泡菜直投菌對(duì)小鼠腸道菌群失調(diào)的修復(fù)效果

肖冠坤，郭佳汶，程如越，彭天宇，李毓萍，陳書巧，陳功，張其圣，李鳴*

（1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都 611130；3.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620010）

在腸道內(nèi)定植的數(shù)量龐大、組成復(fù)雜的腸道菌群是腸道微環(huán)境和機(jī)體的重要組成部分[1-2]。腸道菌群與機(jī)體互利共生，腸道提供了恒溫且富含營養(yǎng)的生存環(huán)境，腸道菌群則具有調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)和分泌、參與營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、構(gòu)成腸道上皮生物屏障、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等生理功能[2-4]。正常情況下，腸道菌群與機(jī)體保持動(dòng)態(tài)平衡，其豐度和多樣性受到種族、年齡、飲食、生活方式、益生菌、運(yùn)動(dòng)、藥物、疾病等多種因素的影響，其中最常見的影響腸道菌群的藥物是抗菌藥物，尤其是廣譜抗菌藥物[2-3]。

抗生素是人類抵御細(xì)菌感染的重要手段[5]。近年來，抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性和人體不良反應(yīng)的發(fā)生率大大增加，破壞腸道微生態(tài)平衡，引起腸道菌群紊亂，增加慢性病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康[5-6]。益生菌因其具有調(diào)節(jié)腸道菌群和拮抗有害微生物定植的生理作用，常被作為抗生素的替代或輔助治療物[6-7]。

泡菜是我國食用廣泛、歷史悠久的發(fā)酵食品，富含以乳酸菌為主的有益菌群[8-9]。泡菜直投菌（direct vat set Lactobacillus，DVSL）是從四川泡菜中提取的植物乳桿菌，安全性較高，耐酸耐膽鹽性能優(yōu)良，能在人體腸道中定植，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、維持腸道菌群平衡、改善腸道功能、降低膽固醇等作用[8-11]。

本研究通過建立抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)小鼠模型，觀察抗生素對(duì)腸道菌群和生長發(fā)育的影響，探究泡菜直投菌對(duì)抗生素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)的修復(fù)效果及其對(duì)機(jī)體的影響，為泡菜直投菌的腸道功能改善和腸道菌群調(diào)節(jié)作用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

36只四周齡SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠：四川省人民醫(yī)院（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（川）2013-15。飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心IVC系統(tǒng)，室溫（23±1）℃，濕度50%～70%，自由飲食，12 h晝夜節(jié)律。

1.1.2 試劑與材料

頭孢曲松：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泡菜直投菌菌粉（植物乳桿菌pc170株，活性量108CFU/g）：四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院；無水乙醇：成都金山化學(xué)試劑有限公司；RT-PCR反應(yīng)系列試劑：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司（BIO-RAD）；糞便細(xì)菌DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；糞便16S rRNA V6-V8區(qū)引物（U968F：5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3'和L1401R：5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3'）、16S rRNA V3-V4 區(qū)引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組

36只四周齡BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control group，Ctrl）、抗生素組（antibiotics exposure group，Abx）、泡菜直投菌組（PC），每組 12 只，單只分籠喂養(yǎng)。

1.2.2 灌胃

第1周Ctrl組小鼠0.2 mL生理鹽水灌胃，Abx組和PC組0.2 mL頭孢曲松（40 mg/d）灌胃，間隔2 h后，PC組0.2 mL泡菜直投菌（109CFU/d）灌胃，Abx組和Ctrl組0.2 mL生理鹽水灌胃。第2至4周PC組小鼠0.2 mL泡菜直投菌（109CFU/d）灌胃，其余兩組0.2 mL生理鹽水灌胃。

1.2.3 稱重及計(jì)算臟器指數(shù)

灌胃期間每3 d稱重，記錄結(jié)果。灌胃第28天處死小鼠并采集樣品，稱量臟器質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.2.4 糞便DNA提取及細(xì)菌定量

每周采集糞便，-80℃凍存。嚴(yán)格遵照糞便基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取糞便DNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）測定小鼠糞便細(xì)菌總量，反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱 1 min，94℃解鏈 20 s，55℃退火20 s，72℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糞便樣品細(xì)菌濃度。

1.2.5 二代測序

1.2.5.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用溴化十六烷基三甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）方法提取樣本基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取適量樣本DNA于離心管中，用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物、含GC緩沖液的高保真PCR混合物和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

