酶法輔助提取藜麥秸稈蛋白工藝研究

商海軍 蔣麗君 於春 江本利 姚曉華 閆曉明

摘要 [目的] 優(yōu)化生物酶輔助提取藜麥秸稈蛋白的工藝。[方法]分別探討纖維素酶和果膠酶的添加量、提取溫度和時(shí)間對(duì)藜麥秸稈蛋白提取的影響，并選取提取率較高的酶進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝。[結(jié)果]纖維素酶提取藜麥蛋白的效果優(yōu)于果膠酶，通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果得到提取溫度對(duì)藜麥秸稈蛋白提取影響最大，加酶量次之，提取時(shí)間影響最小，確定了最優(yōu)工藝：纖維素酶的添加量275 U/g，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間8 h，此時(shí)最佳提取率為40.68%。[結(jié)論]該提取方法安全無(wú)污染，提取率高，是提取藜麥秸稈蛋白簡(jiǎn)單有效的辦法，使藜麥副產(chǎn)物的資源得到充分利用。

關(guān)鍵詞 藜麥秸稈;蛋白質(zhì);生物酶;提取;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào) TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2021）17-0170-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.045

Abstract [Objective] To optimize the extraction process of quinoa straw protein assisted by biological enzymes. [Method] The effects of cellulase and pectinase addition， extraction temperature and time on the extraction of quinoa straw protein were investigated， and the enzyme with higher extraction rate was selected to optimize the process by orthogonal experiment. [Result] The effect of cellulase in extracting quinoa protein was better than pectinase. According to the results of orthogonal test， the extraction temperature had the greatest effect on the extraction of quinoa straw protein， followed by the amount of enzyme， and the extraction time had the least effect. The optimum technological conditions were determined： the amount of cellulase added was 275 U/g， the extraction temperature was 50 °C， and the extraction time was 8 h. At this time， the best extraction rate was 40.68%. [Conclusion] The extraction method was safe and pollution-free， with high extraction rate. It is a simple and effective method for extracting quinoa straw protein， so that the resources of quinoa by-products can be fully utilized.

Key words Quinoa straw;Protein;Biological enzyme;Extraction;Orthogonal test

藜麥?zhǔn)乔{科一種雙子葉植物[1]，來(lái)源安第斯山脈等高海拔地區(qū)，栽培7 000年左右[2]。藜麥含有許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸和纖維素等[3]，研究表明，藜麥不僅富含營(yíng)養(yǎng)成分，還含有多酚、皂苷、黃酮等生物活性物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化能力[4-5]，NASA稱它為營(yíng)養(yǎng)全面的食品，是一種理想的“太空糧食”[6]，2013年也被設(shè)定為國(guó)際藜麥年，以此來(lái)促進(jìn)藜麥在世界上的推廣。近年來(lái)已在我國(guó)青海、新疆、山西和寧夏開始種植[7]。

目前，對(duì)于藜麥的研究主要是籽實(shí)部位，但作為藜麥植株一部分的藜麥秸稈在藜麥?zhǔn)崭顣r(shí)被遺棄。大量的藜麥秸稈腐爛在田間，雖然可以肥沃土地，但其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值未能充分利用。藜麥秸稈含有大量的蛋白質(zhì)，含量在11%～13%，高于水稻，與大麥和玉米相當(dāng)，是一種很好的植物蛋白來(lái)源。目前，蛋白提取的方法主要包括堿溶酸沉法[8]、生物酶法[9]、鹽溶法[10]、有機(jī)溶劑法[11]等。傳統(tǒng)的提取方法存在很多不足，堿溶酸沉法工藝簡(jiǎn)單，成本低，但容易造成環(huán)境污染，且提取的蛋白容易含有有毒物質(zhì);鹽溶法耗鹽量大，生產(chǎn)成本高，不適宜工廠化生產(chǎn);有機(jī)溶劑法對(duì)含硫氨基酸破壞性較大，蛋白質(zhì)品質(zhì)差，且易造成有機(jī)試劑殘留。而生物酶法提取植物蛋白質(zhì)，作用條件溫和，對(duì)蛋白質(zhì)品質(zhì)無(wú)影響，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本不遭到破壞。

