蘋果渣乙醇提取物抗菌活性及防腐作用研究

張華玲 韓靜 劉緒 蒲柳 管媛媛 段潔瑩

摘 要： 為提高蘋果渣資源利用率，探究蘋果渣乙醇提取物的抗菌活性和防腐性能，該文采用微波輔助提取法制取蘋果渣乙醇提取物，用抑菌圈實驗測定其抗菌活性，并研究了其防腐作用。結(jié)果表明：（1）蘋果渣乙醇提取物對酵母菌抑制作用不明顯（抑菌圈直徑<1 mm），對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用較明顯（抑菌圈直徑為6～9 mm），最佳抑菌濃度為4.0 g·L-1。（2）pH值和鹽濃度對其抑菌效果有影響，pH值為6～7，鹽濃度為5.0 g·L-1，抑菌效果最好。（3）對百香果有較好的保鮮防腐效果，最佳使用濃度為0.2%。在該濃度下貯藏后的百香果腐爛率為6.7%（對照組為67%），失重率為5.5%（對照組為36.3%），可溶性固形物、總酸含量均與貯藏前差異不顯著（P> 0.05）（對照組P< 0.05），且果實較飽滿，硬度較高，鮮艷有光澤，酸甜適中。綜上所述，蘋果渣乙醇提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用，對百香果的保鮮防腐效果佳，可應(yīng)用到天然食品的保鮮防腐。

關(guān)鍵詞： 蘋果渣， 乙醇提取物， 百香果， 抗菌活性， 防腐作用

中圖分類號： TS209 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1181-07

Abstract： In order to improve the utilization of apple pomace resources， verify the antibacterial activity and antiseptic properties of the ethanol extract of apple pomace， the antibacterial activity of extract from apple pomace were determined by the inhibition zone test. In addition， the antibacterial effect of the extract under different pH and salt concentration had been studied. At the same time， the ethanol extract of apple pomace was applied to the preservation of Passiflora edulia， using sensory scores and various physical and chemical indicators （Vc， soluble solids， total acid， solid acid ratio） as the basis to investigate the antiseptic effect of the extract. The results were as follows： （1） The ethanol extract of apple pomace had no obvious inhibitory effect on yeasts （diameter of inhibition zone <1 mm）， but it had obvious inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Escherichia coli （diameter of inhibition zone was 6-9 mm）. （2） The best inhibitory concentration for these strains was 4.0 g·L-1. In addition， when the antibacterial effect of the extract was optimal， the pH was 6-7 and the salt concentration was 5.0 g·L-1. （3） The optimal concentration for Passiflora edulia was 0.2%， and the rot rate after storage at this concentration was only 6.7% （control group was 67%）， and the weight loss rate was 5.5% （control group was 36.3%）. The soluble solids and total acid content were not significantly different from those before storage （P>0.05） （control group P<0.05）. And most of the fruits were plump， firm， bright and shiny， moderately sweet and sour. The antibacterial extract of apple pomace has antibacterial activity and significant antiseptic effect， and provides a theoretical basis for the development and utilization of apple pomace resources.

Key words： apple pomace， ethanol extracts， Passiflora edulia， antibacterial activity， antiseptic effect

目前中國已成為世界上蘋果（Malus domestica）產(chǎn)量最多的國家。但是蘋果渣的利用率非常低，更多被當(dāng)作廢物處理，造成資源浪費和環(huán)境污染。每1 000 t蘋果中約有200 t蘋果渣。因此，蘋果渣的加工潛力巨大。新鮮蘋果渣含水量為74%～90%，蘋果渣經(jīng)過干燥后約有55 t可利用。因此，蘋果渣再利用問題已經(jīng)成為一個亟待解決的問題（劉永清等，2015）。

