4種血清型沙門氏菌多重PCR檢測方法建立及應(yīng)用

蔣玥 衣服德 許華 李貴陽 卜仕金

摘要：為檢測鑒別雞白痢、腸炎、鼠傷寒、傷寒4種養(yǎng)禽業(yè)中常見的沙門氏菌血清型，利用每種血清型的特異基因位點，建立多重PCR（polymerase chain reaction）檢測方法，并通過試驗對多重PCR法的特異性、靈敏度進行驗證。結(jié)果顯示，所建立的檢測方法特異性強，與非沙門氏菌無交叉反應(yīng)，靈敏度高。雞白痢沙門氏菌的最低檢測限度13.1 pg/mL，腸炎沙門氏菌最低檢測限度達12.5 pg/mL，鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌的最低檢測限度13.7 pg/mL，傷寒沙門氏菌最低檢測限度12.3 pg/mL。結(jié)果表明，此方法準確可靠、特異性強、靈敏度高，有望成為以后檢測沙門氏菌的有效工具。

關(guān)鍵詞：雞白痢沙門氏菌;腸炎沙門氏菌;鼠傷寒沙門氏菌;傷寒沙門氏菌;多重PCR

中圖分類號： S852.61 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0059-05

目前，已發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌血清型有2 000多種[1]。其中，雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌這幾種血清型的沙門氏菌在我國部分地區(qū)感染率較高[2]。有資料顯示這幾種血清型的沙門氏菌基因組相近[3]，想要檢測鑒別這幾種沙門氏菌血清型，可通過培養(yǎng)為前提的傳統(tǒng)檢測方法和分子生物學檢測方法[4]。傳統(tǒng)檢測方法包括平板上鑒別培養(yǎng)[5]，生化檢測以及血清分型等[3]。這些方法雖然結(jié)果清晰、準確，但是存在檢測時間長[5]、特異性差、操作過程繁瑣等缺點，不適用于大批量的臨床樣本檢測[6]。分子生物學檢測技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)PCR（polymeraze chain reaction）、恒溫核酸擴增技術(shù)、脈沖場凝膠電泳、基因探針技術(shù)等，本試驗用到的檢測技術(shù)是聚合酶反應(yīng)技術(shù)PCR中的多重PCR檢測技術(shù)[6]。

多重PCR檢測技術(shù)可以同時擴增多個目的片段，實現(xiàn)多通量的目的基因檢測。本研究用多重PCR檢測技術(shù)檢測鑒別雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌4種養(yǎng)禽業(yè)中常見的沙門氏菌血清型。這個技術(shù)相比沙門氏菌傳統(tǒng)的檢測方法既快速、高效，也簡單易操作[3-7]，并適用于規(guī)模化養(yǎng)殖中大量的樣本檢測。因此這個方法的建立能及時發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)的沙門氏菌感染，為沙門氏菌的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

細菌基因組核酸提取試劑盒（GB50）及試驗中所需的酶（IE-PME），均購自青島英賽特生物科技有限公司，引物由青島生工生物科技有限公司合成。樣本主要包括：腸炎沙門氏菌標準株CMCC（B）50071、鼠傷寒沙門氏菌標準菌株ATCC14028、傷寒沙門氏菌標準菌株CMCC（B）50071、雞白痢沙門氏菌陽性菌等（表1）。臨床樣品在2017年5月至2019年11月從山東各地采集，采集的沙門氏菌臨床樣品數(shù)為128份。

1.2 核酸模板提取

沙門氏菌的液體樣本用MH肉湯培養(yǎng)[8]。取 1 mL 菌液，按照基因組提取試劑盒的說明書，完成試驗所需不同沙門氏菌基因組DNA提取。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與條件優(yōu)化 從GenBank獲取沙門氏菌的基因序列，利用Bioedit軟件對序列進行比對，具體的引物序列信息見表2。由表2可知，以提取的腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的基因組DNA作為模板，用對應(yīng)的引物檢測。首先用每對引物分別對每個目的基因進行擴增，反應(yīng)體系為MIX 12.5 μL，每對引物上下游各0.5 μL，模板各1.0 μL，ddH2O 4.5 μL（總體系25.0 μL）。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 變性10 s，64 ℃退火90 s，循環(huán)30次。根據(jù)目的基因擴增結(jié)果，由表3可知，優(yōu)化多重反應(yīng)的引物濃度比例和溫度等條件，最終PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（121 V，20 min），每組試驗重復(fù)3次。

1.3.2 多重PCR特異性驗證 用腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌標準株、雞白痢沙門氏菌的陽性菌和金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、奇異變形桿菌、云南微球菌、副溶血弧菌基因組作為DNA模板，多重PCR反應(yīng)體系分別擴增這幾種菌。PCR的反應(yīng)體系為：MIX 12.5 μL，腸炎沙門氏菌上下游引物各0.7 μL;雞白痢沙門氏菌上下游引物各0.7 μL;傷寒沙門氏菌上下游引物各 0.5 μL，鼠傷寒沙門氏菌上下游引物各0.6 μL，H2O 3.0 μL（總體系25.0 μL）;反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s，64 ℃退火90 s，擴增循環(huán)數(shù)為30個循環(huán)。

1.3.3 多重PCR靈敏性檢測 ?對涉及的核酸基因組DNA，分別進行10～106倍的梯度稀釋，將稀釋的核酸基因DNA放入配制好的多重PCR反應(yīng)體系，分析擴增出的多重敏感性試驗結(jié)果圖，并分析得出方法的最低檢測限。