因此，筆者通過(guò)使用纖維素酶和果膠酶2種不同的生物酶分別對(duì)藜麥秸稈進(jìn)行蛋白提取，以蛋白質(zhì)提取率來(lái)評(píng)價(jià)提取效果，然后通過(guò)正交試驗(yàn)，得到藜麥秸稈的最佳提取工藝。通過(guò)對(duì)藜麥秸稈蛋白的提取，不僅能夠拓寬植物蛋白質(zhì)的來(lái)源，還可以解決藜麥?zhǔn)崭詈蟠罅拷斩挼睦脝?wèn)題，對(duì)開發(fā)并利用藜麥秸稈具有研究?jī)r(jià)值與意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥秸稈，青海省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植基地提供;試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于合肥拜爾迪生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

DHG-9143135-11電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造公司;VELP-UDK159全自動(dòng)凱氏定氮儀，購(gòu)自北京金洋萬(wàn)達(dá)科技有限公司;JYL-C19V型九陽(yáng)電動(dòng)料理機(jī)，購(gòu)自九陽(yáng)股份有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YP30001電子天平，購(gòu)自上海衡際科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取150 g藜麥秸稈，向其中加入450 mL蒸餾水，打漿1 min后超聲處理30 min，超聲處理使秸稈的細(xì)胞壁打開，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解[12]。將漿液過(guò)100目篩，收集處理的漿液，然后向漿液中加HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，再向其中加入一定量的酶，置于水浴鍋中于一定溫度條件下酶解一定時(shí)間后取出進(jìn)行滅酶，滅酶結(jié)束后，置于離心機(jī)中5 000 r/min離心20 min，離心結(jié)束后收集沉淀物并在真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，取出后磨粉，最后得藜麥秸稈粗蛋白粉，干燥處保存?zhèn)溆?。藜麥秸稈蛋白的含量采用常量凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，藜麥秸稈蛋白提取率的計(jì)算公式[13]：

式中，w為蛋白質(zhì)提取率，%;m1為提取的蛋白質(zhì)干粉質(zhì)量，g;C1為粗蛋白占提取蛋白質(zhì)干粉質(zhì)量百分比，%;m2為原料質(zhì)量，g;C2為原料中干物質(zhì)的百分含量，%;C3為原料中粗蛋白占干物質(zhì)的百分含量，%，即提取出的蛋白質(zhì)干燥后的質(zhì)量占原料蛋白質(zhì)的質(zhì)量百分比。

1.4 纖維素酶提取藜麥秸稈蛋白的單因素試驗(yàn)

1.4.1 提取溫度對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

稱取150 g藜麥秸稈，向其中加入450 mL蒸餾水，打漿1 min后超聲處理30 min，將漿液過(guò)100目篩，向漿液中加HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，加入250 U/g纖維素酶，置于水浴鍋中分別于40、45、50、55、60 ℃溫度條件下酶解8 h，后面操作同“1.3”試驗(yàn)方法中的條件處理。

1.4.2 提取時(shí)間對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

稱取150 g藜麥秸稈，向其中加入450 mL蒸餾水，打漿1 min后超聲處理30 min，將漿液過(guò)100目篩，向漿液中加HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，加入250 U/g纖維素酶，在50 ℃水浴鍋中分別酶解4、6、8、10、12 h，后面操作同“1.3”試驗(yàn)方法中的條件處理。

1.4.3 加酶量對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

稱取150 g藜麥秸稈，向其中加入450 mL蒸餾水，打漿1 min后超聲處理30 min，將漿液過(guò)100目篩，向漿液中加HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，分別向其中加入100、150、200、250、300 U/g纖維素酶，在50 ℃水浴鍋中酶解8 h，后面操作同“1.3”試驗(yàn)方法中的條件處理。

1.5 果膠酶提取藜麥秸稈蛋白的單因素試驗(yàn)

