基于超高效液相色譜-飛行時間質譜法測定LAMTOR1在肝臟炎癥惡性轉化中調控的代謝物

王 穩(wěn), 陳 迪, 樸海龍*

(1.中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析重點實驗室, 遼寧 大連 116023; 2.中國科學院大學, 北京 100049)

非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)因為其纖維化和肝硬化帶來的嚴重肝損傷,被認為是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver diseases, NAFLD)進展中的關鍵階段[1]且可能發(fā)展為肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[2],已成為肝臟相關疾病死亡的重要原因之一。NASH的發(fā)生發(fā)展與導致肝臟中脂質沉積的肥胖及其代謝綜合征有較強的關系[3],而伴隨著肥胖以及相關代謝疾病越來越全球化的趨勢,NAFLD也已經成為很多國家的重要健康問題[4]。研究發(fā)現(xiàn),肝臟特異敲除Pten基因的小鼠后續(xù)會發(fā)生NASH[5],嚴重者會發(fā)展為肝癌,而蛋白組和代謝組數(shù)據(jù)也表明循環(huán)脂質代謝物以及一些基因的變化與該進程密切相關[6]。因此NASH作為嚴重肝臟疾病發(fā)生的必經階段,了解其疾病發(fā)生發(fā)展及炎癥惡性轉化過程中相關生物分子調控的關系,對開展有效治療嚴重肝臟疾病具有重要意義。目前營養(yǎng)誘發(fā)動物模型是展開NASH發(fā)病機制和治療研究的最有效平臺,如基于蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine choline-deficient, MCD)飼料誘導的小鼠NASH模型。

LAMTOR1(全稱為晚期胞內體/溶酶體接頭蛋白,MAPK以及mTOR激活蛋白1)在調控細胞生長和能量平衡中起重要作用,并參與氨基酸介導的蛋白激酶復合物mTORC1的激活過程[7]。并在肝臟特異性敲除LAMTOR1的小鼠模型中發(fā)現(xiàn),在能量匱乏時該蛋白參與重要蛋白激酶AMPK的激活[8],以應對機體內的營養(yǎng)壓力,表明該蛋白與肝臟的糖脂代謝關系密切[9]。因此,推斷LAMTOR1在NASH疾病發(fā)展乃至后續(xù)進展為肝癌的過程中可能調控關鍵代謝通路,占據(jù)重要角色。

隨著近些年功能代謝組學[10]的興起,代謝組學技術在研究基因與疾病進展相關功能時發(fā)揮著越來越出色的作用[11-12]。將基因敲除和代謝組學技術聯(lián)合交叉應用到生命過程中重要代謝通路的研究中,更利于闡釋代謝疾病進展過程中的分子機制。本研究以MCD飲食誘導的小鼠NASH模型為平臺,在肝臟特異性敲除LAMTOR1基因的組織樣品中進行關鍵代謝通路鑒定,結合基因表達相關性分析,期望在NASH疾病進程及肝臟炎癥惡性轉化中對LAMTOR1蛋白可能發(fā)揮的重要作用給出闡釋,并為NASH及NASH轉化的肝癌發(fā)病機制和治療研究提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

代謝物分析采用Acquity超高效液相色譜(UHPLC)(美國Waters)聯(lián)合四極桿-飛行時間質譜(TripleTOF 5600 MS)(美國AB SCIEX)系統(tǒng)。蛋白質免疫印跡實驗(western blot, WB)在Fusion Fx化學發(fā)光儀(法國VILBER)上實現(xiàn)。液相色譜用純甲醇和乙腈購自Merck(德國),超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備(美國Millipore)。流動相添加劑甲酸和碳酸氫銨以及提取劑甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether, MTBE)購自Sigma公司(美國),穩(wěn)定同位素內標均為Sigma公司產品。穩(wěn)定同位素內標有:亮氨酸-d3、苯丙氨酸-d5、色氨酸-d5、乙酰肉堿-d3、癸酰基肉堿-d3、棕櫚酰肉堿-d3、硬脂酸-d3、軟脂酸-d3、膽酸-d4和鵝去氧膽酸-d4。Tris-Cl、EDTA、5%(v/v)NP-40水溶液、脫氧膽酸和5%(v/v)Triton水溶液均購買自索萊寶(中國)。NaCl和甘油購買自科密歐(中國)。用于WB實驗的放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)裂解液包含50 mmol/L Tris-Cl(pH=7.4)、150 mmol/L NaCl、1%(v/v)NP-40、0.25%(w/v)脫氧膽酸、10%(v/v)甘油、1 mmol/L EDTA(pH=8.0)和1%(v/v)Triton,使用時按照裂解液體積加入1%(w/v)蛋白酶和磷酸化抑制劑(美國InvivoGen)。兔抗LAMTOR1多抗為廈門大學林圣彩課題組制備(1-64aa)。兔抗p70S6激酶(p70S6K, cat #2708)、兔抗磷酸化p70S6激酶(phospho-p70S6K, cat #9234)、鼠抗S6核糖體蛋白(S6, cat #2317)、兔抗磷酸化S6核糖體蛋白(phospho-S6, cat #2215)和兔抗磷酸化4E-BP1(phospho-4E-BP1, cat #9955)等抗體購自CST公司(美國)。鼠抗GAPDH單抗(60004-1-Ig)和鼠抗Vinculin單抗(v4505)分別購自美國Proteintech和Sigma公司。

