)切酶（NEB），1 μL SacI限制性內(nèi)切酶（NEB），2 μL Cutsmart Buffer，10 μL無(wú)菌ddH2O;反應(yīng)條件：37 ℃孵育1 h，電泳后拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同辣椒炭疽病菌的rDNA-ITS序列比對(duì)分析結(jié)果

根據(jù)供試炭疽病菌的rDNA-ITS序列聚類分析結(jié)果（圖1），發(fā)現(xiàn)22株辣椒炭疽病菌可分為C. gloeosporioides（12株）、C. brevisporum（1株）、C. acutatum（4株）、C. truncatum和C. capsici混合（5株）4個(gè)組群。不同組群內(nèi)部的同源性高達(dá)99.0%，未呈現(xiàn)明顯的地理分布特性;不同組群間，除了C. truncatum和C. capsici混合群外，相同種群基本聚集在同一分支，其中以C. truncatum rDNA-ITS序列為參考，C. gloeosporioides、C. brevisporum、C. acutatum和C. capsici與其同源性分別為92.0%、85.6%、89.4%和99.8%。表明rDNA-ITS不能將C. capsici與C. truncatum有效區(qū)分。

2. 2 不同辣椒炭疽病菌NIS1基因序列比對(duì)分析結(jié)果

以C. orbiculare（TJ01;GenBank NO.：AB6695 17.1）為外群，構(gòu)建22株供試?yán)苯诽烤也【腘IS1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果（圖2）顯示，22株辣椒炭疽病菌可分為5個(gè)組群，C. capsici和C. truncatum處于不同進(jìn)化分支上，但未觀察到相同種群內(nèi)呈現(xiàn)明顯的地理區(qū)域差異。其中C. gloeosporioides組群包含12株菌株;C. brevisporum組群包含1株菌株;C. acutatum組群包含4株菌株;C. truncatum組群包含3株菌株;C. capsici組群包含2株菌株。表明NIS1基因可作為辣椒炭疽病菌種群遺傳多樣性研究的重要分子標(biāo)記。此外，供試菌株NIS1基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，C. gloeosporioides、C. brevisporum、C. acutatum、C. capsici和C. truncatum與參考菌株C. orbiculare的NIS1基因同源性分別為78.5%、78.9%、70.7%、43.7%和34.6%，且其兩端序列較保守，中間存在可變區(qū)。

2. 3 rDNA-ITS與NIS1基因序列對(duì)不同辣椒炭疽病菌的區(qū)分度比較結(jié)果

基于供試菌株rDNA-ITS與NIS1基因序列比較分析，相同種群內(nèi)部序列的同源性較高。為此從供試菌株中選擇5種辣椒炭疽病菌為代表進(jìn)行區(qū)分度比較，NIS1基因?qū)?種炭疽病菌分在不同分支，而且C. capsici和C. truncatum能清楚區(qū)分（圖3-A）;而C. capsici和C. truncatum的rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化處于同一分支，無(wú)法有效區(qū)分（圖3-B）。表明NIS1基因?qū)Σ煌苯诽烤也【膮^(qū)分度優(yōu)于rDNA-ITS。

2. 4 不同辣椒炭疽病菌NIS1-PCR-RFLP分析結(jié)果

以C. orbiculare為參照菌株，對(duì)22株供試?yán)苯诽烤也【鶱IS1基因序列分析發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶Eco31I和SacI為RFLP分析的理想位點(diǎn)，Eco31I和SacI處理NIS1 PCR產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠電泳明顯觀察到可分離出的最大片段C. gloeosporioides為210 bp，C. acutatum為292 bp，C. capsici為685 bp，C. brevisporum為210 bp，C. truncatum為345 bp，參照菌株C. orbiculare為497 bp。盡管C. gloeosporioide和C. brevisporum可分離的最大片段相同，但RFLP的片段數(shù)目分別為5個(gè)和6個(gè)小片段，較容易區(qū)分（圖4）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)NIS1基因能將5種辣椒炭疽病菌清楚區(qū)分，特別是C. truncatum與C. capsici處在不同分支，但rDNA-ITS不能將其區(qū)分，表明NIS1基因的區(qū)分度高于傳統(tǒng)單基因標(biāo)記如GAPDH、GS、HIS3和TUB2標(biāo)記（Ariana and Sephra，2012;肖軍，2020）;值得一提的是，NIS1基因?qū)?fù)合種群區(qū)分結(jié)果與Willie等（2020）發(fā)展的DNA裂解酶基因與交配型基因間間隔區(qū)（APN2/MAT-IGS）標(biāo)記一致。NIS1基因作為真菌侵染過(guò)程中負(fù)責(zé)靶向植物寄主免疫激酶的功能基因，Hiroki等（2019）通過(guò)NISI基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同辣椒炭疽病菌的NIS1基因存在片段缺失或插入，表明存在生物學(xué)功能分化，推測(cè)是病菌在環(huán)境中與寄主協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。根據(jù)UniProt KB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析結(jié)果，NIS1基因在真菌中廣泛存在而且相對(duì)保守，表明NIS1基因可作為真菌種類分子標(biāo)記的新靶標(biāo)，其可變區(qū)反映了不同炭疽病菌與寄主植物協(xié)同進(jìn)化的差異，本研究結(jié)果與Hiroki等（2019）的研究結(jié)果一致。

