劍葉龍血樹內生真菌的分離及體外抑菌活性篩選

趙玉瑛 黃之鐠 張瓊 趙慶 柏葉濤 張曉梅

摘 要： 為研究劍葉龍血樹內生真菌資源多樣性，初步探討和篩選具有抑菌活性的特異性菌株以及進一步開發(fā)劍葉龍血樹內生真菌的抗菌活性化合物。該文采用植物組織分離法從劍葉龍血樹莖和葉中分離內生真菌，對內生真菌進行液體發(fā)酵7 d，經乙酸乙酯萃取后制得粗提物，并采用牛津杯擴散法，以10種常見病原菌和5種臨床耐藥菌為靶標檢測其發(fā)酵粗提物的抑菌活性，對有較好抑菌活性的內生真菌進行分子鑒定。結果表明：（1）從劍葉龍血樹莖、葉中共分離得到345株內生真菌，294株對一種以上指示菌有抑制活性;（2）其中84株內生真菌對5株臨床耐藥菌均有不同程度的抑制活性，占所分離菌株總數(shù)的24.35%，75%的內生真菌對金黃色葡萄球菌有抑制活性。這說明劍葉龍血樹中存在多種有抑菌活性的內生真菌，為劍葉龍血樹內生菌抗菌活性成分挖掘及新型抗菌藥物篩選奠定了基礎。

關鍵詞： 劍葉龍血樹， 內生真菌， 分離， 抗菌活性， 真菌鑒定

中圖分類號： Q939.9 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1126-09

Abstract： To explore the resource diversity and antimicrobial capability of endophytic fungi from the endangered Dracaena cochinchinensis， and mine novel antimicrobial secondary metabolites from talent strains， endophytic fungi were isolated from stem and leaf tissues of D. cochinchinensis. All isolated strains were cultured in liquid media for seven days， the culture media were extracted with ethyl acetate and then used to estimate the antimicrobial activities against 10 pathogenic bacteria and 5 drug-resistance pathogens by using the oxford-cup test. The results were as follows：（1）345 strains were isolated and 294 of which displayed antimicrobial activities against more than one pathogen;（2）Among them， 84 endophytes（accounted for 24.35%） displayed potent inhibition against 5 drug-resistance pathogens to very degrees and 75% endophytes displayed obvious inhibition against Staphylococcus aureus. Accordingly， 40 talent strains were selected and identified to 32 species by phylogenetic analysis based on ITS sequencing. This study indicated that diverse endophytic fungi with strong antimicrobial activities inhabiting in D. cochinchinensis， which could be potential for developing antimicrobial reagents.

Key words： Dracaena cochinchinensis， endophytic fungi， isolation， antimicrobial activities， fungal identification

抗菌藥物的出現(xiàn)給感染性疾病的治療帶來了很大改變，為挽救人類生命做出了很大貢獻，但同時也加快了病原菌耐藥性形成的速度及多重耐藥菌的出現(xiàn)（Schmalstieg et al.， 2012;Lewis，2012），如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。目前，抗菌藥物開發(fā)上市的速度遠遠趕不上病原菌耐藥性發(fā)展的速度，這就使得尋找新作用機制或新活性的化合物來開發(fā)藥物成為迫切需要。從自然界尋找抗菌成分（尤其是抗耐藥菌成分），逐漸成為抗菌藥物研發(fā)的一個重要方面。而普通環(huán)境中的微生物作為樣本被反復研究和開發(fā)，化合物挖掘重復率越來越高。因此，越來越多的研究者把目光投向了特殊環(huán)境微生物。