1.5.1 提取溫度對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

稱取150 g藜麥秸稈，向其中加入450 mL蒸餾水，打漿1 min后超聲處理30 min，將漿液過(guò)100目篩，向漿液中加HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，加入250 U/g果膠酶，置于水浴鍋中分別于40、45、50、55、60 ℃溫度條件下酶解8 h，后面操作同“1.3”試驗(yàn)方法中的條件處理。

1.5.2 提取時(shí)間對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

稱取150 g藜麥秸稈，向其中加入450 mL蒸餾水，打漿1 min后超聲處理30 min，將漿液過(guò)100目篩，向漿液中加HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，加入250 U/g果膠酶，在50 ℃水浴鍋中分別酶解4、6、8、10、12 h，后面操作同“1.3”試驗(yàn)方法中的條件處理。

1.5.3 加酶量對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

稱取150 g藜麥秸稈，向其中加入450 mL蒸餾水，打漿1 min后超聲處理30 min，將漿液過(guò)100目篩，向漿液中加HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，分別向其中加入100、150、200、250、300 U/g果膠酶，在50 ℃水浴鍋中酶解8 h，后面操作同“1.3”試驗(yàn)方法中的條件處理。

1.6 最佳提取工藝的正交優(yōu)化

為了確定藜麥秸稈蛋白提取的最佳工藝，通過(guò)2種酶提取藜麥秸稈蛋白的試驗(yàn)結(jié)果，選出藜麥秸稈蛋白提取率較高的纖維素酶進(jìn)行工藝優(yōu)化，選取提取的溫度、時(shí)間以及加酶量3個(gè)對(duì)象為考察因素，以藜麥秸稈蛋白的提取率為指標(biāo)，采用L9（33）正交優(yōu)化試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶提取藜麥秸稈蛋白的單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

從圖1可以看出，溫度在40～50 ℃時(shí)，藜麥秸稈蛋白提取率明顯增加。溫度在50 ℃時(shí)，蛋白的提取率上升到最高，為37.79%，但隨著溫度的繼續(xù)升高，蛋白提取率漸漸平緩且略有下降。這是因?yàn)槌跏紲囟冗m中，有助于分子擴(kuò)散，蛋白質(zhì)溶出速度加快，進(jìn)而提取率升高，但隨著溫度的升高，酶活力降低，且蛋白質(zhì)的構(gòu)象會(huì)改變，導(dǎo)致變性，所以蛋白提取率漸漸下降[14]。因此溫度不能太高，綜合考慮，溫度選擇50 ℃為宜。

2.1.2 時(shí)間對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

從圖2可以看出，酶解時(shí)間在4～8 h時(shí)，隨著時(shí)間的增加，藜麥秸稈蛋白的提取率顯著增高。當(dāng)提取時(shí)間為10 h時(shí)，提取率達(dá)到最高，為37.83%，隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)增加，藜麥秸稈蛋白的提取率逐漸平緩且略有下降。這是因?yàn)槊附夥磻?yīng)剛開始時(shí)，細(xì)胞壁裂解不完全，蛋白溶出速度慢，隨著酶解時(shí)間的增加，再加上底物的濃度較高，酶解反應(yīng)速度加快，從而蛋白質(zhì)的提取率不斷增加，隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)增加，酶將降解一些蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)也因此損失，底物濃度下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率趨于平緩且略有下降[15-16]。因此，酶解時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮，選擇8 h為宜。

2.1.3 加酶量對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

從圖3可以看出，加酶量在100～250 U/g時(shí)，隨著加酶量的增加，蛋白質(zhì)的提取率上升較快。這是因?yàn)榧?xì)胞壁被纖維素酶不斷裂解，蛋白質(zhì)暴露出來(lái)逐漸變多，藜麥秸稈蛋白的溶出率也因此增加[15]，所以蛋白提取率不斷升高。當(dāng)加酶量為300 U/g時(shí)，提取率最高，達(dá)37.88%。加酶量在250～300 U/g時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率趨于平緩，原因是酶的添加量過(guò)多，一些蛋白質(zhì)會(huì)被降解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的提取率下降。綜合考慮提取率及提取成本等問(wèn)題，選擇加酶量250 U/g為宜。