蘋果渣中的干物質(zhì)主要是粗蛋白、粗脂肪、粗纖維，以及多糖、酚類、黃酮等活性物質(zhì)，具有較大的開發(fā)利用價值（楊福有等，2000;東莎莎，2017）?，F(xiàn)有研究主要利用蘋果渣制備多糖（房斐等，2019），提取纖維素（陳雪峰等，2018）、多酚（田莉等，2017），以及作為畜禽飼料開發(fā)（靳文廣等， 2018）等。相關(guān)研究表明蘋果渣提取物具有良好的抑菌作用。董彩文等（2008）從蘋果渣中提取的黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果;單靜敏等（2011）從蘋果中提取原花青素，證實其對變形鏈球菌、金黃色葡萄球菌都有抑制作用;周春娣（2014）的研究發(fā)現(xiàn)蘋果渣多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌顯示了不同程度的抑制作用。此外，有研究表明蘋果渣提取物具有抗氧化性、清除自由基的特性。李珍（2014）的研究表明蘋果皮渣多酚對ABTS自由基、DPPH·自由基、超氧陰離子自由基均有較強的清除作用，對Fe3+具有顯著的還原能力;盧藝惠等（2020）證實了從蘋果籽殼中提取的色素對DPPH·自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基有較好的清除能力;陳文超（2017）的研究表明蘋果渣的低聚糖提取液也有一定的DPPH·、羥基自由基的清除能力。上述研究表明了蘋果渣提取物具有良好的抑菌和抗氧化的作用，在醫(yī)藥及功能性食品開發(fā)方面為蘋果渣的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。微生物大量滋生和氧化反應(yīng)也是引起食物腐爛變質(zhì)的重要因素，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌也是腐敗食物中常見的菌群，而上述研究揭示了蘋果渣提取物有用于食物防腐的可能。蘋果渣提取物是否能用于食物防腐，特別是易腐爛水果上的應(yīng)用還鮮有報道，其抑菌效果是否能達(dá)到防腐的要求，這一問題尚需深入研究和證實。

為了解決蘋果渣資源浪費的問題，以及探究蘋果渣乙醇提取物的抗菌活性和在天然食品上的實際保鮮防腐作用，本研究采用微波輔助法提取蘋果渣乙醇提取物，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌為指示菌，研究了蘋果渣乙醇提取物抗菌活性和較優(yōu)抑菌條件;以熱帶水果百香果（Passiflora edulia）為實驗對象，研究蘋果渣乙醇提取物的實際防腐作用，為利用蘋果渣開發(fā)新型天然食品防腐劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器、設(shè)備

材料：新鮮紅富士蘋果，市售;新鮮紅皮百香果，采購于廣西靖西縣百香百味鋪。

檢測菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、酵母菌（Yeast），均由成都師范學(xué)院實驗室提供。材料與菌種均由成都師范學(xué)院劉緒副教授鑒定。

主要試劑：鎢酸鈉、鉬硫酸鋰為國產(chǎn)分析純;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（五峰赤誠生物科技股份有限公司）。

主要設(shè)備：5100B型紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;RM50型折光率儀（上海昊擴科技有限公司）;WI27740型自動滴定儀（北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蘋果渣乙醇提取液的制備 榨汁后的蘋果渣壓片置于干燥箱（120 ℃，10 h）烘干備用，每次稱取5.00 g蘋果渣片于破碎機中破碎，置于100 mL三角瓶中加入正己烷浸泡24 h，陰干后，按料液比1∶30（g·mL-1）加入60%乙醇溶液，微波功率700 W提取70 s后，真空吸濾2 h（Escarpa & Gonzalez， 1998），收集成品溶液。

1.2.2 蘋果渣乙醇提取物抑菌性測定 接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌于試管中培養(yǎng)后，加入10 mL無菌水充分震蕩洗滌，制成菌懸液備用（梁峙，1998）。將濾紙打成直徑為6 mm濾紙片滅菌后備用。將蘋果渣乙醇提取物干燥，并配制成10 g·L-1樣品溶液備用。