生活在健康的植物組織中，而不會引起宿主植物組織病害癥狀的真菌稱為內生真菌，其廣泛存在于不同種類的植物組織內（Tanaka et al.， 2002）。植物內生菌是重要的微生物資源，尤其是一些內生真菌在進化過程中能產生與宿主結構相同或相似的活性代謝產物如鬼臼素、長春堿、紫杉醇和姜黃素等（Stierle et al.， 1993;張玲琪等，2000;彭清忠等，2010;王婷等，2017），這就意味著從植物內生真菌中挖掘到與宿主植物相同或相似化學成分的潛力極大。由于生存環(huán)境的特殊性，因此，使得植物內生真菌具有產生結構豐富多樣的活性代謝產物的能力。目前，已從植物內生真菌的代謝產物中分離得到生物堿類、甾體類、黃酮類、多肽類、萜類、環(huán)肽類等多種類型的化合物，這些不同類型的化合物具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒及酶抑制等多種生物活性（肖支葉等，2018）。由于這些化合物具有開發(fā)成抗菌藥物的潛力，因此廣泛從內生真菌中分離和篩選具有抗菌活性的化合物，可以為新型抗菌藥物的研發(fā)提供前期實驗基礎，進而改善日益嚴重的病原菌耐藥性問題。

劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis）系百合科（Liliaceae）龍血樹屬（Dracaena Vand. ex L.）常綠喬木，在我國主要分布于云南、廣西。劍葉龍血樹樹脂是提取中藥要藥“龍血竭”的原料，在活血化瘀、斂瘡止血等方面具有較強的療效，藥效主要成分為龍血素A和龍血素B（蔡希陶和許再富，1979）。由于劍葉龍血樹生長環(huán)境惡劣，生長緩慢且產量較低，采集龍血竭入藥使得野生資源面臨著枯竭的威脅，現(xiàn)已被列為國家二級保護植物。為合理利用劍葉龍血樹資源，雖然近年來對劍葉龍血樹主成分的抗氧化活性、結血誘導劑的篩選、疏松愈傷組織誘導等方面進行了研究（周艷林等，2015;韋瑩等，2016;陳乾平等，2018），但對劍葉龍血樹內生真菌抗菌活性的研究卻鮮有報道。本研究針對此現(xiàn)象進行了以下研究：對劍葉龍血樹內生真菌進行了分離及其抑菌活性研究，以期獲得具有抗菌活性的特異性菌株;為下一步從抑菌活性菌株中挖掘活性成分奠定基礎;為劍葉龍血樹的綜合利用、新藥開發(fā)提供前期實驗研究基礎;也為解決傳統(tǒng)民族藥用植物資源緊缺提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 藥材 劍葉龍血樹莖、葉于2016年1月采自云南省西雙版納勐臘縣勐侖鎮(zhèn)（樣品編號為B）、云南省熱帶作物科學研究所-西雙版納熱帶花卉園（樣品編號RJ為莖、RY為葉），采集時，戴上無菌手套用無菌工具將劍葉龍血樹健康的莖、葉采集后放入無菌的容器內，4 ℃保存?zhèn)溆谩２牧嫌刹軙D博士提供和鑒定。

1.1.2 儀器和試劑 儀器：GR-200 分析天平，廣州艾欣科學儀器有限公司;ES-315 高壓蒸汽滅菌鍋，TOMY 公司;恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司;LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司;N-1100 旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，AIRTECH 公司;電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;培養(yǎng)基配料等常用試劑耗材均購自雅云生物科技有限公司。試劑：蒸餾水，無水乙醇、甲醇、冰乙酸、乙酸乙酯、丙酮等均為分析純，通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他：柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒從生工生物工程（上海）股份有限公司購買。

1.1.3 指示菌 大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PA01）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium χ 8956）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia ATCC 13883）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus 1029）、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis 1037）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii ATCC 19606）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis ATCC 29212）、3株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA 1-3）、2株白色念珠菌的臨床耐藥菌（Drug-resistant Candida albicans 1-2）。以上供試菌株均由課題組前期研究保存。

1.1.4 培養(yǎng)基 病原細菌培養(yǎng)基 LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，水1 L，pH 7.2～7.6。

