甘肅不同產(chǎn)地黃芪藥材的活性成分對(duì)比研究

楊祎辰 王二歡 王繼強(qiáng) 馬存德 常暉 靳鵬博

摘要 [目的]通過(guò)測(cè)定不同產(chǎn)地黃芪的主要活性成分含量，研究不同成分間的相互關(guān)聯(lián)性。[方法]收集甘肅隴西及周邊共7個(gè)產(chǎn)地36批次黃芪樣品，分別測(cè)定總糖、還原糖、總黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、總皂苷和黃芪甲苷6種主要活性成分，對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析并建立回歸方程。[結(jié)果]36批次黃芪樣品的黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量基本符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。黃芪的主要活性成分間呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。其中，還原糖與總糖呈極顯著正相關(guān)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷與總黃酮呈顯著正相關(guān)，黃芪甲苷與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)。[結(jié)論]該研究為進(jìn)一步探討甘肅道地藥材黃芪與自然生態(tài)環(huán)境的相關(guān)性提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黃芪;道地藥材;活性成分;相關(guān)分析;不同產(chǎn)地;甘肅

中圖分類(lèi)號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）17-0161-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.043

Abstract [Objective]By measuring the content of the main active ingredients of Astragalus membranaceus from different origins，the correlation between them was studied.[Method]A total of 36 batches of Astragalus membranaceus samples from 7 producing areas in Longxi of Gansu and its surrounding areas were collected，the 6 main active components of total sugar，reducing sugar，total flavonoids，calycosin-7-glucoside，total saponins and astragaloside IV were determined，pearson correlation analysis of the measured data was performed and the regression equation was established.[Result]The contents of astragaloside IV and calycosin-7-glucoside in 36 batches of Astragalus membranaceus samples met the pharmacopoeia standards.The main active components of Astragalus membranaceus showed a certain correlation.Among them，reducing sugars had a very significant positive correlation with total sugars，calycosin-7-glucoside had a significant positive correlation with total flavonoids，and astragaloside IV had a significant negative correlation with reducing sugars.[Conclusion]This research provides data support and theoretical basis for further exploring the correlation between the authentic medicinal material Astragalus membranaceus in Gansu and the natural ecological environment.

Key words Astragalus membranaceus;Famous-region drug; Active ingredients; Correlation analysis;Different origins;Gansu

黃芪，亦作“黃耆”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。李時(shí)珍釋其名曰：“耆，長(zhǎng)也，黃耆色黃，為補(bǔ)藥之長(zhǎng)，故名”。黃芪資源分布廣，種植歷史悠久，當(dāng)前，甘肅為我國(guó)黃芪主產(chǎn)區(qū)之一。陶弘景言“虛而冷，用隴西黃芪”，可見(jiàn)隴西產(chǎn)黃芪自古得名[1]。隴西縣位于甘肅省東南部，渭河上游，海拔1 612～2 778 m，為典型的黃土梁峁與河谷地形，四季分明，日照充足，氣候溫和，其氣候特點(diǎn)與黃芪生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律相吻合。因而素有“千年藥鄉(xiāng)”之稱(chēng)，享有“西北藥都”“中國(guó)黃芪之鄉(xiāng)”等盛譽(yù)，隴西黃芪為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，隴西亦為黃芪的道地產(chǎn)區(qū)之一。道地藥材，指經(jīng)過(guò)中醫(yī)臨床長(zhǎng)期應(yīng)用優(yōu)選出來(lái)的，產(chǎn)在特定地域，與其他地區(qū)所產(chǎn)同種中藥材相比，品質(zhì)和療效更好，且質(zhì)量穩(wěn)定，具有較高知名度的中藥材[2]。我國(guó)土地遼闊，地形錯(cuò)綜復(fù)雜，氣候條件多種多樣。不同地區(qū)的地形、土壤、氣候等條件，形成了不同的道地藥材。獨(dú)特的環(huán)境下，物種形成了自己的品質(zhì)與生長(zhǎng)、繁衍習(xí)性。作為根莖類(lèi)入藥的耐旱植物，黃芪生長(zhǎng)進(jìn)程中初生及次生代謝強(qiáng)度與其生態(tài)環(huán)境有密切關(guān)系[3]。從動(dòng)態(tài)發(fā)展的角度看，植物與環(huán)境的關(guān)系就是植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)與進(jìn)化的過(guò)程，植物的次生代謝比初生代謝“記錄”了更多的環(huán)境信息。植物次生代謝生態(tài)學(xué)關(guān)于次生代謝過(guò)程與環(huán)境關(guān)系的探索和闡明，有助于傳統(tǒng)中藥藥源植物的標(biāo)準(zhǔn)化種植[4]。因此，該研究以隴西及周邊所產(chǎn)黃芪藥材作為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定初生及次生代謝產(chǎn)物含量，并對(duì)主要活性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[3]，為進(jìn)一步探討甘肅道地藥材黃芪與自然生態(tài)環(huán)境的相關(guān)性提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2020年10—11月產(chǎn)新期，前往甘肅省隴西縣、岷縣、渭源縣、漳縣、宕昌縣、臨潭縣和民樂(lè)縣7個(gè)產(chǎn)地，共采集黃芪藥材樣品36個(gè)批次（表1）。經(jīng)陜西步長(zhǎng)制藥有限公司副主任藥師馬存德鑒定均為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.var.mongolicus（Bge.） Hsiao。

