利用PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化檢測青花菜基因編輯效率

宋立曉 侯忠樂 任一鳴 嚴繼勇 曾愛松 許園園 張昌偉

摘要：CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是作物分子設(shè)計育種的重要手段，sgRNA設(shè)計對于提高基因編輯效率具有重要作用。為了提高sgRNA設(shè)計的準確度，構(gòu)建了聚乙烯亞胺修飾的單壁碳納米管（PEI-SWNT）介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化體系，并用于檢測青花菜CRISPR/Cas9基因編輯效率。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9編輯體系可以誘導(dǎo)青花菜特定基因位點發(fā)生突變，編輯效率為8.3%。研究結(jié)果為利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制青花菜新種質(zhì)提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青花菜;基因編輯;單壁碳納米管;瞬時轉(zhuǎn)化

中圖分類號：S635.301 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0056-03

青花菜（Brassica oleracea L .var. italica Planch）又名西蘭花，是十字花科蕓薹屬甘藍種中以綠色花球為產(chǎn)品的一、二年生草本植物。營養(yǎng)價值較高，含有豐富的維生素，并含抗癌物質(zhì)，受到消費者的青睞。青花菜栽培歷史較短，但發(fā)展很快，在我國已成為一些地區(qū)出口創(chuàng)匯的重要優(yōu)質(zhì)蔬菜種類之一。通過現(xiàn)代育種技術(shù)，提高青花菜種質(zhì)資源的抗性和品質(zhì)，對于青花菜品種選育工作非常重要。

近年來CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作為一種新型生物學(xué)研究手段被開發(fā)利用，該系統(tǒng)憑借其技術(shù)優(yōu)越性被廣泛應(yīng)用于擬南芥、煙草、玉米等多種作物的基因組定點編輯[1-3]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率受多種因素影響，Cas9核酸酶啟動子、sgRNA啟動子的類型、sgRNA與目標位點的結(jié)合效率，目標靶點的數(shù)目、載體的類型、轉(zhuǎn)化的方式以及宿主植株的同源重組修復(fù)能力等;優(yōu)化Cas9基因的密碼子可以提高編輯效率[4-5]。熊興鵬對甘藍型油菜的研究結(jié)果表明，利用不同的sgRNA，其編輯效率從20%到56%不等[6-7]。

不同的sgRNA序列對于目標基因的結(jié)合效率具有很大的差異，在依靠特定軟件對sgRNA序列進行設(shè)計時，各個軟件會依據(jù)sgRNA序列的堿基種類對其編輯效率進行估算，不同軟件的算法差異以及作物種類的影響會造成估算結(jié)果常與實際的編輯效率有較大的差異[8]，為了排除干擾因素的影響，通過瞬時表達對CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)化載體的編輯效率進行檢測就尤為重要。

青花菜的再生體系建立比較困難，轉(zhuǎn)化的效率也較低，在實際的操作中往往是經(jīng)過復(fù)雜的步驟實現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化卻由于基因編輯載體的效率較低而無法實現(xiàn)基因編輯，為了避免這種情況，有必要在遺傳轉(zhuǎn)化前對基因編輯載體的編輯效率進行檢測。

近年來納米材料漸漸應(yīng)用到植物的遺傳轉(zhuǎn)化中[9]。碳納米管和聚乙烯亞胺復(fù)合體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是利用聚乙烯亞胺帶正電的特性吸附帶負電的質(zhì)粒載體，利用碳納米管長徑比很大的特性，刺破植物細胞壁，將外源載體導(dǎo)入到植物細胞內(nèi)[10]。利用聚乙烯亞胺修飾的碳納米管介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化在煙草、小麥、棉花上都已成功實現(xiàn)，在青花菜上還未有先例，本研究參照煙草試驗方法，探索該體系在檢測青花菜基因編輯效率上應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用青花菜品種是蘇青3號，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育而成，由筆者所在課題組保存;碳納米管購自于先豐納米材料科技有限公司，聚乙烯亞胺購自于Sigma-Aldrich。相關(guān)試驗于2019年10—12月在江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室進行。

1.2 sgRNA的設(shè)計與基因編輯載體的構(gòu)建

用CRISPR-p2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn）在線軟件對青花菜紫色相關(guān)基因BEE1（Bol030777）基因序列進行靶位點分析，選擇位于外顯子上、GC含量不低于50%、靠近基因編碼區(qū)5'端的序列作為靶位點[11];將候選的sgRNA與青花菜的基因組序列進行比對，淘汰脫靶率較高的sgRNA，設(shè)計的sgRNA序列如表1所示，并將人工合成的sgRNA序列連接到北京唯尚立德公司VK005-14質(zhì)粒載體上[12]。選擇測序結(jié)果一致的質(zhì)粒進行搖菌擴繁，質(zhì)粒提取步驟按照天根生化科技（北京）有限公司質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行，提取的質(zhì)粒濃度需達到1 000 ng/μL，濃度不夠則利用濃縮儀進行濃縮。

1.3 PEI-SWNT的制備

按照文獻[13-14]的方法制備PEI-SWNT。將1.3 mg干燥COOH-SWNTs加入50 mL錐形底離心管中，加入30 mL蒸餾水，超聲波浴處理獲得COOH-SWNT懸濁液，PEI與COOH-SWNTs共反應(yīng)獲得PEI-SWNT復(fù)合體。PEI與COOH-SWNTs按照1 ∶ 20的比例共反應(yīng)獲得PEI-SWNT復(fù)合體，將PEI-SWNT復(fù)合體轉(zhuǎn)移到100000-MWCO過濾器中。用無核酸酶的水洗滌PEI-SWNT溶液6次，將過量的PEI洗去。