真菌培養(yǎng)基 （1）沙保氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂15 g，水1 L，pH 6.0;（2）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g （煮沸20 min 后過濾，棄渣取汁），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 L，pH 6.0～7.0;（3）PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g （煮沸20 min 后過濾，棄渣取汁），葡萄糖20 g，水1 L，pH 6.0～7.0。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離與純化 將植物樣本在流水洗凈后，選擇沒有破損的葉片和莖，切成2 cm左右的小塊（段、片），在50%乙醇中浸泡1 min 后置于75%乙醇中1 min;根使用0.10% HgCl2處理11 min，莖使用0.10% HgCl2處理7 min，葉使用2%的NaClO處理5 min 進行表面消毒，無菌水沖洗3～5次。將材料切成0.5 cm 左右的小塊并將切口面接入PDA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)，待組織邊緣長出真菌菌絲，挑取菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)進行反復純化后，根據(jù)菌落形態(tài)、菌絲長勢及產色素情況進行菌株去重復。同時，取最后一次洗滌植物材料的無菌水0.2 mL涂布PDA培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)一周觀察無菌絲生長證明表面消毒成功，所分離菌株為植物內生菌（楊明俊等，2014;侯曉群等，2015）。將純化去重復所得菌株每株接種3～5只PDA斜面，4 ℃保存，詳細記錄每株菌的分離源及其在固體和液體培養(yǎng)基中的形態(tài)、顏色和長勢等信息，建立劍葉龍血樹內生真菌菌種庫。

1.2.2 優(yōu)勢菌株的篩選 內生真菌在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，采用牛津杯擴散法對發(fā)酵粗提物進行體外抑菌活性檢測，并結合TLC結果及產量，篩選出優(yōu)勢菌株。

菌株發(fā)酵及提?。禾羧〗浕罨膬壬婢z或孢子接種于100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，記錄真菌的長勢、形態(tài)、顏色等特征，加入等體積的乙酸乙酯浸泡過夜后超聲提取3次，提取液減壓濃縮回收溶劑，用有機溶劑將樣品轉移至棕色樣品瓶保存，溶劑揮干后稱取質量。

抑菌活性檢測：病原細菌接種至液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1黑暗培養(yǎng)12 h，白色念珠菌接種至液體沙保氏培養(yǎng)基28 ℃、200 r·min-1黑暗培養(yǎng)24 h，用液體培養(yǎng)基將各菌液分別稀釋至1×106～1×107cfu·mL-1備用。

采用牛津杯擴散法（邵穎等，2012）對各菌株的發(fā)酵粗提物進行抑菌實驗，將稀釋后的指示菌菌液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。用丙酮溶解粗提物至質量濃度為20 mg·mL-1，分別取50 μL進行活性檢測，以50 μL丙酮做空白對照，以等體積的抗生素做陽性對照（病原細菌以5 μg萬古霉素為陽性對照，白色念珠菌以20 μg 兩性霉素B為陽性對照）。白色念珠菌28 ℃培養(yǎng)，其余病原細菌于37 ℃培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.3化學多樣性檢測 采用薄層層析色譜法檢測內生真菌化學多樣性。取一定量樣品加入適量的甲醇溶液，制備成5 mg·mL-1的樣品，超聲振蕩30 min后，用0.45 μm濾膜濾過。用微量點樣器吸取適量樣品，于GF254硅膠板（5 cm × 10 cm）上點樣后，以氯仿∶甲醇=10∶1為展開劑展開，當所有樣品展開高度達到4 cm時，將薄層板移出晾干，觀察、標記色譜結果。以各種顯色條件下條帶/斑點數(shù)較多，顯色特異的樣品對應的菌株記為化學多樣性好的菌株。

1.2.4 優(yōu)勢菌株的分子鑒定 挑選抑制活性強且化學多樣性豐富的菌株培養(yǎng)3 d后，刮取菌絲50～100 mg，采用柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取真菌總DNA，用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行ITS區(qū)域擴增。PCR反應體系50 μL：TSINGKE Master Mix 25 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 21 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min，進入循環(huán)，94 ℃變性1 min，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸 8 min（侯曉強等，2015）。擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