1.2 主要儀器和試劑

島津液相色譜儀 LC-2030 Plus（日本SHIMADZU公司）;紫外分光光度計(jì)TU-1810（北京普析通用儀器有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-21-6（上海助藍(lán)儀器科技有限公司）;TE124S分析天平（德國(guó)Sartorius公司）;HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;蘆丁對(duì)照品PCS0724-1、毛蕊異黃酮葡萄糖苷PCS0460、黃芪總皂苷對(duì)照品PCS1431（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司）;乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)MERCK公司）;葡萄糖、無(wú)水乙醇、冰乙酸、蒽酮、亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;濃硫酸（分析純AR，永飛化學(xué)試劑有限公司）;香草醛（分析純AR，上海展云化工有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 總糖和還原糖含量的測(cè)定。

1.3.1.1 提取。稱(chēng)取黃芪干燥粉末（過(guò)50目篩）0.5 g于10 mL離心管中，加入5 mL 80%乙醇，80 ℃水浴30 min。冷卻至室溫后6 000 r/min下離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶;再向沉淀中加入5 mL 80%乙醇，如上法重復(fù)浸提2次，將上清液合并于25 mL容量瓶并定容。該提取液用于測(cè)定還原糖和可溶性糖。

1.3.1.2 測(cè)定。以葡萄糖為對(duì)照品，參照高俊鳳《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[5]的方法進(jìn)行，還原糖采用DNS法，總糖采用蒽酮硫酸比色法。

1.3.2 總黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測(cè)定。

1.3.2.1 提取。稱(chēng)取黃芪干燥粉末（過(guò)50目篩）0.2 g于5 mL離心管中，加入3 mL 60%乙醇，超聲提取30 min（重復(fù)2次），定容，取2 mL提取液待測(cè)。

1.3.2.2 測(cè)定。以蘆丁為對(duì)照品，參考梁欣格等[6]的方法進(jìn)行測(cè)定。毛蕊異黃酮葡萄糖苷按《中華人民共和國(guó)藥典》[7]（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《藥典》）黃芪項(xiàng)下“含量測(cè)定”進(jìn)行提取制備并參照高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定。

1.3.3 總皂苷和黃芪甲苷含量的測(cè)定。參照《藥典》黃芪項(xiàng)下黃芪甲苷的供試品溶液的制備進(jìn)行提取。分別以黃芪總皂苷、黃芪甲苷為對(duì)照品，采用香草醛-冰醋酸法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Microsoft Excel 2016整理數(shù)據(jù)和作圖，運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖和還原糖含量 總糖包括還原糖和非還原糖，為黃芪的初生代謝產(chǎn)物，黃芪多糖亦是黃芪重要的藥效成分?？兹饙彽萚8]利用紫外分光光度法測(cè)定甘肅、陜西、內(nèi)蒙古和河北4個(gè)產(chǎn)地不同生長(zhǎng)年限的黃芪中黃芪總糖含量，結(jié)果表明，同產(chǎn)地2年生黃芪的總糖含量高于多年生老芪，其中甘肅產(chǎn)2年生黃芪總糖含量最高，為19.3%。田源紅等[9]對(duì)黃芪不同炮制品中的糖含量進(jìn)行對(duì)比，研究結(jié)果顯示還原糖含量由高到低依次為生黃芪、米制黃芪、酒制黃芪、鹽制黃芪、炒制黃芪、鹽麩制黃芪?？梢?jiàn)，總糖、還原糖含量與黃芪的產(chǎn)地、年限以及炮制方法等因素有較大的關(guān)聯(lián)。從圖1可以看出，該研究收集到的36批次黃芪樣品中，總糖含量為4.84%～35.38%，還原糖含量為0.16%～1.10%，跨度均較大。這是由于甘肅境內(nèi)各地區(qū)海拔、氣溫等環(huán)境因素差異顯著。受環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致采收期間不同產(chǎn)地的黃芪總糖和還原糖代謝水平差異較大。其中渭源縣蓮峰鎮(zhèn)產(chǎn)黃芪總糖和還原糖含量相對(duì)較高，其中總糖含量為35.38%，還原糖含量為0.95%。