基于目前辣椒種植方式（設(shè)施栽培和露地栽培）交替，田間辣椒炭疽病發(fā)病越來(lái)越嚴(yán)重，而且國(guó)際上不斷有新的辣椒炭疽病菌報(bào)道（de Silva et al.，2019;Sheu et al.，2020;May et al.，2021），導(dǎo)致田間復(fù)合侵染變得更復(fù)雜。本研究中，對(duì)不同區(qū)域來(lái)源的相同種炭疽病菌進(jìn)行NIS1基因序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)NISI基因高度保守，未體現(xiàn)出不同地理來(lái)源的遺傳多樣性差異，但對(duì)于不同炭疽病菌，區(qū)分度明顯優(yōu)于rDNA-ITS，是否能作為廣泛的炭疽病菌種群間的分子標(biāo)記，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

曾大興等（2004）對(duì)C. truncatum和C. capsici的rDNA-ITS序列進(jìn)行RFLP序列分析，結(jié)果顯示其酶切圖譜完全一致，支持兩者為同一菌種。Ariana和Sephr（2012）利用分子標(biāo)記基因?qū)?lái)自木瓜和辣椒的C. gloeosporioides和C. truncatum進(jìn)行ITS-PCR-RFLP分析，利用11種限制性內(nèi)切酶對(duì)48株菌株能有效區(qū)分;其中AluI，HaeIII，PvuII，RsaI和Sau3A能有效區(qū)分來(lái)自木瓜的C. gloeosporioides和C. truncatum;AluI，ApaI，PvuII，RsaI和SmaI能有效區(qū)分來(lái)自辣椒的C. gloeosporioides和C. truncatum;PvuII，RsaI和Sau3A能有效區(qū)分來(lái)自木瓜的C.gloeosporioides，研究中使用多種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行RFLP分析，主要是ITS高度保守而且種間序列差異較小。而本研究主要針對(duì)不同辣椒炭疽病菌的NIS1-RFLP分析，2種限制性內(nèi)切酶Eco31I和SacI消化后的PCR產(chǎn)物差異片段數(shù)目和大小觀察清楚，簡(jiǎn)便直觀體現(xiàn)了不同辣椒炭疽病菌之間的差異，便于辣椒生產(chǎn)中炭疽病不同病原菌短時(shí)間內(nèi)快速有效區(qū)分，可滿足防控實(shí)際需要。但利用NIS1-RFLP對(duì)來(lái)自辣椒的相同種炭疽病菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Eco31I和SacI消化后的PCR產(chǎn)物模式完全相同，與其NIS1基因序列分析結(jié)果完全一致，因此，針對(duì)辣椒C. gloeosporioides種內(nèi)的遺傳多樣性，需要參照Ariana和Sephr（2012）的研究，選擇不同的限制性內(nèi)切酶，進(jìn)一步優(yōu)化PCR-RFLP體系。另外，本研究比較了來(lái)自橡膠、草莓和辣椒的膠孢炭疽病菌NIS1基因序列，盡管不同來(lái)源膠孢炭疽病菌NIS1基因序列的同源性為96%以上，但系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上處于不同分支，表明NIS1基因也可作為膠孢炭疽菌種內(nèi)遺傳多樣性的分子標(biāo)記，但其RFLP體系需要選擇不同的限制性內(nèi)切酶來(lái)構(gòu)建。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，病原真菌基因組數(shù)據(jù)越來(lái)越多，為真菌新的標(biāo)記發(fā)展打下了基礎(chǔ)。特別是廣譜功能基因的研究，為其提供了相對(duì)詳實(shí)的數(shù)據(jù)，便于新的分子標(biāo)記研究;傳統(tǒng)標(biāo)記系統(tǒng)與新的標(biāo)記系統(tǒng)融合，如NIS1基因標(biāo)記與其他標(biāo)記系統(tǒng)融合，為復(fù)合種群的區(qū)分提供更多的信息。值得期待的是，NIS1基因及其他致病功能基因是否可作為真菌種類鑒定的重要標(biāo)記，需要對(duì)更多功能基因進(jìn)行研究驗(yàn)證，從不同角度豐富真菌分子標(biāo)記系統(tǒng)，相關(guān)研究工作目前正在進(jìn)行中。