1.4 基因編輯載體瞬時轉(zhuǎn)化青花菜葉片

準備MES輸送緩沖液（pH值=4.5～5.0）用于稀釋PEI-SWNT，以PEI-SWNT ∶ DNA（3 ∶ 1）的質(zhì)量比將500 ng PEI-SWNTs與167 ng質(zhì)粒DNA復(fù)合在一起，室溫下孵育30 min以形成DNA-PEI-SWNT復(fù)合物。將DNA-PEI-SWNT溶液吸入 1 mL 的無針注射器。在青花菜葉子背面用針尖刺穿，將注射器緩慢注射到青花菜的葉片中。在葉片上輕輕地標記入滲區(qū)域，1 d后質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA，2～3 d將mRNA翻譯為蛋白。

1.5 青花菜子葉中瞬時表達熒光蛋白檢測

將注射后的植株轉(zhuǎn)移到光培箱（光周期為白天16 h，27 ℃;夜晚8 h，22 ℃）進行培養(yǎng)。于注射后第3天（72 h）在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片是否有GFP熒光蛋白表達。

1.6 候選sgRNA基因編輯效率檢測

取青花菜葉片有GFP熒光表達部位的葉片，用CTAB法提取葉片的基因組DNA，根據(jù)編輯的基因序列設(shè)計包含編輯位點的引物進行PCR擴增（表2）。純化回收擴增后的PCR片段，連接T載體后進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，每個樣品挑取8個單克隆搖菌后PCR擴增測序。將測序結(jié)果與青花菜的基因序列進行比較，檢測基因位點是否被編輯，并計算編輯效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SWNT水分散液濃度和PEI-SWNT分散液濃度分析

通過對SWNT和PEI-SWNT濃度的測量表明SWNT水懸濁液的濃度為90.11 mg/L（建議濃度在100 mg/L左右），PEI-SWNT的濃度可以達到41.72 mg/L（表3），回收效率為46.3%。PEI-SWNT的濃度達到試驗要求。

2.2 青花菜葉片GFP熒光表達分析

利用熒光共聚焦顯微鏡觀察熒光標簽的表達情況，由圖1可見，注射碳納米管和質(zhì)粒的復(fù)合體的青花菜葉片可在共聚焦顯微鏡下觀察到綠色的熒光，說明GFP蛋白在注射后第3天已經(jīng)在葉片表達，通過此方法可以將外源基因?qū)氲角嗷ú说娜~面細胞中并完成外源基因的表達。本試驗成功注射32個葉片中有7個可以在熒光共聚焦下觀察到綠色熒光，占注射總數(shù)的21.9%。

2.3 青花菜CRISPR/Cas9系統(tǒng)候選sgRNA基因編輯結(jié)果

提取有GFP熒光蛋白表達的葉片DNA，用表2的引物擴增檢測有GFP熒光表達的青花菜基因組的序列，膠回收PCR產(chǎn)物，然后連接到T載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，將挑取的24個單克隆樣品搖菌后進行測序。測序的結(jié)果中有2個編號樣品的序列在基因編輯位點附近發(fā)生了基因突變，第5號樣品在B1編輯位點PAM附近檢測到3個堿基的缺失，第10號樣品檢測到B1編輯位點單堿基的突變（圖2），B2和B3編輯位點沒有檢測到基因突變。sgRNA在青花菜中的編輯效率為8.3%。

3 討論

基因編輯技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各類蔬菜的種質(zhì)資源創(chuàng)新中，sgRNA的編輯效率是影響基因編輯技術(shù)成敗的關(guān)鍵因素之一[15]，通過常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化方法對sgRNA有效性進行驗證比較耗時，且成本較高[12]。瞬時表達體系作為一種簡便高效的方法可用于快速驗證sgRNA的編輯效率，徐璇等利用柑橘的原生質(zhì)體成功實現(xiàn)了柑橘的瞬時轉(zhuǎn)化[16]，鄭天慧等利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法在擬南芥上實現(xiàn)了基因編輯并篩選出高效率的sgRNA序列。但通過原生質(zhì)體實現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)化的方法存在許多局限性，如試驗過程中材料容易被污染，對編輯效率的檢測難度大等。已有研究表明，PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化方法具有操作簡便、檢測周期短等優(yōu)點，能夠被用于驗證sgRNA的編輯效率。本研究探索了在青花菜上建立切實可行的瞬時轉(zhuǎn)化方法，該方法操作簡便、快速，可以方便快捷地驗證sgRNA的編輯效率。

本研究在已有研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化了試驗步驟，較大幅度提高了碳納米管分散液的濃度，利用PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在青花菜上實現(xiàn)了更加高效的瞬時轉(zhuǎn)化。試驗結(jié)果表明，SWNT水懸濁液的濃度可以達到90 mg/L以上，PEI-SWNT溶液的濃度可以達到41.72 mg/L，SWNT結(jié)合PEI后的回收率為46.3%，可以滿足試驗的需求;PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化體系可以將外源載體通過葉面注射的方法導(dǎo)入到青花菜的葉面細胞中。提取青花菜瞬時轉(zhuǎn)化部位葉片的基因組DNA，對編輯位點進行測序后發(fā)現(xiàn)有單堿基的突變和缺失，說明構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在青花菜上具有編輯能力。本試驗結(jié)果顯示由PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化體系可以完成對青花菜更加高效的瞬時轉(zhuǎn)化，本方法相較于其他瞬時轉(zhuǎn)化方法更簡單高效，且單次轉(zhuǎn)化成本可以降低到3美元。該方法為利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制青花菜的新種質(zhì)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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