石蠟包埋組織中組蛋白的提取分離和翻譯后修飾的定量分析

田姍姍, 劉冉冉, 錢曉龍, 郭曉靜, 張 鍇

(1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 天津市醫(yī)學(xué)表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300070; 2.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室, 教育部乳腺癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 天津 300060)

組蛋白(histone)是真核生物核小體的主要蛋白質(zhì),包括核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4以及H1,其翻譯后修飾(HPTMs)是一類重要的表觀遺傳調(diào)控因子,在不同生理、病理?xiàng)l件下的基因表達(dá)調(diào)控中扮演重要角色[1]。近年來(lái),隨著蛋白質(zhì)分離富集技術(shù)的快速發(fā)展,生物質(zhì)譜掃描速度、分辨率和靈敏度的不斷提高,越來(lái)越多的新型組蛋白翻譯后修飾被相繼發(fā)現(xiàn)[2,3],極大地拓展了人們對(duì)于組蛋白密碼(histone code)的認(rèn)識(shí)。大量研究[4]表明,組蛋白翻譯后修飾的異常表達(dá)或定位,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此,全面系統(tǒng)地分析正常組織和病變組織中組蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)與修飾水平,對(duì)于理解組蛋白修飾功能、揭示腫瘤發(fā)生機(jī)制和標(biāo)志物,以及尋找藥物靶標(biāo)有著十分重要的意義[5]。

當(dāng)前對(duì)于臨床樣本的HPTMs研究,往往借助基于抗體的免疫組化等手段,然而這些方法有其自身的局限性,如抗體種類少、難以進(jìn)行HPTMs系統(tǒng)分析、無(wú)法檢測(cè)組合修飾形式等[6]。而基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),是解決上述問(wèn)題的有力工具[7],并已應(yīng)用于細(xì)胞系和動(dòng)物組織中表觀遺傳修飾的分析研究中[8,9]。然而體外培養(yǎng)細(xì)胞組蛋白翻譯后修飾水平的差異并不能夠完全反映體內(nèi)細(xì)胞的真實(shí)狀況,因此從臨床病理組織中提取組蛋白并分析其翻譯后修飾水平有很重要的意義[10]。中性福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)是當(dāng)前臨床病理組織的常規(guī)儲(chǔ)存方式,能夠長(zhǎng)期保存并維持原始的細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。臨床石蠟樣本往往包含有豐富的病理資料和臨床信息,是人類疾病研究中非常寶貴的樣本資源[11]。目前,人類臨床樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析已取得顯著進(jìn)展[12,13],但是HPTMs分析方法與應(yīng)用研究仍十分有限[14],特別是石蠟包埋組織樣品的HPTMs質(zhì)譜定量分析國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。

本研究發(fā)展了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的石蠟包埋樣本組蛋白翻譯后修飾分離分析方法。首先,設(shè)計(jì)了兩種組蛋白提取方法,一種是將石蠟包埋組織脫蠟水化處理后與組蛋白酸提取方法相結(jié)合[15],另一種是將石蠟包埋組織脫蠟水化處理后與全蛋白提取方法相結(jié)合,借助于BCA蛋白濃度檢測(cè)和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術(shù)對(duì)組蛋白提取量進(jìn)行評(píng)價(jià),進(jìn)而研究石蠟包埋切片的數(shù)量、組蛋白化學(xué)衍生化對(duì)鑒定的影響。采用丙酸酐化學(xué)衍生化策略對(duì)組蛋白裸露的賴氨酸和多肽的N端分別進(jìn)行膠內(nèi)和溶液內(nèi)標(biāo)記反應(yīng),避免由于組蛋白富含賴氨酸和精氨酸引起的酶切多肽過(guò)短的問(wèn)題,同時(shí)增加多肽疏水性,利于分離分析。最后,將優(yōu)化的組蛋白提取方法與HPTMs分析實(shí)驗(yàn)流程應(yīng)用于人乳腺癌石蠟包埋臨床樣本中組蛋白翻譯后修飾的定性定量分析中,并借助于Proteome Discoverer、EpiProfile等軟件[16],對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索與生物信息學(xué)分析。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)石蠟包埋臨床樣本中甲基化、乙?；冉M蛋白翻譯后修飾的定性定量分析,可幫助篩選不同病人之間的HPTMs差異。這一研究有助于臨床石蠟樣本組蛋白修飾分離分析研究的深入開展。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