1.2.3 蘋果渣乙醇提取物抗菌活性實驗設(shè)計

1.2.3.1 抑菌圈直徑的測定 在培養(yǎng)基中加入100 μL的菌懸液，均勻涂抹，分別制成含有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的平板，對照組加入等量無菌水。在37 ℃和28 ℃恒溫下，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24 h，酵母菌培養(yǎng)48 h，用直尺測定抑菌圈直徑。

1.2.3.2 抑菌性分析 將蘋果渣乙醇提取物稀釋成濃度為0.5、2.0、5.0、8.0 g·L-1 的溶液，將已殺菌烘干的6 mm圓形濾紙片放入蘋果渣乙醇提取物2 min，撈出瀝干后貼在含菌平板。在37 ℃和28 ℃恒溫下，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24 h，酵母菌培養(yǎng)48 h，測定抑菌直徑（唐傳核和彭志英，2001），重復(fù)3次，以無菌水為對照。

1.2.3.3 最佳抑菌濃度實驗 蘋果渣乙醇提取物的濃度為3、4、5、6、7 g·L-1 ，處理方法同抑菌性分析，測定抑菌圈直徑。

1.2.3.4 pH值對蘋果渣乙醇提取物抑菌活性影響 將蘋果渣乙醇提取物用鹽酸和氫氧化鈉梯度調(diào)配成pH值為4、5、6、7、8，方法同抑菌性分析，測定抑菌圈直徑。

1.2.3.5 鹽濃度對蘋果渣乙醇提取物抑菌活性影響 用氯化鈉將蘋果渣乙醇提取物調(diào)制成濃度分別為1、3、5、7、9 g·L-1 鹽溶液，方法同抑菌性分析，測定抑菌圈直徑（Lu & Foo， 2000）。

1.2.4 蘋果渣乙醇提取物防腐作用測定 取同等數(shù)量的百香果，稱取與其質(zhì)量相應(yīng)的0.1%、0.2%、0.3%的蘋果渣乙醇提取物，配制成50 mL溶液，離心備用。將上述蘋果渣乙醇提取物溶液均勻涂抹在百香果表面，再設(shè)置一組空白對照組（不做任何處理的百香果）。套上保鮮膜，自然風(fēng)干，放于同一環(huán)境下（溫度19～21 ℃，濕度55%～65%）進(jìn)行培養(yǎng)觀察。每個實驗組處理6盒，每盒5個，做好標(biāo)記（空白組：01-06;蘋果渣乙醇提取物組：11-16、21-26、31-36）。仔細(xì)觀察百香果的感官品質(zhì)（顏色、大小、氣味等）。分析不同保鮮條件下百香果的理化指標(biāo)數(shù)值變化及感官品質(zhì)變化。感官品質(zhì)評價由10名專業(yè)感官評價員完成;失重率用電子分析天平測定;腐爛率由統(tǒng)計結(jié)果計算;VC含量采用紫外分光光度法測定（馬宏飛等，2012）;可溶性固形物采用折光率儀測定;總酸度采用酸堿滴定法測定（自動滴定儀）;固酸比為可溶性固形物值與總酸度的比值。

1.3 實驗數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)進(jìn)行3次，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA LSD法（最小顯著差數(shù)法）處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，P<0.01為極顯著，P<0.05為顯著，P>0.05為不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果渣乙醇提取物抑菌性結(jié)果

2.1.1 抑菌性實驗 蘋果渣乙醇提取物的抑菌作用可以根據(jù)抑菌圈的直徑來判斷抑菌量與抑菌強度是否呈正相關(guān)（張杰等，1996）。由表1可知，蘋果渣多酚提取物對酵母沒有明顯的抑菌作用，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用。隨著蘋果渣乙醇提取物含量濃度的增加，抑菌強度增大，大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑為0.84 cm，金黃色葡萄球菌為0.65 cm。

2.1.2 最佳抑菌濃度實驗 由圖1可知，當(dāng)蘋果渣乙醇提取物濃度為4.0 g·L-1時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都達(dá)到最大，之后隨著提取物濃度的增加，對金黃色葡萄球菌抑菌性呈減小趨勢，而對大腸桿菌的抑制作用變化不明顯。方差分析結(jié)果顯示，不同濃度蘋果渣乙醇提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果有顯著差異（F> F0.05（4，4） ，P<0.05）。