16S V4區(qū)引物（515F和806R）用于鑒定細(xì)菌多樣性；18S V4區(qū)引物（528F和706R）用于鑒定真核微生物多樣性；ITS1區(qū)引物（ITS5-1737F和ITS2-2043R）用于鑒定真菌多樣性；此外，擴(kuò)增區(qū)域還包括：16S V3-V4區(qū)、V4-V5區(qū)，古菌16S V4區(qū)、V4-V8區(qū)，18S V9區(qū)以及ITS2區(qū)。

1.2.5.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.2.5.3 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit和qPCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。

1.2.6 組織病理學(xué)檢測

灌胃第28天處死小鼠，以盲腸為界收集小鼠結(jié)腸及回腸各約1 cm，10%甲醛固定后做組織切片，蘇木精-伊紅染色觀察回腸及結(jié)腸結(jié)構(gòu)。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0以右下角100倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片選取5根完整絨毛，測量絨毛高度（mm）、腸腺深度（mm），作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±S表示，符合參數(shù)檢驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)，多組間比較采用方差分析和Dunnett-t檢驗(yàn)，體重采用重復(fù)測量資料的方差分析；不符合參數(shù)檢驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠機(jī)體一般情況

2.1.1 體重

實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重變化情況見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間小鼠體重變化情況Fig.1 Body weight of mice during the experiment

如圖1所示，整個(gè)試驗(yàn)期間3組小鼠體重不同（F=5.32，P＜0.01），且3組小鼠體重隨時(shí)間變化的趨勢不同（F=4.19，P＜0.01）。從第 3天開始，Abx組、PC 組小鼠體重顯著低于Ctrl組（P＜0.05），PC組和Abx組小鼠體重分別自灌胃第18天和第21天與Ctrl組無顯著差異（P＞0.05）。

2.1.2 肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)

小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)見表1。

表1 小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)（±S）Table 1 Liver weight and liver index of mice

表1 小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)（±S）Table 1 Liver weight and liver index of mice

注：與Ctrl組比較，*P＜0.05差異顯著，**P＜0.01差異極顯著。

組別 肝臟質(zhì)量/g 肝臟指數(shù)Ctrl組 1.173±0.090 45.02±2.21 Abx組 1.045±0.137* 41.83±2.66**PC 組 1.037±0.061** 41.59±1.43**

由表1可知，第4周小鼠的肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)，Abx組和PC組均顯著低于Ctrl組（P＜0.05），PC組則與Abx組無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 小鼠糞便菌群及腸道病理

2.2.1 糞便細(xì)菌數(shù)量

小鼠糞便細(xì)菌數(shù)量見圖2。

圖2 小鼠糞便細(xì)菌數(shù)量Fig.2 Fecal bacteria concentration of mice

如圖2所示，第1周和第2周，Abx組、PC組小鼠糞便細(xì)菌數(shù)量均極顯著低于Ctrl組（P＜0.01），第3周Abx組小鼠糞便細(xì)菌數(shù)量顯著高于Ctrl組和PC組（P＜0.05），PC 組則極顯著低于 Ctrl組（P＜0.01），第 4周Abx組和PC組小鼠糞便細(xì)菌數(shù)量極顯著高于Ctrl組（P＜0.01）。

2.2.2 糞便菌群組成

第1周和第4周各組小鼠門水平糞便菌群組成見圖3。

圖3 第一周和第四周各組小鼠門水平糞便菌群組成Fig.3 Fecal bacteria composition of mice in the first and fourth week

如圖3所示，在門水平上，第1周Ctrl組小鼠糞便菌群組成為擬桿菌門最多，厚壁菌門次之，其余兩組均為厚壁菌門占顯著優(yōu)勢；第4周Abx組和PC組糞便菌群組成為厚壁菌門最多，擬桿菌門次之，還有部分疣微菌門，擬桿菌門所占比例較第1周明顯增加，PC組糞便菌群組成更接近Ctrl組。

2.2.3 糞便菌群α多樣性

小鼠糞便菌群的豐富度指數(shù)（Ace，Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon，Simpson）如圖4和圖5所示。

圖4 第1周糞便菌群α多樣性Fig.4 α diversity of fecal bacteria in the first week

圖5 第4周糞便菌群α多樣性Fig.5 α diversity of fecal bacteria in the fourth week

第1周Abx組和PC組豐富度指數(shù)與Ctrl組無顯著差異（P>0.05），多樣性指數(shù)顯著低于 Ctrl組（P＜0.05）；而PC組多樣性指數(shù)極顯著優(yōu)于Abx組（P＜0.01）。第4周Abx組多樣性指數(shù)極顯著高于Ctrl組（P＜0.01）；PC組豐富度指數(shù)顯著高于Abx組（P＜0.05），多樣性數(shù)極顯著低于Abx組（P＜0.01）。