1.4 臨床樣本的應(yīng)用

將山東各地采集的128份沙門氏菌臨床樣本，接種到蛋白胨緩沖水中37 ℃培養(yǎng)24 h[5]。利用建好的多重PCR方法對128份沙門氏菌臨床樣本進行檢測。

1.5 多重PCR方法準確性驗證

采用單一PCR法對沙門氏菌臨床樣本進行檢測，將得到的檢測結(jié)果與多重PCR法的檢測結(jié)果進行比較，從而驗證本試驗方法的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重模板PCR擴增結(jié)果

使用相對應(yīng)的引物分別對4種沙門氏菌進行擴增。由圖1可知，擴增后的DNA片段大小和預(yù)期結(jié)果完全一致，證明了各組引物對靶基因檢測的可行性。

2.2 多重PCR方法建立及條件優(yōu)化

在單重模板擴增試驗結(jié)果的的基礎(chǔ)上，對多重PCR方法可行性進行驗證。由圖2可知，試驗條帶與目的條帶大小一致，由此證明該方法對4種目的基因檢測的可行性。為實現(xiàn)各個目的條帶檢測效率最佳，本試驗對各組引物濃度和溫度的條件進行優(yōu)化，由圖3和圖4可分析得出，腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌最佳的上下游引物濃度分別是0.28、0.28、0.20、0.24 μmol/L。最終的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性10 s，64 ℃退火90 s，擴增循環(huán)數(shù)為30個循環(huán)。

2.3 多重PCR特異性和敏感性試驗結(jié)果

在最佳的引物比例條件下，對本試驗所建多重PCR方法的特異性進行驗證。由圖5可知， 只有鼠傷寒沙門氏菌+腸炎沙門氏菌+傷寒沙門氏菌+雞白痢沙門氏菌的混合模板DNA及鼠傷寒沙門氏菌DNA、腸炎沙門氏菌DNA、傷寒沙門氏菌DNA、雞白痢沙門氏菌DNA出現(xiàn)條帶，而非沙門氏菌的基因DNA不發(fā)生擴增反應(yīng)，證明了該方法具有較強的特異性，可以實現(xiàn)沙門氏菌復(fù)雜血清型的分離分辨。由圖6可知，多重PCR反應(yīng)體系對混合模板DNA的最低檢測限分別是：雞白痢沙門氏菌 13.1 pg/mL;腸炎沙門氏菌 12.5 pg/mL;鼠傷寒沙門氏菌13.7 pg/mL;傷寒沙門氏菌12.3 pg/mL。因此，在檢測過程中只需要少量的臨床組織病料樣品即可檢測出是否感染相關(guān)的沙門氏菌血清型。

2.4 臨床樣本檢測結(jié)果

利用建好的多重PCR法對128份沙門氏菌陽性樣本進行鑒定，部分臨床樣本檢測結(jié)果見圖7，檢測出腸炎沙門氏菌78.0%，雞白痢沙門氏菌3.9%，傷寒沙門氏菌0.8%，鼠傷寒沙門氏菌1.6%，其他占15.7%。

2.5 多重PCR準確性驗證結(jié)果

單重PCR法對沙門氏菌臨床樣本進行擴增，結(jié)果見圖8至圖11。對2種方法的檢測結(jié)果進行比較（表4），可以看出2種檢測方法的結(jié)果完全一致。因此，本試驗所用的多重PCR檢測法準確性較高。

3 討論

沙門氏菌可導(dǎo)致人畜共患的細菌性疾病。禽類感染沙門氏菌后不但對自身健康造成影響，使得生產(chǎn)力下降;還會通過禽類食品傳播給人[9]，要想控制沙門氏菌，建立有效檢測方法是很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。有研究報道，雞白痢、腸炎、傷寒及鼠傷寒這4種沙門氏菌血清型不但常見多發(fā)且對養(yǎng)殖業(yè)危害較大[2]。因此，建立相關(guān)沙門氏菌的檢測鑒別方法具有實際應(yīng)用意義。

PCR檢測沙門氏菌具有簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，特別是多重PCR檢測技術(shù)，相比普通的單重PCR，可實現(xiàn)多通量的靶基因檢測[10]。目前，沙門氏菌血清型的檢測大多數(shù)是基于三重PCR檢測技術(shù)，而四重PCR法鑒別沙門氏菌血清型的報道卻相對較少。龔建森在禽源沙門氏菌的分析篩選研究報道中，利用三重PCR法鑒別腸炎、傷寒、鼠傷寒沙門氏菌[11]。而本研究則是采用四重PCR法鑒別雞白痢、腸炎、傷寒以及鼠傷寒這4種沙門氏菌。

在李紅等關(guān)于禽沙門氏菌多重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用的研究過程中，證實了多重PCR檢測技術(shù)具有特異性好、準確性高、靈敏度強的特點[5]。本試驗的結(jié)果也同樣驗證了此方法具備這些優(yōu)點。因而，本試驗的檢測方法可完成實驗室和規(guī)?；B(yǎng)殖場對沙門氏菌的檢測鑒別。

但多重PCR技術(shù)也有不足之處，如會對試驗結(jié)果產(chǎn)生消極影響的引物二聚體、各組引物擴增效率不一樣[12]等問題。想要解決這些問題，讓多重PCR檢測技術(shù)更好地應(yīng)用于各種病原體的檢測，是日后試驗研究的重點。

4 結(jié)論

本研究建立了一種檢測鑒別雞白痢、腸炎、鼠傷寒、傷寒這4種沙門氏菌的多重PCR檢測方法，用于篩查實際生產(chǎn)中出現(xiàn)的這4種沙門氏菌。通過試驗表明，此方法具備準確可靠、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，可完成實際生產(chǎn)中相關(guān)沙門氏菌的監(jiān)測。

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