2.1.3 pH值對蘋果渣乙醇提取液抑菌活性影響 由圖2可知，在中性偏弱酸性的條件下，提取物表現(xiàn)出良好的抗菌活性和穩(wěn)定性。當(dāng)pH值為6～7時，其抗菌活性最強，之后蘋果渣乙醇提取物的抗菌活性隨著pH值的增加而降低。方差分析顯示，不同pH處理后的蘋果渣乙醇提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用差異不顯著（F< F0.05（4，4） ，P>0.05）。

2.1.4 鹽濃度對蘋果渣乙醇提取物提取液抑菌活性影響 由圖3可知，蘋果渣乙醇提取物抑菌效果與鹽濃度先呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為5.0 g·L-1時，抑菌圈直徑最大，之后隨著鹽濃度的增加，抑菌性逐漸減小。方差分析結(jié)果顯示，不同鹽濃度處理蘋果渣乙醇提取物后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用差異不顯著（F0.05）。

2.2 蘋果渣乙醇提取物防腐作用結(jié)果

由表2可知，空白組百香果手感軟，顏色差，且皺縮嚴(yán)重，有異味產(chǎn)生，已經(jīng)失去了研究和基本的商品食用價值。蘋果渣乙醇提取物處理組百香果的硬度、色澤、飽滿度、風(fēng)味都保持較好，這是由于蘋果渣乙醇提取物具有抗氧化、抑菌特性，能抑制腐爛變質(zhì)，顯示了其良好的保鮮效果，極大維持了果實優(yōu)良的感官品質(zhì)。

由表3可知，蘋果渣乙醇提取物處理后的各組百香果，相較于空白組均表現(xiàn)出較好的貯藏優(yōu)勢，防腐保鮮效果明顯。但是隨著乙醇提取物使用劑量的增大，貯藏效果呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。即0.2%蘋果渣乙醇提取物組（21-26組）處理后，經(jīng)過40 d的保鮮實驗，百香果腐爛率最低為6.7%，失重率最低為5.7%，VC含量最高為28.0，固酸比最低為6.5∶1。經(jīng)0.2%蘋果渣乙醇提取物組（21-26組）處理的百香果，各項指標(biāo)遠(yuǎn)優(yōu)于空白組，也略優(yōu)于0.1%蘋果渣乙醇提取物組（11-16組）、0.3%蘋果渣乙醇提取物組（31-36組），并且該組理化指標(biāo)值最接近貯藏前理化指標(biāo)值，保鮮效果最好，這與抑菌濃度實驗結(jié)果具有一致性，并不是濃度越高效果越好。對01-06組和21-26組貯藏后的指標(biāo)變化進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，結(jié)果表明空白組百香果與經(jīng)過蘋果渣乙醇提取物處理對百香果保鮮存在極顯著差異（P<0.01）;對比21-26組貯藏前后，結(jié)果表明在該處理下，百香果貯藏后各項指標(biāo)變化不顯著（P>0.05）。因此，使用0.2%的蘋果渣乙醇提取物處理百香果能夠起到較好的保鮮防腐作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 蘋果乙醇提取物的抗菌活性