2.2.4 腸道病理

小鼠腸道病理指標(biāo)見表2，腸道病理切片見圖6。

表2 小鼠腸道病理指標(biāo)（±S）Table 2 Intestinal pathological characteristics of mice

表2 小鼠腸道病理指標(biāo)（±S）Table 2 Intestinal pathological characteristics of mice

結(jié)腸絨毛高度/mm 腸腺深度/mm 絨毛高度/腸腺深度 腸腺深度/mm Ctrl組 0.196±0.031 0.107±0.010 1.832±0.189 0.128±0.028 Abx組 0.181±0.036 0.094±0.013 1.968±0.458 0.118±0.021 PC 組 0.177±0.031 0.097±0.017 1.857±0.322 0.123±0.018組別 回腸images/BZ_170_1789_1658_1806_1722.png

圖6 小鼠腸道病理切片F(xiàn)ig.6 Intestinal pathological sections of mice

由表2可知，第4周3組小鼠回腸絨毛高度、回腸腸腺深度、回腸絨毛高度/腸腺深度、結(jié)腸腸腺深度均無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

腸道菌群是腸道微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其平衡與機(jī)體健康息息相關(guān)，腸道菌群失調(diào)會(huì)影響機(jī)體生長發(fā)育，增加糖尿病、心血管疾病等慢性病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，引起胃腸道功能障礙和有毒代謝產(chǎn)物增多，還可通過腸道菌群-腸-腦軸引發(fā)焦慮、抑郁、認(rèn)知降低等癥狀及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3-4]。

抗生素濫用已成為腸道菌群失調(diào)的重要原因，長期使用抗生素不僅會(huì)損傷腸黏膜，減弱腸道上皮屏障的防御作用，影響機(jī)體代謝，還會(huì)破壞腸道菌群平衡，增加疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2，12-13]?？股氐目咕V、給藥途徑、腸內(nèi)濃度等因素均與抗生素對(duì)腸道菌群的影響及影響時(shí)間、停止用藥后腸道菌群的恢復(fù)時(shí)間等有關(guān)[3，13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，生命早期使用頭孢曲松會(huì)顯著影響小鼠體重、肝臟質(zhì)量、腸道菌群數(shù)量及構(gòu)成，且在停用后仍對(duì)機(jī)體有一定影響；泡菜直投菌有助于抗生素誘導(dǎo)的小鼠體重降低和腸道菌群失調(diào)的修復(fù)，在一定程度上修復(fù)抗生素對(duì)機(jī)體造成的損傷。

3.1 小鼠機(jī)體一般情況

第3天～第15天Abx組、PC組小鼠體重顯著低于Ctrl組，說明在生命早期使用抗生素會(huì)影響小鼠自然生長，減緩生長速度；PC組體重恢復(fù)時(shí)間早于Abx組，說明泡菜直投菌可能有助于抗生素停用后小鼠體重的恢復(fù)。萬群等[14]對(duì)新生小鼠灌胃21 d頭孢曲松后發(fā)現(xiàn)，生命早期使用頭孢曲松會(huì)導(dǎo)致小鼠體重顯著降低，且在停止干預(yù)后，到成年階段小鼠體重仍未恢復(fù)正常，這與本研究中抗生素干預(yù)的小鼠在后續(xù)喂養(yǎng)中體重恢復(fù)正常的結(jié)果不同，可能與頭孢曲松使用的生命階段、給藥持續(xù)時(shí)間、施用劑量不同等原因相關(guān)。本研究未探究頭孢曲松的劑量效應(yīng)和時(shí)間梯度，頭孢曲松對(duì)小鼠自然生長的更詳細(xì)影響可進(jìn)一步探索。