4 結(jié)論

本研究以辣椒炭疽病菌效應(yīng)因子NIS1基因?yàn)榘袠?biāo)，成功發(fā)展了一種NIS1-PCR-RFLP標(biāo)記系統(tǒng)，可快速有效區(qū)分侵染辣椒的C. truncatum、C. capsici、C. brevisporum、C. gloeosporioides和C. acutatum，明顯優(yōu)于rDNA-ITS標(biāo)記系統(tǒng)。該方法具有特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便直觀等特點(diǎn)，有望發(fā)展成為真菌新的分子標(biāo)記應(yīng)用于田間辣椒炭疽病菌種群的快速鑒定。

參考文獻(xiàn)：

畢秋艷，黨志紅，朱偉旗，高占林，韓秀英，趙建江，王文橋，路粉，吳杰. 2021. 河北省大豆主要病原真菌鑒定及防治藥劑篩選[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，54（1）：71-85. [Bi Q Y，Dang Z H，Zhu W Q，Gao Z L，Han X Y，Zhao J J，Wang W Q，Lu F，Wu J. 2021. Identification of major pathogenic fungi of soybean in Hebei Province and screening of control fungicides[J]. Agricultural Sciences in China，54（1）：71-85.] doi：10.3864/j.issn.0578-1752.2021.01.006.

韓長(zhǎng)志. 2015. 炭疽菌屬真菌分類研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，35（6）：24-30. [Han C Z. 2015. Research review on taxonomy of genus Colletotrichum and its development trend[J]. China Plant Protection，35（6）：24-30.] doi：10.3969/j.issn.1672-6820.2015.06.005.

韓曉勇，殷劍美，張培通，王立，郭文琦，李春宏. 2020. 紫山藥炭疽病病原菌鑒定[J]. 分子植物育種，18（15）： 5010-5019. [Han X Y，Yin J M，Zhang P T，Wang L，Guo W Q，Li C H. 2020. Pathogen identification of anthracnose on purple Dioscorea alata L. caused by Colletotrichum spp.[J]. Molecular Plant Breeding，18（15）：5010-5019.] doi：10.13271/j.mpb.018.005010.

霍建飛，姚玉榮，郝永娟，于金萍，劉春艷，王萬(wàn)立. 2020a. 天津市寧河區(qū)辣椒炭疽病病原鑒定及防治藥劑篩選[J]. 北方園藝，9（3）：1-7. [Huo J F，Yao Y R，Hao Y J，Yu J P，Liu C Y，Wang W L. 2020a. Identification of pathogens and screening of control agents of chili anthrax in Ninghe District，Tianjin[J]. Northern Horticuture，9（3）：1-7.] doi： 10.11937/bfyy.20192149.

霍建飛，姚玉榮，任文來(lái)，郝永娟，王勇，王萬(wàn)立. 2020b. 戊唑醇對(duì)2種辣椒炭疽菌的敏感性差異[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，48（8）： 151-152. [Huo J F，Yao Y R，Ren W L，Hao Y J，Wang Y，Wang W L. 2020b. The sensitivity difference of tebuconazole against Colletotrichum scovillei and Colletotrichum truncatum[J]. Journal of Anhui Agricultural Scien-ces，48（8）： 151-152.] doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020. 08.035.

劉威，袁丁，郭桂義，楊國(guó)一，葉乃興. 2017. 茶樹炭疽病病原鑒定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，48（3）： 448-453. [Liu W，Yuan D，Guo G Y，Yang G Y，Ye N X. 2017. Identification of anthracnose pathogen in tea plant[J]. Journal of Southern Agriculture，48（3）：448-453.] doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2017.03.011.