低溫超速離心機(jī)、EASY-nLC 1000 LC-MS/MS納升級(jí)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜Q-Exactive質(zhì)譜儀、酶標(biāo)儀、真空旋干濃縮儀均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó));超聲波破碎儀購(gòu)自Sonics公司(美國(guó));恒溫金屬浴購(gòu)自Eppendorf公司(德國(guó))。

BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)、HPLC級(jí)乙腈(ACN)、HPLC級(jí)水、甲酸(FA)均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó));三氟乙酸(TFA)、丙酸酐、氨水購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó));碳酸氫銨(NH4HCO3)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氯化鈉、考馬斯亮藍(lán)、苯甲基磺酰氟(PMSF)等購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;去乙?；敢种苿┗旌衔?Deacetylase Inhibitor Cocktail)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;全蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司;三氯乙酸(TCA)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甲苯、乙醇、丙酮購(gòu)自天津市化學(xué)試劑供銷公司;胰蛋白酶(trypsin)購(gòu)自Promega公司(美國(guó)); Micro-C18 Zip-Tip除鹽柱購(gòu)自Millipore公司(美國(guó));去離子水由Millipore純水儀制備;化學(xué)試劑純度為分析級(jí)或HPLC級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1石蠟包埋組織中組蛋白的提取

結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果,用手術(shù)刀片分別刮取蘇木精-伊紅染色石蠟包埋組織切片的癌組織(cancer tissues, C)和癌旁正常組織(normal tissues, N),依次加入二甲苯脫蠟和梯度乙醇水溶液(95%、70%、50%、20%和超純水)水化組織,于4 ℃以13 600 r/min離心3 min,棄上清。加入200 μL SDS裂解液(100 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、69.4 mmol/L SDS, pH 8.0)裂解組織,超聲破碎溶解后進(jìn)行熱修復(fù)過(guò)程(在95 ℃下孵育45 min,然后在65 ℃下孵育4 h),以13 600 r/min離心5 min,獲得全蛋白裂解液。采用BCA法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度,取40 μg全蛋白裂解液上樣,并采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的方法(12%的分離膠和6%的濃縮膠)進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分離,電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色30 min,隨后將凝膠脫色可獲得清晰的組蛋白條帶。

對(duì)于酸提取法,脫蠟、水化并離心后,加入200 μL NIB裂解液(15 mmol/L Tris、60 mmol/L KCl、15 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、250 mmol/L蔗糖(sucrose)、終體積分?jǐn)?shù)1%(v/v)NP-40, pH 7.5)裂解組織,超聲破碎溶解后進(jìn)行熱修復(fù)過(guò)程(在95 ℃下孵育45 min,然后在65 ℃下孵育4 h),以13 600 r/min離心5 min,棄上清。加入400 μL的0.2 mol/L H2SO4溶液溶解。加入終體積分?jǐn)?shù)25%(v/v)TCA沉淀組蛋白,經(jīng)預(yù)冷丙酮清洗2次后,獲得組蛋白沉淀物。用水溶液將沉淀物溶解后全部上樣,再次采用SDS-PAGE方法(12%的分離膠和6%的濃縮膠)進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分離,電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色30 min,隨后將凝膠脫色可獲得組蛋白條帶。

1.2.2組蛋白的膠內(nèi)化學(xué)衍生化與酶解

將考馬斯亮藍(lán)染色的組蛋白條帶切碎并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,依次加入1 mL 25 mmol/L NH4HCO350%(v/v)乙醇水溶液、100 mmol/L NH4HCO3溶液和ACN振蕩10 min。隨后進(jìn)行組蛋白膠內(nèi)的丙酸酐衍生化,加入200 μL標(biāo)記試劑丙酸酐-乙腈(1∶3, v/v)和200 μL 100 mmol/L NH4HCO3,并采用純氨水調(diào)節(jié)溶液pH值至8,于37 ℃反應(yīng)15 min。棄上清,重復(fù)2次衍生化操作。按照胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶25加入胰蛋白酶,于37 ℃水浴酶解過(guò)夜。依次加入ACN-H2O-TFA(10∶9∶1, v/v/v)、ACN-H2O-TFA(750∶249∶1, v/v/v)和ACN,提取酶解多肽并真空旋干。加入50 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶解多肽,進(jìn)行溶液內(nèi)多肽N端的丙酸酐衍生化,加入15 μL標(biāo)記試劑丙酸酐-乙腈(1∶3, v/v),調(diào)節(jié)溶液pH值至8,于37 ℃反應(yīng)15 min。重復(fù)2次衍生化操作,以保證反應(yīng)標(biāo)記效率。