第4周Abx組小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)顯著低于Ctrl組，說明頭孢曲松會(huì)降低肝臟質(zhì)量；PC組小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)顯著低于Ctrl組，且與Abx組無顯著差異，說明泡菜直投菌對(duì)抗生素造成的肝臟質(zhì)量降低的修復(fù)不佳?？股卦斐筛闻K損傷的機(jī)制可能與其誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)有關(guān)，腸道菌群失調(diào)可使機(jī)體內(nèi)毒素增高，而肝臟是機(jī)體代謝有毒物質(zhì)的主要場所，內(nèi)毒素不斷增高導(dǎo)致肝臟超過其代償能力從而造成肝臟損傷，肝臟損傷發(fā)展到一定程度時(shí)，則反過來影響腸道菌群平衡，形成惡性循環(huán)[15]。研究顯示泡菜直投菌能夠減輕大鼠肝臟脂肪變性程度，緩解小鼠急慢性酒精性肝損傷[10，16]，這與本研究結(jié)果不同，可能是肝損傷誘因、益生菌使用持續(xù)時(shí)間不同等原因所致。本研究僅測量了肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)，未對(duì)相關(guān)生化指標(biāo)進(jìn)行檢測，故頭孢曲松對(duì)肝臟是否具有損傷作用及其機(jī)制，泡菜直投菌對(duì)肝臟的保護(hù)機(jī)制仍待探索。

3.2 小鼠糞便菌群及腸道病理

第1周Abx組和PC組小鼠糞便細(xì)菌數(shù)量和多樣性指數(shù)顯著低于Ctrl組，糞便菌落組成與Ctrl組差異較大，說明頭孢曲松會(huì)破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減少腸道細(xì)菌的數(shù)量。第4周Abx組和PC組小鼠糞便細(xì)菌數(shù)量顯著高于Ctrl組，PC組小鼠的糞便菌群構(gòu)成和豐富度指數(shù)優(yōu)于Abx組，說明抗生素對(duì)腸道菌群的影響具有顯著的后效應(yīng)，而腸道菌群穩(wěn)態(tài)在受到抗生素破壞后能夠自我修復(fù)，但無法修復(fù)到未被抗生素干擾時(shí)的狀態(tài)，Abx組糞便細(xì)菌數(shù)量增加可能是頭孢曲松殺滅腸道中大多數(shù)正常菌群，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致的過度修復(fù)；泡菜直投菌可耐受消化道環(huán)境并在腸道中定植，作為腸道菌群中的有益菌，其分泌的乳酸等可改善腸道微環(huán)境，利于雙歧桿菌、乳酸桿菌等厭氧菌的增殖，促進(jìn)腸道菌群結(jié)構(gòu)修復(fù)。

第4周3組小鼠腸道病理指標(biāo)無顯著差異，可能原因如下：抗生素造成的腸道病理損傷較輕微；抗生素對(duì)腸道造成的病理損傷在后續(xù)飼養(yǎng)中逐漸恢復(fù)至基本正常。體內(nèi)外研究顯示，雙歧桿菌、乳酸桿菌及其代謝產(chǎn)物可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖，增加腸道絨毛細(xì)胞數(shù)目，其數(shù)量與回腸黏膜厚度、絨毛高度和腸腺深度密切相關(guān)，表明益生菌在維持腸黏膜完整結(jié)構(gòu)和腸黏膜屏障正常功能方面發(fā)揮重要作用，有助于減輕抗生素誘導(dǎo)的腸黏膜損傷并促進(jìn)修復(fù)[17-18]。若要探究頭孢曲松對(duì)腸道的損傷作用，可增加1個(gè)與Abx組處理措施相同的實(shí)驗(yàn)組，在第1周灌胃結(jié)束后處死采樣，觀察腸道病理。

本研究還在免疫方面做了一些探索，發(fā)現(xiàn)泡菜直投菌降低了脾臟IL-10的表達(dá)，但目前益生菌對(duì)于IL-10表達(dá)的作用存在爭議[19-21]，故泡菜直投菌是否具有免疫調(diào)節(jié)作用，以及其對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的效應(yīng)是否與免疫機(jī)制相關(guān)仍待探究。

4 結(jié)論

本研究初步探索了抗生素對(duì)小鼠腸道菌群及生長發(fā)育的影響，泡菜直投菌對(duì)抗生素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)的修復(fù)效果及其對(duì)機(jī)體的影響。研究發(fā)現(xiàn)，生命早期使用頭孢曲松可顯著影響小鼠自然生長，破壞腸道微生態(tài)平衡，且具有顯著的后效應(yīng)；泡菜直投菌有助于抗生素誘導(dǎo)的體重降低和腸道菌群紊亂的修復(fù)。目前我國對(duì)泡菜直投菌的研究主要集中于泡菜及其發(fā)酵過程中乳酸菌菌系的分析、優(yōu)良發(fā)酵乳酸菌的篩選、重要乳酸菌的生物學(xué)特性、直投式乳酸菌劑的開發(fā)等方面[22]，有關(guān)其生理作用的研究較為空缺，泡菜直投菌對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用以及機(jī)體的改善效果仍待進(jìn)一步探索。