2.2 總黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量 黃芪中的黃酮類(lèi)成分具有抗氧化、抗病毒等藥理作用，是黃芪藥效成分的主要組成部分。毛蕊異黃酮葡萄糖苷亦被《藥典》收載為黃芪的指標(biāo)性成分。岳慧英等[10]采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，以蘆丁為對(duì)照品，對(duì)蒙古黃芪不同部位總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明總黃酮含量從高到低依次為葉、莖、根。劉亞令等[11]采用HPLC法測(cè)定了16個(gè)不同產(chǎn)地黃芪樣品中總黃酮和4種異黃酮（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素）的含量，結(jié)果表明，蒙古黃芪和膜莢黃芪中總黃酮和4種異黃酮含量差異不顯著，且不同產(chǎn)地黃芪中總黃酮和異黃酮含量差異明顯。張倩倩等[12]以1年生蒙古黃芪和膜莢黃芪幼苗為材料進(jìn)行盆栽控水試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，膜莢黃芪不同器官中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量表現(xiàn)為葉>莖>根，而蒙古黃芪根、莖和葉之間毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異不明顯。從圖2可以看出，該研究收集到的36批次黃芪樣品中，總黃酮含量為0.28%～0.85%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.029%～0.086%，均符合《藥典》不少于0.020%的標(biāo)準(zhǔn)。不同產(chǎn)地黃芪藥材的黃酮類(lèi)成分含量有一定的差異。其中渭源縣路園鎮(zhèn)產(chǎn)黃芪總黃酮及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量相對(duì)較高，總黃酮含量為0.85%，還原糖含量為0.058%。

2.3 總皂苷和黃芪甲苷含量 皂苷類(lèi)成分是黃芪中重要的活性成分之一，亦是藥用植物重要的次生代謝產(chǎn)物。黃芪甲苷是《藥典》收載的指標(biāo)性成分，具有抗炎、抑制腫瘤以及保肝等藥理作用。邵杰敏等[13]對(duì)8個(gè)不同產(chǎn)地的蒙古黃芪與膜莢黃芪的總皂苷含量進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古產(chǎn)黃芪最高，為22.95 mg/g，吉林產(chǎn)黃芪最低，為18.12 mg/g;蒙古黃芪高于膜莢黃芪，野生黃芪高于人工種植黃芪。高克立等[14]用水煎煮法提取不同產(chǎn)地黃芪中的活性成分，并測(cè)定水煎膏中的總皂苷含量，結(jié)果表明永登產(chǎn)黃芪高于隴西產(chǎn)黃芪。從圖3可以看出，該研究收集到的36批次黃芪樣品中，總皂苷含量為1.31%～2.83%;黃芪甲苷含量為0.022%～0.092%，除隴西縣菜子鎮(zhèn)和岷縣茶埠鎮(zhèn)所產(chǎn)黃芪外，其余均符合《藥典》不得少于0.040%的標(biāo)準(zhǔn)。不同產(chǎn)地黃芪藥材的皂苷類(lèi)成分含量有一定的差異。其中渭源縣清源鎮(zhèn)產(chǎn)黃芪總皂苷和黃芪甲苷含量相對(duì)較高，總皂苷含量為2.39%，黃芪甲苷含量為0.092%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在統(tǒng)計(jì)學(xué)中，Pearson相關(guān)系數(shù)常用于衡量2個(gè)變量之間的相關(guān)性，其值為-1～1，變量間相關(guān)性的強(qiáng)弱沒(méi)有規(guī)定數(shù)值。通常，相關(guān)系數(shù)越接近0，則相關(guān)關(guān)系越弱;越接近-1或1，相關(guān)關(guān)系越強(qiáng)。當(dāng)|r|>0.5時(shí)，為強(qiáng)相關(guān);當(dāng)0.3<|r|≤0.5時(shí)，為中度相關(guān)。該研究對(duì)不同產(chǎn)地黃芪主要活性成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），還原糖與總糖的相關(guān)系數(shù)是0.594，呈極顯著正相關(guān);毛蕊異黃酮葡萄糖苷與總黃酮的相關(guān)系數(shù)是0.383，呈顯著正相關(guān);黃芪甲苷與還原糖的相關(guān)系數(shù)是-0.371，呈顯著負(fù)相關(guān)。