1.2.3LC-MS/MS分析

樣品經(jīng)Micro-C18 Zip-Tip柱除鹽后,加入7 μL含0.1%(v/v)FA的水溶液溶解,從中取5 μL注射到Nano-LC系統(tǒng)(EASY-nLC 1000),樣品通過(guò)Acclaim pepMap RSLC C18反相毛細(xì)管柱(15 cm×75 μm, 3 μm,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行反相色譜分離,流動(dòng)相A和B分別為含0.1%(v/v)FA的水溶液和含0.1%(v/v)FA的乙腈溶液,分離后的組分經(jīng)電噴霧電離(ESI)后,進(jìn)入到Orbitrap Q-Exactive質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。

利用數(shù)據(jù)依賴采集(data-dependent acquisition, DDA)模式進(jìn)行分析時(shí)使用液相梯度洗脫程序,具體為0～16 min, 5%B～13%B; 16～51 min, 13%B～28%B; 51～66 min, 28%B～45%B; 66～67 min, 45%B～100%B; 67～75 min, 100%B。電噴霧電壓設(shè)置2.4 kV,一級(jí)譜圖掃描時(shí),自動(dòng)增益控制(AGC)設(shè)置為1×106掃描范圍為m/z350～1 800,分辨率為70 000,采用高能碰撞解離(HCD)方式對(duì)峰度排序前15的2價(jià)多肽依次進(jìn)行選擇并碰撞破碎,歸一化碰撞能量設(shè)為27%,二級(jí)譜圖的掃描分辨率設(shè)為17 500, AGC設(shè)為5×104,隔離窗口(m/z)為2.2,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為15 s。

實(shí)驗(yàn)利用數(shù)據(jù)非依賴采集(data-independent acquisition, DIA)模式進(jìn)行分析時(shí)使用液相梯度洗脫程序,具體為0～55 min, 6%B～45%B; 55～60 min, 45%B～100%B; 60～70 min, 100%B。電壓設(shè)置2.4 kV,一級(jí)譜圖掃描時(shí),AGC設(shè)為1×106,掃描的范圍為m/z350～1 100,分辨率為35 000,采用高能碰撞解離,歸一化碰撞能量設(shè)為27%,二級(jí)譜圖的掃描分辨率設(shè)為17 500,隔離窗口(m/z)為50, AGC設(shè)為5×105。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

組蛋白翻譯后修飾的定性鑒定采用Proteome Discoverer(PD,版本1.4)軟件對(duì)DDA模式下的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索,數(shù)據(jù)庫(kù)為Uniprot-Histone Human。檢索參數(shù)設(shè)置為最多允許5個(gè)胰蛋白酶漏切位點(diǎn),每個(gè)肽段最多修飾數(shù)設(shè)為5個(gè),可變修飾包括賴氨酸乙?；?、單甲基化、二甲基化、三甲基化、琥珀?；投辊；?、二羥基異丁?；?、丙二?；?假陽(yáng)性率(FDR)≤0.01;前體離子和MS/MS允許誤差范圍分別設(shè)定為10-6(10 ppm)和0.02 Da。

組蛋白翻譯后修飾定量分析:采用非標(biāo)記質(zhì)譜定量方式,使用EpiProfile 2.0軟件對(duì)DIA模式下的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索[16],根據(jù)m/z、保留時(shí)間等提取各個(gè)組蛋白酶解肽段的色譜峰面積,以提取的氨基酸序列相同的所有肽段(包括其所有修飾形式及未修飾形式)色譜峰下的總面積為100%,計(jì)算每個(gè)修飾肽段的相對(duì)百分比。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量相同的多肽,其相對(duì)比例通過(guò)不同質(zhì)量二級(jí)碎片離子的峰強(qiáng)度進(jìn)行辨別與計(jì)算。每個(gè)樣品分別進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù),對(duì)定量結(jié)果取平均值后,比較癌組織和癌旁正常組織組蛋白修飾的差異,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.3 倫理聲明

2例中性福爾馬林固定石蠟包埋乳腺癌組織(包括浸潤(rùn)性癌和癌旁正常組織)由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室提供,所有患者在樣本被使用之前都簽署了知情同意書,該研究項(xiàng)目得到天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 石蠟包埋組織中組蛋白的提取方法與條件優(yōu)化