滿益龍，譚新球，司乃國(guó)，陳岳，張卓，劉勇，張德詠. 2016. 不同辣椒炭疽病菌對(duì)唑菌酯的敏感性差異[J]. 植物保護(hù)，42（5）： 171-176. [Man Y L，Tan X Q，Si N G，Chen Y，Zhang Z，Liu Y，Zhang D Y. 2016. Sensitivity differentiation of different Colletotrichun spp. strains causing anthracnose of Capsicum annuum L. plants to pyraoxystrobin[J]. Plant Protection，42（5）：171-176.] doi：10.3969/ j.issn.0529-1542.2016.05.030.

王妮，尹顯慧，彭麗娟，李榮玉，龍友華，吳小毛，樊榮，王坤英，李繼業(yè). 2019. 辣椒炭疽病病原鑒定及其殺菌劑毒力測(cè)定[J]. 植物保護(hù)，45（4）： 216-223. [Wang N，Yin X H，Peng L J，Li R Y，Long Y H，Wu X M，F(xiàn)an R，Wang K Y，Li J Y. 2019. Identification of the pathogen and toxi-city test of fungicides to capsicum anthracnose[J]. Plant Protection，45（4）：216-223.] doi：10.16688/j.zwbh.201 8341.

王雪菲，李金榮，盧東曉，陳孟，朱會(huì)營(yíng)，李會(huì)平. 2020. 核桃炭疽病病原菌的分離鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，47（5）：1161-1162. [Wang X F，Li J R，Lu D X，Chen M，Zhu H Y，Li H P. 2020. Isolation and identification of pathogen of walnut anthracnose[J]. Journal of Plant Pathology，47（5）：1161-1162.] doi：10.13802/j.cnki.zwbhxb.2020.2019182.

魏立娟. 2019. 辣椒炭疽病菌的鑒定、綜合防治及互作后辣椒基因差異表達(dá)[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué). [Wei L J. 2019. Identification，integrated control of Colletotrichum scovillei and differentially expressed genes in pepper after interaction between Colletotrichum scovillei and pe-pper[D]. Lanzhou： Gansu Agricultural University.] doi： 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000088.

肖軍. 2020. 分子標(biāo)記在植物分子系統(tǒng)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)教學(xué)，45（11）： 4-6. [Xiao J. 2020. Application of molecular markers in plant molecular systems[J]. Biology Teaching，45（11）：4-6.] doi： 10.3969/j.issn.1004-7549. 2020.11.002.

楊冬平，胡加誼，陳兵. 2020. 海南省2種山竹真菌病害的分離與鑒定[J]. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)，（5）：83-93. [Yang D P，Hu J Y，Chen B. 2020. Isolation and identification of two fungal diseases of mangosteen in Hainan[J]. Plant Protection，（5）：83-92.] doi： 10.3969/j.issn.1673-0658.2020.05. 020.

尹華慶，王建田，劉敏. 2020. 油茶炭疽病病原菌鑒定及防治藥劑篩選[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，（6）：70-72. [Yin H Q，Wang J T，Liu M. 2020. Pathogen identification of Camellia oleifera anthracnose and fungicides screening[J]. Hunan Agricultural Sciences，（6）：70-72.] doi：10.16498/j.cnki.hnnykx.2020.006.017.

曾大興，戚佩坤，姜子德. 2004. 孢類炭疽菌rDNA ITS區(qū)的RFLP分析及分類研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，34（5）：431-436. [Zeng D X，Qi P K，Jiang Z D. 2004. RFLP analysis of ITS region of rDNA in the falcate-spored species of Colletotrichum[J]. Acta Phytopathologica Sinica，34（5）：431-436.] doi：10.3321/j.issn：0412-0914.2004.05. 008.

曾泉. 2019. 辣椒膠孢炭疽菌對(duì)抑霉唑及其衍生物的敏感性差異[D]. 長(zhǎng)沙： 湖南大學(xué). [Zeng Q. 2019. Sensitivity differentiation of Colletotrichum gloeosporioides causing pepper anthracnose to chemical imazalil and its derivations[D]. Changsha： Hunan University.] doi：10.27135/d.cnki.ghudu.2019.001568.