2.2 果膠酶提取藜麥秸稈蛋白的單因素試驗(yàn)

2.2.1 溫度對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

從圖4可以看出，溫度在35～45 ℃時(shí)，藜麥秸稈蛋白的提取率呈明顯增加趨勢(shì)。溫度達(dá)50 ℃時(shí)，蛋白提取率上升到最高，為31.77%，但隨著溫度的繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)提取率趨于平緩且略有下降。這是因?yàn)槌跏紲囟冗m中，分子反應(yīng)活躍，酶與底物結(jié)合概率增大，進(jìn)而提取率升高，隨著溫度的升高，酶發(fā)生變性，酶活力降低，酶解反應(yīng)漸漸減少，導(dǎo)致蛋白提取率下降[17]。因此溫度不能太高，綜合考慮，溫度選擇50 ℃為宜。

2.2.2 時(shí)間對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

從圖5可以看出，酶解時(shí)間在4～8 h時(shí)，藜麥秸稈蛋白的提取率升高速度很快。當(dāng)提取時(shí)間為10 h時(shí)，提取率達(dá)到最高，為31.85%，隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率趨于平緩且略有下降。這是因?yàn)槊附夥磻?yīng)剛開始時(shí)，屬于過(guò)量底物存在下的零級(jí)反應(yīng)期，酶解反應(yīng)速度加快，從而蛋白質(zhì)的提取率不斷增加，隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，底物濃度下降，產(chǎn)物濃度上升，導(dǎo)致藜麥秸稈蛋白質(zhì)提取變慢。因此，酶解時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，綜合考慮，選擇8 h為宜。

2.2.3 加酶量對(duì)藜麥秸稈蛋白提取率的影響。

從圖6可以看出，加酶量在100～300 U/g時(shí)，隨著加酶量的增加，蛋白質(zhì)的提取率不斷提高。當(dāng)加酶量為300 U/g時(shí)，提取率最高，達(dá)33.31%。這是因?yàn)榧?xì)胞壁被果膠酶不斷裂解，蛋白質(zhì)暴露出來(lái)逐漸變多，蛋白的溶出率也因此增加，蛋白提取率不斷升高。隨著酶量不斷增加，酶濃度增大，使得游離酶與蛋白質(zhì)進(jìn)一步相互作用，抑制了酶活力，蛋白質(zhì)提取率提升速度變慢。

2.3 藜麥秸稈蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，影響藜麥秸稈蛋白提取率的因素由大到小依次為A、C、B，即溫度對(duì)蛋白提取率影響最大，其次為加酶量，提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率影響最小。以藜麥秸稈蛋白提取率為指標(biāo)，得到最佳純化工藝為A2B1C2，即提取溫度50 ℃，提取時(shí)間8 h，纖維素添加量275 U/g時(shí)，藜麥秸稈蛋白提取率最高，提取率為40.68%。

3 結(jié)論

分別利用纖維素酶與果膠酶輔助提取藜麥秸稈中的蛋白質(zhì)，以藜麥秸稈蛋白的提取率為指標(biāo)，根據(jù)2種酶提取的試驗(yàn)結(jié)果，纖維素酶在提取藜麥秸稈蛋白的效果優(yōu)于果膠酶。選用纖維素酶提取藜麥秸稈蛋白進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果表明，藜麥秸稈蛋白提取率影響因素中溫度影響最大，加酶量影響次之，提取時(shí)間對(duì)其影響最小，優(yōu)化得到最佳工藝：溫度50 ℃、時(shí)間8 h、纖維素酶添加量275 U/g，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證得到的蛋白質(zhì)提取率為40.68%。結(jié)果表明，酶法輔助提取是一種有效安全的提取藜麥秸稈蛋白的方法，減少了藜麥秸稈的浪費(fèi)，充分利用了藜麥秸稈的價(jià)值，并為藜麥秸稈中蛋白質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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