根據(jù)測序結果，進行NCBI/BLAST比對，搜索同源序列，選出與該序列相關性較高的核酸序列，進行多序列比對分析，采用MEGA 6.0（NJ法）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（楊明俊等，2014）。

2 結果與分析

2.1 劍葉龍血樹內生真菌的分離

從三份劍葉龍血樹植物樣品中共分離得到345株內生真菌。其中勐侖鎮(zhèn)采集的葉片材料分離得到152株，編號為B1-152，占總數(shù)的44.05%;從熱帶花卉園采集的莖中分離得到100株，編號為RJ1-100，占總數(shù)的28.99%，葉中分離得到93株，編號為RY1-93，占總數(shù)的26.96%。可見傣藥劍葉龍血樹中蘊藏著豐富的內生真菌資源。

2.2 優(yōu)勢菌株的篩選

對分離自劍葉龍血樹的345株內生真菌進行抗病原細菌、抗病原真菌、化學多樣性及產量研究，擬篩選出兼具多種抗菌活性，且化學多樣性豐富、產量較高的優(yōu)勢菌株。篩選結果表明，分離自云南省西雙版納勐臘縣勐侖鎮(zhèn)劍葉龍血樹的菌株（樣品編號為B），其發(fā)酵產物在各種顯色條件下條帶/斑點數(shù)最多，預示著有豐富的代謝產物，且有109株菌（71.71%）對一種以上指示菌有抑制活性;分離自云南省熱帶作物科學研究所-西雙版納熱帶花卉園的劍葉龍血樹莖部的菌株（樣品編號為RJ）抗菌活性最好，抗菌譜最廣，所有菌株對至少一種指示菌有抑制活性;分離自云南省熱帶作物科學研究所-西雙版納熱帶花卉園的劍葉龍血樹葉部的菌株（樣品編號為RY）產量最高，抗菌活性較好，有80株菌（86.02%）對一種以上指示菌有抑制活性。在所有分離到的內生真菌中，對金黃色葡萄球菌和恥垢分支桿菌有抑制效果的內生真菌數(shù)量最多，分別占總數(shù)的75.5%和62.61%。不同來源的內生真菌對15株病原指示菌的抑制活性如表1所示。

結合內生真菌發(fā)酵粗提物體外抑菌活性和TLC檢測結果，篩選到多株活性強且化學多樣性豐富的優(yōu)勢菌株，綜合結果較好的前10株菌的發(fā)酵提取物對15株病原菌的體外抑菌活性結果見表2。圖1為部分菌株對大腸桿菌、恥垢分支桿菌、MRSA 1和MRSA 2抑制作用效果。圖2為優(yōu)勢菌株的發(fā)酵粗提物的TLC檢測結果，從上到下依次為紫外254 nm、365 nm、碘、硫酸乙醇下顯色，各份樣品在在各種顯色條件下條帶/斑點數(shù)較多，顯色特異，初步判斷其化學多樣性豐富，具有挖掘新穎化合物的潛力。