1.2 動物培養(yǎng)與組織蘇木精-伊紅染色

肝臟特異性敲除LAMTOR1的小鼠(LAMTOR1LKO, KO小鼠)由廈門大學林圣彩課題組采用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)獲得[10],并完成MCD飲食誘導的KO小鼠和野生型小鼠(WT小鼠)的NASH造模實驗、肝臟組織取樣及小鼠肝臟切片的蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin, HE)染色實驗。

1.3 WB分析

在肝臟特異性LAMTOR1敲除KO小鼠和WT小鼠的肝臟組織中加入RIPA裂解液,經由氧化鋯小珠在組織研磨器(中國新芝生物科技公司)上獲得組織漿液,經過4 ℃、12 000 r/min離心15 min后,取上清進行蛋白定量并調平蛋白濃度后,加入上樣緩沖液變性。使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離。分離完全后將蛋白轉至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上,并用一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h。最后,通過化學發(fā)光試劑檢測蛋白表達情況。

1.4 小鼠肝臟組織代謝物提取

代謝物的提取采用基于MTBE的液液萃取方法進行[13]并根據(jù)實驗體系稍作改動[14]。稱取約10 mg新鮮組織,置于加有氧化鋯小珠的圓底離心管中,加入含有內標的甲醇提取劑后用球磨儀(mixer mill MM400,德國)進行組織勻漿,隨后加入MTBE在室溫下振蕩。之后加入純水渦旋振蕩后靜置分層。在10 000 r/min、4 ℃條件下進行10 min高速離心使兩相分離。按照5∶3比例[13]分別取上層和下層清液,混合用于代謝組學分析。制備質量控制(quality control, QC)樣本時,從每個提取樣本中等量取上層和下層清液,分別置于兩個離心管中,渦旋,同樣5∶3的比例分別取上層和下層清液制備QC樣本。

1.5 LC-MS分析

LC-MS分析條件參考文獻所述[15]。樣品分析前用20%(v/v)甲醇水溶液進行復溶,正離子模式下,樣品經過Acquity C8色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分離,柱溫40 ℃,進樣量5 μL。流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動相B為0.1%(v/v)甲酸乙腈。洗脫梯度:0～0.5 min, 5%B; 0.5～24 min,由5%B線性升至100%B; 24～28 min, 100%B;然后在0.1 min內回到初始比例5%B并平衡色譜柱1.9 min。流動相流速為0.35 mL/min。

負離子模式下,采用Acquity T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),柱溫50 ℃,進樣量5 μL。流動相C為溶解6.5 mmol/L碳酸氫銨的水溶液,流動相D為含有6.5 mmol/L碳酸氫銨的95%(v/v)甲醇水溶液。洗脫梯度如下:0～1 min, 2%C; 1～22 min,由2%C線性升至100%D; 22～26 min, 100%D;然后在0.1 min內回到初始比例2%D并平衡色譜柱3.9 min,流動相流速度為0.35 mL/min。

質譜分析在全掃獲得一級譜圖的同時進行數(shù)據(jù)相關采集模式獲得二級譜圖。參數(shù)設置如下:離子源溫度為500 ℃,離子源電壓在正負離子分析模式下分別設為5 500 V和-4 500 V,去簇電壓在正負離子模式下分別為100 V和-100 V,碰撞能在正負離子法分析模式下分別為30 eV和-10 eV。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