2.1.1組蛋白提取策略與評(píng)價(jià)

組蛋白的提取往往采用酸提取的方法,即利用組蛋白富含賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸可以很好地在酸中溶解的特性,將胞漿蛋白、核內(nèi)其他雜蛋白與堿性組蛋白進(jìn)行分離,從而獲取主要組蛋白成分(H1/H2A/H2B/H3/H4)。因此,設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)流程A(見圖1),首先采用二甲苯和梯度的乙醇水溶液分別對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行脫蠟和水化,然后利用NIB裂解液破壞細(xì)胞膜并進(jìn)行熱修復(fù)過(guò)程,最后利用硫酸提取獲得組蛋白。通過(guò)BCA試劑盒對(duì)提取的組蛋白進(jìn)行定量分析,4片10 μm(4×10 μm)石蠟包埋組織可提取約3 μg組蛋白樣品,通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離進(jìn)行表征,組蛋白條帶較淺(圖2a),提取產(chǎn)量較少,不利于后續(xù)組蛋白修飾的深度分析。這可能是因?yàn)榇朔椒ㄉ婕叭コ麧{蛋白、冰丙酮清洗等實(shí)驗(yàn)步驟,造成石蠟包埋樣本組蛋白損失較多?？紤]到SDS具有更強(qiáng)的裂解效果,我們同時(shí)設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)流程B(見圖1),在對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行脫蠟和水化后,加入SDS裂解液裂解組織同時(shí)進(jìn)行熱修復(fù)過(guò)程,獲取全蛋白裂解液,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離獲得組蛋白。通過(guò)BCA蛋白濃度檢測(cè),4片10 μm石蠟包埋組織可提取約200 μg全蛋白樣品,借助聚丙烯酰胺凝膠電泳分離去除雜蛋白,可以獲得清晰的組蛋白條帶(見圖2b)。因此,采用實(shí)驗(yàn)流程B進(jìn)行下一步條件優(yōu)化。

圖2 福爾馬林固定石蠟樣本組蛋白提取的評(píng)價(jià)和優(yōu)化

2.1.2組蛋白提取方法的條件優(yōu)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程,分別對(duì)不同數(shù)量石蠟包埋切片的蛋白質(zhì)提取量(見圖2c)、組蛋白提取效果(見圖2d)、組蛋白化學(xué)衍生化效率進(jìn)行了考察。通過(guò)BCA蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著切片數(shù)量的增加,蛋白質(zhì)的提取量呈現(xiàn)倍數(shù)增長(zhǎng)。2片10 μm切片即可提取約70 μg蛋白質(zhì)含量,滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。4片10 μm切片可提取約200 μg蛋白質(zhì)含量,可實(shí)現(xiàn)3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。取相同含量(40 μg)的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后,不同數(shù)量切片提取的組蛋白條帶無(wú)明顯差別。多肽N端衍生化使用10 μL標(biāo)記試劑時(shí),數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),組蛋白酶解多肽的N端標(biāo)記效率偏低(約80%左右)。提高多肽N端衍生化標(biāo)記試劑至15 μL時(shí),組蛋白酶解多肽的N端標(biāo)記效率可提高至95%以上。因此,組蛋白翻譯后修飾定量分析可采用4片10 μm切片、多肽N端衍生化標(biāo)記試劑15 μL的實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 乳腺癌石蠟包埋臨床樣本中組蛋白翻譯后修飾分析

2.2.1樣本選取與組蛋白提取

結(jié)合蘇木精-伊紅染色切片在光學(xué)顯微鏡下的觀察結(jié)果,能夠精準(zhǔn)確定浸潤(rùn)性癌與癌旁正常組織的位置,減少組織純度引起的結(jié)果誤差。以蘇木精-伊紅染色切片中癌與癌旁正常組織的位置為參考,刮取4片10 μm未染色切片中的癌和癌旁正常組織(見圖3a),加入SDS裂解液裂解組織并進(jìn)行熱修復(fù)過(guò)程,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)組蛋白進(jìn)行分離,組蛋白條帶清晰可見(見圖3b),提取效果理想。