2.3 優(yōu)勢菌株的分子鑒定

結合體外抑菌活性評價、TLC篩選和代謝產物產量，選擇抑菌譜廣、活性較強、化學多樣性豐富且產量高的40株內生真菌進行ITS分子鑒定。測序結果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST相似性比較。比對結果顯示這些菌株分屬于柱銹菌屬（Diaporthe）、鐮刀菌屬（Fusarium）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、輪層炭殼菌屬（Daldinia）、帚梗柱孢屬（Cylindrocladium）、炭角菌屬（Xylaria）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、擬莖點霉屬（Phomopsis）、叢赤殼屬（Nectria）、黑孢屬（Nigrospora）、黑團孢屬（Periconia）、枝孢屬（Cladosporium）、暗球腔菌屬（Phaeosphaeria）、Acrocalymma 14個屬的30個種以及糞殼菌綱（Sordariomycetes）和格孢腔菌目（Pleosporales）的2個物種。菌株B-132、RY-44、RJ-34、B-150、B-76、RJ-44、B-143、RY-15分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中標準菌株Cladosporium sp. （JQ388271）、Xylaria sp. （JQ341078）、Acrocalymma sp. （KU747920）、Phaeosphaeria papaya （KT224848）、Nigrospora sp. （FJ527872）、Sordariomycetes sp. （HQ130707）、Periconia sp. （MK367489）、Pestalotiopsis sp. （MH445915）相似性為100%，其余菌株與其最相近菌株的相似性在95%～99%之間。在40株活性菌株中，鐮刀菌屬6株、輪層炭殼菌屬5株、炭疽菌屬5株和柱銹菌屬5株，4個屬物種超過所選物種50%，為劍葉龍血樹活性內生真菌的優(yōu)勢種群（表3，圖3）。

3 討論與結論

本實驗獲得的40株優(yōu)勢菌株經ITS分子類鑒定，歸于32個物種，其中部分活性內生真菌的親緣菌屬已有抗菌、抗腫瘤等活性化合物的報道，如與B-152同屬的黃花蒿內生真菌Colletotrichum sp.產生的colletotricacid對真菌具有很強的抑制作用（Lu et al.， 2000）;與RJ-27同屬的紅樹尖瓣海蓮內生真菌（Phomopsis longicolla HL-2232）能產生具有抗菌活性的生物堿類化合物 2-（2′S-羥丙基）-5-甲基-7-羥基對氧萘酮（宋鑫明等，2015）;本實驗所獲優(yōu)勢菌屬鐮刀菌屬真菌能產生多種具有抗菌活性的次生代謝產物類型（Kyekyeku et al.， 2017;Liu et al.， 2019）。由此可見，劍葉龍血樹抑菌活性內生真菌具有產生多種抑菌活性物質的潛力，值得進行下一步活性代謝產物挖掘。同時，我們還從劍葉龍血樹中分離到Acrocalymma sp.（RJ-34），該菌株對15株病原指示菌均有較好的抑制活性，對3株MRSA的抑菌效果較為突出，且化學多樣性豐富，但這個屬物種迄今均未有次生代謝產物研究報道，可以大膽推測從中發(fā)現(xiàn)新穎抗菌活性成分的幾率較大，并將其列為優(yōu)先進行活性代謝產物挖掘的對象。

研究表明，一些內生真菌在與宿主植物協(xié)同進化過程中，能產生與宿主植物相同或相似的活性代謝產物，因此，在化學多樣性檢測實驗中，加入了“龍血竭”的主要成分龍血素A和龍血素B作為對照，期望能找到這樣的特異性菌株，為劍葉龍血樹資源的保護提供新的途徑。但是未能找到，可能的原因有以下兩點：其一，發(fā)酵液中的目的產物量少，未能檢測出來，在今后的實驗中可以加大發(fā)酵量，并采用更加靈敏的檢測手段（如高效液相）;其二，內生真菌的分離和培養(yǎng)通常采用PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)，而有些內生真菌并不適合在此條件下培養(yǎng)而導致沒有被分離出來，即使采用多種培養(yǎng)基對植物組織進行培養(yǎng)也并不能保證植物組織內的內生真菌被全部分離出來，所以最重要的還是要建立與宿主植物內環(huán)境類似的生態(tài)模型，才能真實反映植物內生菌的生物學特征。

綜上所述，劍葉龍血樹中廣泛分布具有抗菌活性的菌株，篩選出的優(yōu)勢菌株具有較好的抑菌活性、產量高、化學多樣性豐富，且菌種穩(wěn)定易培養(yǎng)，具有巨大的開發(fā)潛能，部分菌株活性代謝產物的挖掘工作正在積極進行中。

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（責任編輯 周翠鳴）