將代謝組學平臺采集的原始數(shù)據(jù)導入儀器自帶的峰匹配軟件Markerview(1.2.1版本,美國AB SCIEX公司)工作站中獲取離子原始峰表?；诰_質量數(shù)、保留時間和MS/MS圖譜[16],以及在Peakview(1.2版本,美國AB SCIEX公司)工作站中提取二級碎片信息進行核對,進一步結合標樣庫、網絡數(shù)據(jù)庫等對代謝物進行定性。最后在Multiquant(2.1版本,美國AB SCIEX公司)中實現(xiàn)對定性代謝物分子的峰面積提取。代謝組學分析得到的原始峰面積,經由內標峰面積和組織重量校正后進行處理和統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學顯著性采用R語言中的Wilcoxon, Mann-Whitney test進行評價,將p<0.05的代謝物歸為顯著性的差異代謝物。組間存在差異的代謝物,數(shù)據(jù)歸一化以后在Multi Experiment Viewer 4.8.1軟件上熱圖可視化并進行層次聚類分析。并在開源的MetaboAnalyst網站(http://www.metaboanalyst.ca)進行差異代謝物的通路富集分析。使用軟件SIMCA 14.0(Umetrics,瑞典)進行主成分分析(principal component analysis, PCA),呈現(xiàn)樣品間代謝特征的差異以及實驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 公共基因組數(shù)據(jù)庫中分析LAMTOR1基因在NASH和肝癌中的表達情況

已有的報道[7,9]雖然顯示出LAMTOR1基因在機體內的重要調控作用,但是其與NASH或者炎癥惡性轉化成的肝癌的疾病發(fā)生發(fā)展是否存在調控關系卻未有明確的機制闡釋。根據(jù)來源公共開放基因表達數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus(GEO)中的一個數(shù)據(jù)集GDS4881(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE48452),通過基因表達數(shù)據(jù)的分析比較,我們發(fā)現(xiàn)相對于健康人樣本(n=27),LAMTOR1在NASH病人樣本(n=18)中存在高表達趨勢(見圖1a)。接下來基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫中的肝癌相關基因表達數(shù)據(jù),我們在GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia.cancer-pku.cn/)上進行了LAMTOR1的差異表達分析。通過對比TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫的正常樣本(n=50)數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)LAMTOR1在肝癌的癌癥樣本(n=369)中是明顯高表達的(見圖1b)。根據(jù)LAMTOR1在NASH和肝癌中均出現(xiàn)高表達的異?，F(xiàn)象,推測其在NASH的疾病進程乃至后續(xù)發(fā)展為嚴重的肝癌過程中,可能發(fā)揮重要的生物學調控功能。

圖1 基于基因表達數(shù)據(jù)庫分析LAMTOR1基因在NASH和肝癌中的表達情況

2.2 小鼠NASH模型的成功構建與蛋白表達驗證

為了模擬肝臟發(fā)生炎癥性損傷的情況,用MCD飼料喂養(yǎng)誘導小鼠構建NASH模型,通過HE(hematoxylin-eosin)染色,觀察到無論是肝臟特異性敲除LAMTOR1基因的小鼠(見圖2a)還是野生型小鼠(見圖2b)的肝臟組織中均出現(xiàn)較為明顯的脂質沉積,并且鏡下觀察到肝細胞氣球樣變以及一些炎癥細胞聚集的現(xiàn)象,這些特征的出現(xiàn)說明小鼠NASH模型的成功構建[17]。同時又提取了KO小鼠和WT小鼠肝臟組織中的蛋白,并進行了WB分析。如預期一樣,在KO小鼠的肝臟組織中,由于LAMTOR1的敲除,LAMTOR1蛋白也不再表達(見圖3a)。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道,LAMTOR1與其他復合物蛋白共同對mTOR通路及其下游蛋白的影響[18]也得到了驗證,比如磷酸化p70S6k蛋白水平(見圖3a)和磷酸化核糖體蛋白S6蛋白表達水平(見圖3b)在LAMTOR1敲除小鼠肝臟中明顯下調,而磷酸化4E-BP1[19]的蛋白水平發(fā)生明顯上調(見圖3b)。這些已知信號通路相關蛋白的變化說明在小鼠發(fā)生肝臟炎癥性損傷時,LAMTOR1基因參與調控糖脂代謝,應對機體營養(yǎng)壓力的功能仍然存在。解釋清楚MCD誘導的小鼠NASH模型中,肝臟特異性敲除LAMTOR1具體通過調控哪些重要代謝通路來參與NASH進展中的肝臟功能調節(jié),對理解NASH的疾病發(fā)生發(fā)展機制及預防治療具有重要指導意義。

圖2 誘導NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織的蘇木精-伊紅染色結果

圖3 免疫印跡分析誘導NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織中LAMTOR1和受LAMTOR1調控的蛋白質水平