蘋果渣乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用，且對前者的抑制作用大于后者，而對酵母菌抑制效果不明顯，這與廖春麗等（2012）、Pires et al.（2018）的研究結(jié)果相似。抑菌效果與濃度有關(guān)系，但對不同的菌影響不同。在濃度上升到4.0 g·L-1時，抑菌作用最強，之后隨著濃度的增加，對金黃色葡萄球菌抑菌性呈減小趨勢，而對大腸桿菌的抑制作用變化不明顯。可能是蘋果渣乙醇提取物對這兩種菌存在不同的抑菌機理，不同的成分可以作用于不同的微生物。本實驗蘋果渣乙醇提取物是由原花青素、沒食子酸等多種物質(zhì)組成，抑菌性是否由一種或幾種物質(zhì)作用或協(xié)同效應(yīng)，還有待進(jìn)一步的研究（Suárez et al.， 2010）。pH值和鹽濃度對抑菌效果也有影響，在中性偏弱酸性比堿性條件下抑菌效果好，可能是由于抑菌活性物質(zhì)在酸性條件下受到的保護(hù)比較穩(wěn)定，而在堿性條件下會被氧化分解，或者結(jié)構(gòu)遭到破壞。已有研究表明蘋果色素、多酚等有抑菌作用的成分，在酸性條件下較穩(wěn)定（高昌勇，2010;袁歆貽，2014）。一定鹽濃度能增強蘋果渣乙醇提取物的抑菌活性，但當(dāng)鹽濃度超過5.0 g·L-1時，抑菌活性反而減弱。這可能是低濃度的鹽對維持抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一定的作用，而當(dāng)鹽濃度較高時又會使抑菌效果減弱，其作用機理還不明確，這和鄺高波（2014）的研究結(jié)果相似，即低鹽濃度會促進(jìn)番石榴多酚的抑菌活性，這也說明蘋果渣乙醇提取物用于高鹽食品效果會受到影響。

3.2 蘋果渣乙醇提取物的防腐作用

防腐保鮮實驗表明，蘋果渣乙醇提取物能延緩百香果的感官品質(zhì)下降，減緩果實中VC的降解，顯著抑制百香果的腐爛和降低其失重率，具有良好的保鮮防腐效果，這是因為蘋果渣乙醇提取物具有良好的抑菌和抗氧化特性。中濃度蘋果渣乙醇提取物的防腐保鮮效果比高濃度和低濃度效果好，這與抑菌實驗結(jié)果具有一致性。但是蘋果渣乙醇提取物所顯示的保鮮防腐效果不僅與其抑菌性有關(guān)，還與抗氧化、抑制酶活性等有關(guān)，是多種機制綜合作用的結(jié)果。百香果出現(xiàn)病害主要是由于褐變和微生物作用引起（喬沛等，2020）。其中，果皮的褐變主要由酶促褐變、果實失水褐變、花色苷降解、低溫傷害、微生物等造成（Cheng & Breen， 1991;Fuchs & Zauberman， 1993）。吳松霞等（2019）研究發(fā)現(xiàn)蘋果多酚提取物用于芋艿切片貯藏中，蘋果多酚能延緩苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）的活性，表明適宜濃度的蘋果多酚處理能夠抑制酶促褐變的進(jìn)程。通過抑制脂氧合酶（LOX）活力，能起到維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，從而提高果實硬度的作用。蘋果渣乙醇提取物中的多酚類物質(zhì)抑制百香果中多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）等相關(guān)酶的活性，從而減少百香果儲存過程中酶促褐變的發(fā)生，且保持了百香果的硬度。冉軍艦（2013）的研究也指出，不同品種的蘋果乙醇提取液具有一定的抗氧化活性，而這對于防止百香果儲存過程中非酶褐變具有重要的作用。本研究中的蘋果渣乙醇提取物對于百香果的保鮮效果，可用以上機理進(jìn)行解釋，而其作用機制比較復(fù)雜，各項酶活指標(biāo)及相應(yīng)產(chǎn)物的變化仍需進(jìn)一步研究證實。

本研究表明蘋果渣乙醇提取物具有良好的抗菌活性，在百香果保鮮防腐上也顯示出良好的效果，為利用蘋果渣開發(fā)天然防腐保鮮劑提供了一定的科學(xué)依據(jù)。但是研究還不夠深入和完整，如蘋果渣的不同加工處理，以及對提取物的烘干處理也可能對其活性成分有破壞作用等，這些因素會對抗菌活性及防腐效果造成影響，其保鮮防腐機理也有待進(jìn)一步研究，故將蘋果渣乙醇提取物應(yīng)用于果蔬的防腐保鮮還有一定的距離。

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（責(zé)任編輯 何永艷）