周建波，殷輝，呂紅，秦楠，趙曉軍. 2020. 8種不同類型藥劑對(duì)辣椒炭疽病的田間防治效果[J]. 中國(guó)瓜菜，33（11）： 72-76. [Zhou J B，Yin H，Lü H，Qin N，Zhao X J. 2020. Evaluation of field control effects of eight different types of fungicides on pepper anthracnose[J]. Chinese Melon Dishes，33（11）： 72-76.] doi：10.3969/j.issn.1673-2871. 2020.11.016.

Ariana M，Sephra N R. 2012. Genetic differentiation of Colletotrichum gloeosporioides and C. truncatum associated with anthracnose disease of papaya（Carica papaya L.） and bell pepper（Capsium annuum L.） based on ITS PCR-RFLP fingerprinting[J]. Molecular Biotechnology，50（3）： 237-249. doi：10.1007/s12033-011-9434-2.

de Silva D D，Groenewald J Z，Crous P W，Ades P K，Nasruddin A，Mongkolporn O，Taylor P W J. 2019. Identification，prevalence and pathogenicity of Colletotrichum species causing anthracnose of Capsicum annuum in Asia[J]. IMA Fungus，10（1）：8. doi：10.1186/s43008-019-0001-y.

Diao Y Z，Zhang C，Liu F，Wang W Z，Liu L，Cai L，Liu X L. 2017. Colletotrichum species causing anthracnose disease of chili in China[J]. Persoonia，38： 20-37. doi：10.3767/003158517X692788.

Hiroki I，Yoshihiro I，Masashi M，Kohji Y，Yuu O，Hiromasa S，Aiko U，Ryohei T，Saeko K，Ayumi K，Suthitar S O，Yoshitaka T. 2019. Conserved fungal effector suppresses PAMP-triggered immunity by targeting plant immune kinases[J]. PNAS，25： 496-505. doi：10.1073/pnas.180729 7116.

May M O，Kim M R，Kim D G，Kwak T S，Oh S K. 2021. First report of Colletotrichum siamense causing anthracnose of chili pepper fruit in Korea[J]. Plant Disease，105（5）：1567. doi： 10.1094/PDIS-10-20-2297-PDN.

Mongkolpn O，Taylo P W J. 2018. Chili anthracnose： Colletotrichum taxonomy and pathogenicity[J]. Plant Pathology，67（6）： 1255-1263. doi：10.1111/ppa.12850.

Naveen J，Navya H M，Hithamani G，Hariprasad P，Niranjana S R. 2021. Pathological，biochemical and molecular varia-bility of Colletotrichum truncatum incitant of anthracnose disease in chilli（Capsicum annuum L.）[J]. Microbial Pathogenesis，152：104611. doi： 10.1016/2020/104611.

Ren L，Wang S F，Shi X J，Shi X J， Cao J Y，Zhou J B，Zhao X J. 2020. Characterisation of sensitivity of Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum capsici，cau-sing pepper anthracnose，to picoxystrobin[J]. Journal of Plant Diseases and Protection，127：657-666. doi：10.1007/s41348-020-00316-y.

Sheu Z M，Chiu M H，Chang R J，Kenyon L. 2020. First report of Colletotrichum coccodes causing fruit anthracnose and leaf spot on sweet pepper in Taiwan[J]. New Disea-se Reports，42（1）：9. doi：10.5197/j.2044-0588.2020.042. 009.

Toporek S M，Keinath A P. 2020. First report of Colletotrichum scovillei causing anthracnose fruit rot on pepper in South Carolina，United States[J]. Plant Disease，105（4）：1222. doi： 10.1094/PDIS-08-20-1656-PDN.

Villafana R T，Ramdass A C，Rampersad S N. 2019. Colleto-trichum brevisporum is associated with anthracnose of red bell pepper fruit in Trinidad[J]. New Disease Reports，39（1）： 11. doi：10.5197/J.2044-0588.2019.039.011.

Willie A S V，Priscila A B，Anthony C S，Josiene S V，Marcos P S C，Vinson P D. 2020. Optimal markers for the identification of Colletotrichum species[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，143： 106694. doi：10.1016/j.ympev. 2019.106694.

Yoshino K，Irieda H，Sugimoto F，Yoshioka H，Okuno T，Takano Y. 2012. Cell death of Nicotiana benthamiana is induced by secreted protein NIS1 of Colletotrichum orbiculare and is suppressed by a homologue of CgDN3[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，25（5）：625-636. doi：10.1094/MPMI-12-11-0316.

（責(zé)任編輯 麻小燕）