2.3 誘導NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織的代謝差異

本研究采用已建立的基于LC-MS的非靶向代謝組學方法對小鼠肝臟代謝物進行分析,該方法建立以后在許多疾病研究中得到了廣泛應用[15,20],其建立及考察過程參見文獻[21]。在正離子模式和負離子模式下共定性到134個代謝物。用質控樣本QC中代謝物的RSD分布來評價該方法在本研究中的重復性,其中正離子模式下檢測的88個代謝物中,58個(65.9%)代謝物分子的RSD小于10%, 25個代謝物分子的RSD在10%～20%之間,5個代謝物分子的RSD在20%～30%之間(見圖4a);負離子模式下定性到的46個代謝物分子的RSD均小于30%(見圖4b),說明該代謝物分析方法在本研究中得到的數(shù)據(jù)可靠。對誘導NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠肝臟組織、WT小鼠肝臟組織以及QC樣本中檢測到的代謝物進行了主成分分析。PCA模型(R2X=0.763,Q2=0.235)得分圖(見圖4c)中,QC樣本緊密地聚集在一起,說明該液相色譜-質譜聯(lián)用方法分析這些小鼠肝臟樣品的結果穩(wěn)定且重復性好。并且NASH模型下LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織之間有明顯的分離趨勢,說明在NASH模型中,肝臟特異性敲除LAMTOR1對小鼠肝臟的代謝過程有明顯的擾動。從NASH小鼠肝臟代謝物的火山圖(見圖4d)可以看出,與WT小鼠相比,LAMTOR1LKO小鼠肝臟中有34個代謝物明顯上調,11個代謝物發(fā)生明顯下降。接下來對兩組之間的差異代謝物進行熱圖可視化分析(見圖5a),結果顯示一些氨基酸、脂肪酸等代謝物在肝臟特異性敲除LAMTOR1小鼠肝臟中差異顯著上調,反而N-乙酰谷氨酸、精胺等代謝物顯著下調。對差異代謝物做通路富集分析(見圖5b),結果顯示NASH模型下LAMTOR1LKO小鼠肝臟中嘧啶代謝、核黃素代謝、精氨酸生物合成、谷胱甘肽代謝、氨基酰-tRNA生物合成、氮代謝、谷氨酰胺和谷氨酸代謝和beta-丙氨酸代謝等通路發(fā)生不同程度的擾動。

圖5 誘導NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織中差異代謝物(n=7)的(a)熱圖和(b)通路分析

2.4 LAMTOR1基因在肝臟炎癥惡性轉化中調控的代謝通路鑒定與分子機理

代謝組學結果分析發(fā)現(xiàn),當小鼠肝臟發(fā)生炎癥性損傷時己糖胺生物合成通路中的中間代謝產物谷氨酰胺、谷氨酸、UDP-GlcNAc等在LAMTOR1LKO小鼠肝臟中明顯上調(見圖6a)。已知機體內己糖胺的生物合成通路是氨基糖和核苷酸糖代謝的重要分支[22],該通路合成的終產物UDP-GlcNAc在后續(xù)的蛋白糖基化修飾中發(fā)揮重要作用,在癌癥[23]等疾病中參與線粒體、細胞質和細胞核內的相關蛋白的表達和功能調節(jié)。在LAMTOR1LKO小鼠肝臟中UDP-GlcNAc發(fā)生累積,推測可能是己糖胺的生物合成通路被激活,或者可能是蛋白糖基化過程對該化合物的利用受到阻礙。由于公共開放數(shù)據(jù)庫中NASH相關表達數(shù)據(jù)有限,接下來我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌相關樣本和GTEx(Genotype-Tissue Expression)中肝臟組織的基因表達數(shù)據(jù),對LAMTOR1與糖基轉移酶之一MGAT1的基因表達情況進行Pearson相關系數(shù)分析。得到的相關曲線結果見(見圖6b),在肝癌中LAMTOR1基因與MGAT1基因可能存在正調控的關系(R=0.47),啟示我們在小鼠NASH模型中,肝臟中LAMTOR1的敲除可能通過調控糖基轉移酶MGAT1的表達減少或者酶活降低,造成上游底物UDP-GlcNAc累積的情況出現(xiàn)。那么在NASH的疾病進展中,LAMTOR1與己糖胺合成產物的利用以及后續(xù)一些糖基轉移酶的調控關系則需要進一步的研究。