圖3 (a)石蠟包埋乳腺癌組織切片中癌與癌旁正常組織的選取及(b)組蛋白的分離

2.2.2組蛋白翻譯后修飾的定性鑒定

將組蛋白條帶分別切下,經(jīng)膠內(nèi)酶解后,進(jìn)行質(zhì)譜分析,通過(guò)Proteome Discoverer軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索,組蛋白H3和H4翻譯后修飾的初步鑒定結(jié)果見圖4。在浸潤(rùn)性癌組織中,除了鑒定到常見的賴氨酸甲基化、乙酰化修飾,我們也發(fā)現(xiàn)了一些低豐度的修飾如賴氨酸巴豆?；?-羥基異丁?；?。

圖4 癌組織中組蛋白翻譯后修飾的鑒定

2.2.3組蛋白翻譯后修飾的定量分析

將組蛋白條帶全部切下,經(jīng)組蛋白膠內(nèi)丙酸酐化學(xué)衍生化、膠內(nèi)酶解、多肽N端丙酸酐化學(xué)衍生化后,進(jìn)行HPLC-MS/MS分析,采用EpiProfile軟件對(duì)組蛋白翻譯后修飾進(jìn)行定量分析。為了考察數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與重復(fù)性,本研究分別進(jìn)行了鑒定修飾多肽數(shù)目比較、相關(guān)性分析、主成分分析(PCA)等生物信息學(xué)分析。通過(guò)對(duì)鑒定修飾多肽數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見圖5a),各樣品鑒定的不同修飾形式的多肽數(shù)目均在100以上,具有較好的鑒定信息。根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果(見圖5b),樣品內(nèi)3次重復(fù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)在0.8以上,具有較強(qiáng)的相關(guān)性。而兩例Her2+患者浸潤(rùn)性癌和癌旁組織樣品之間的相關(guān)性約在0.7以上,也具有較強(qiáng)相關(guān)性,這表明實(shí)驗(yàn)整體上具有較好的穩(wěn)定性。根據(jù)主成分降維分析結(jié)果(見圖5c),浸潤(rùn)性癌和癌旁正常組織之間組蛋白翻譯后修飾定量結(jié)果存在一定的差異性,這表明組蛋白修飾具有一定區(qū)分癌和癌旁正常組織的評(píng)價(jià)潛力。通過(guò)對(duì)組蛋白修飾定量結(jié)果的聚類分析(見圖5d),發(fā)現(xiàn)很多HPTMs位點(diǎn)的豐度在兩例Her2+患者乳腺浸潤(rùn)性癌和癌旁正常組織中具有明顯的差異,而兩例樣本之間的差異性規(guī)律是相近的,其中包括一些與轉(zhuǎn)錄激活或抑制密切相關(guān)的組蛋白修飾,如H3K9me3、H3K9ac、H3K27me3等,這些修飾的不同暗示Her2+患者乳腺浸潤(rùn)性癌和癌旁正常組織中的表觀調(diào)控存在差異。這些一致性的組蛋白修飾規(guī)律可能與Her2+乳腺浸潤(rùn)性癌的特征具有一定聯(lián)系。此外,我們特別注意到浸潤(rùn)性癌組織中H4K20me3均顯著下調(diào),這也與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致,H4K20me3下調(diào)被認(rèn)為是人類癌癥的一個(gè)標(biāo)志,也是包括乳腺癌在內(nèi)的許多類型癌癥的潛在預(yù)后標(biāo)志,而組蛋白H4K20甲基轉(zhuǎn)移酶SUV420H2也被認(rèn)為是癌癥潛在的治療靶標(biāo)[18]。我們也發(fā)現(xiàn),兩例樣本之間也存在一些不同的規(guī)律,如H3S10磷酸化修飾在兩例患者乳腺浸潤(rùn)性癌和癌旁正常組織中呈相反規(guī)律,這可能與患者個(gè)體或成瘤的差異有一定關(guān)系。

圖5 癌組織和癌旁正常組織中組蛋白翻譯后修飾的定量分析

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的石蠟包埋臨床樣本HPTMs提取分離、定量分析新方法,并結(jié)合乳腺癌的實(shí)際樣本,嘗試分析了浸潤(rùn)性癌和癌旁正常組織的HPTMs。從結(jié)果來(lái)看,這一方法在臨床腫瘤樣本分析中具有應(yīng)用潛力,這方面工作的深入開展有利于從大量石蠟包埋組織中,探索基于組蛋白修飾的腫瘤標(biāo)志物,為腫瘤臨床治療靶點(diǎn)的尋找、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)提供有益的信息。