回歸分析結(jié)果（表3）顯示，還原糖與總糖之間有極顯著的線性回歸關(guān)系，毛蕊異黃酮葡萄糖苷與總黃酮之間、黃芪甲苷與還原糖之間有顯著的線性回歸關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)大宗中藥材，素有“十藥八芪”之說(shuō)，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、斂瘡生肌之功效。多年以來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其本草考證、藥理作用、野生撫育、指紋圖譜以及DNA測(cè)序等方面進(jìn)行了研究，而關(guān)于道地性及生理生態(tài)相關(guān)性方面的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。2018年，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局起草的《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（修訂草案征求意見(jiàn)稿）》中對(duì)“產(chǎn)地”進(jìn)行了規(guī)定：“中藥材生產(chǎn)基地一般應(yīng)當(dāng)選址于傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，在非傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)選址，應(yīng)當(dāng)提供充分文獻(xiàn)或科學(xué)數(shù)據(jù)證明其適宜性?！惫蚀舜稳訃@作為黃芪傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)的隴西及其周邊地區(qū)，對(duì)黃芪藥材中主要活性成分進(jìn)行測(cè)定，并比對(duì)分析。結(jié)果顯示，此次36批次黃芪樣品的黃芪甲苷平均含量為0.066%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量為0.048%，分別為《藥典》標(biāo)準(zhǔn)的1.65倍和2.40倍?？梢?jiàn)，隴西黃芪的質(zhì)量較好。

中藥材成分復(fù)雜，化合物眾多，而不同化合物之間往往具有一定的相關(guān)性。王智民等[15]首次提出并定義一測(cè)多評(píng)法（QAMS），即利用中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)及比例關(guān)系，采用只測(cè)定其中的一個(gè)成分（對(duì)照品易得或廉價(jià)），同時(shí)獲得多個(gè)成分（對(duì)照品難以得到）同步測(cè)定的計(jì)算結(jié)果，運(yùn)用相對(duì)適宜的方法或標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)達(dá)到質(zhì)量評(píng)價(jià)的目的，并提升質(zhì)量控制水平。菅曉勇等[16]對(duì)不同產(chǎn)地及年限的若干批次黃芪的8種有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定，并進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，山西渾源產(chǎn)黃芪質(zhì)量較優(yōu)且與其他產(chǎn)地黃芪可明顯區(qū)分;同時(shí)黃芪甲苷與總多糖、毛蕊異黃酮與總黃酮、芒柄花素與粗脂肪之間存在顯著正相關(guān)。該研究對(duì)不同產(chǎn)地黃芪主要活性成分進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪的主要活性成分間呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，其中，還原糖與總糖呈極顯著正相關(guān)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷與總黃酮呈顯著正相關(guān)，黃芪甲苷與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)。

藥用植物的藥效成分絕大多數(shù)來(lái)源于植物的次生代謝產(chǎn)物。植物的次生代謝產(chǎn)物是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，其產(chǎn)生和變化往往較初生代謝產(chǎn)物與環(huán)境之間有著更強(qiáng)的相關(guān)性。許多植物在受到逆境脅迫后，為了協(xié)調(diào)與環(huán)境之間的關(guān)系，提高自身保護(hù)和生存競(jìng)爭(zhēng)的能力，體內(nèi)次生代謝途徑增強(qiáng)，以致次生代謝產(chǎn)物含量增高[17]。故在該研究基礎(chǔ)上，未來(lái)將繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)調(diào)查及研究黃芪的初生及次生代謝與自然生態(tài)環(huán)境的相關(guān)性，以探索隴西黃芪的“道地性”機(jī)理。

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