圖6 表征LAMTOR1在小鼠NASH模型(n=7)中對己糖胺生物合成通路的影響并分析肝癌里LAMTOR1與MGAT1的基因表達相關性

同時,在KO小鼠的肝臟中也觀測到了甲基化的重要甲基供體----代謝物S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的上調。SAM可在甲基轉移酶的作用下將甲基轉移給DNA和蛋白等生物分子,同時生成S-腺苷高絲氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAH)。除了SAH、SAM以外,在賴氨酸殘基上反應生成的產物三甲基賴氨酸也在KO小鼠的肝臟中明顯上調(見圖7)。同樣,對肝癌里LAMTOR1與蛋氨酸腺苷轉移酶MAT1A的基因表達情況,進行Pearson相關性分析。分析發(fā)現(xiàn)在肝癌中LAMTOR1基因與MAT1A基因可能存在負調控的關系(R=-0.47)(見圖7),說明在肝癌的進展中LAMTOR1的低表達可能會促進蛋氨酸腺苷轉移酶MAT1A的高表達或者酶活上調,從而促進甲基化供體SAM的產生。上述結果啟示在小鼠NASH模型中,LAMTOR1也可能通過對SAM產生的相關代謝酶的調控來影響小鼠NASH的進程及炎癥惡性轉化。

圖7 LAMTOR1在小鼠NASH模型中引起蛋白甲基化相關代謝物的變化和肝癌里LAMTOR1與MAT1A的基因表達相關性分析

另外,重要功能代謝物琥珀酰基-腺苷(succinyladenosine, SAdo)在LAMTOR1敲除的小鼠肝臟中也發(fā)生明顯的上調(見圖8a)。據(jù)文獻報道,腺苷基琥珀酸裂解酶ADSL缺乏的情況下機體內會出現(xiàn)SAdo的累積[24]。在肝癌數(shù)據(jù)庫中進行Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn),LAMTOR1與ADSL基因之間存在正向調控的關系(R=0.59)(見圖8b)。因此肝臟中LAMTOR1敲除可能會阻礙ADSL對于代謝物SAdo的降解,上調的SAdo水平將對小鼠肝臟的代謝調控產生影響從而參與到NASH的疾病進程及后續(xù)的炎癥惡性轉化中。此外,9-氧代十八碳二烯酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid, DHA)等不飽和脂肪酸和甘磷酸膽堿(glycerophosphorylcholine, GPC)在肝臟特異敲除LAMTOR1的NASH模型小鼠肝臟組織中也顯著下降(見圖9)。而已有的文獻報道NAFLD中不飽和脂肪酸水平的降低與肝臟疾病的進展程度相關[25],并檢測了肝臟中相關基因的表達情況[26],其中發(fā)現(xiàn)相對于單純脂肪變性樣本,NASH樣本中EPA和DHA占據(jù)肝臟總脂質的比例下降,說明這兩個不飽和脂肪酸水平的降低對于NASH的進展可能有促進作用。本研究建立的小鼠NASH模型中,肝臟特異敲除LAMTOR1的小鼠肝臟中EPA和DHA顯著下降,說明LAMTOR1基因的敲除在小鼠NASH的進程中可能發(fā)揮一個消極地促進作用。同時,本研究中發(fā)現(xiàn)肝臟特異敲除LAMTOR1的NASH小鼠肝臟中GPC水平降低。此外,基于核磁共振磷譜技術的NAFLD病人肝臟代謝結果[27],具有NASH相關癥狀的NAFLD病人相比無NASH特征的病人,肝臟中GPC水平降低。因此,可以推斷LAMTOR1在NASH發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

圖8 誘導NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織中的琥珀酰腺苷水平變化(n=7)和肝癌里LAMTOR1與ADSL的基因表達相關性分析

圖9 4個炎癥相關代謝物在誘導NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織中的變化(n=7)

3 結論

本研究用MCD飲食誘導小鼠發(fā)生肝臟炎癥性損傷,以此NASH疾病模型為平臺,借助基于液相色譜-質譜聯(lián)用的代謝組學手段,鑒定了肝臟特異性敲除LAMTOR1在小鼠肝臟中調控的重要代謝通路,并結合現(xiàn)有公共開放組數(shù)據(jù)庫進行預測分析,研究了LAMTOR1在NASH疾病進展乃至發(fā)展為更嚴重的肝癌過程中可能參與的分子調控機理。其中重要代謝物水平的變化、LAMTOR1與其他相關基因在肝癌中相關性預測結果都顯示LAMTOR1在NASH疾病及后續(xù)的炎癥惡性轉化中可能發(fā)揮著重要作用。但是,肝臟炎癥惡性轉化中LAMTOR1與鑒定到的關鍵代謝通路的直接關系還需要進一步的研究。