藜豆提取物左旋多巴對黑色素細胞的作用

郝益 孫銘健 邊策 高原 莊肖肖 王宏蘭

摘要：目的 研究藜豆提取物左旋多巴對體外培養(yǎng)的黑色素細胞雙向調(diào)節(jié)作用。方法 在體外原代培養(yǎng)小鼠黑色素細胞后傳代培養(yǎng)，用不同濃度藜豆提取物左旋多巴97.31mg/ml、146.02mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素細胞，觀察黑色素細胞增殖情況。結(jié)果 1. 4代空白組與對不同濃度對照組（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比對小鼠黑色素細胞的合成并無顯著影響（P>0.05）。5代空白組與不同濃度對照組（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比顯著促進小鼠黑色素細胞的合成量（P<0.05）。2. 4代黑色素細胞隨著給藥濃度的增大凋亡率逐漸增加，當(dāng)藥物濃度為146.02mg/mL作用于黑色素細胞5代時，發(fā)現(xiàn)藥物具有促進黑色素細胞生長的作用。當(dāng)藥物濃度為97.31mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素細胞5代時，發(fā)現(xiàn)藥物具有顯著抑制黑色素細胞生長的作用。結(jié)論 1. 適當(dāng)濃度（146.02mg/mL）的藜豆提取物左旋多巴能夠促進黑色素細胞的增殖。2. 濃度為97.31mg/mL、175.23mg/mL藜豆提取物左旋多巴抑制黑色素細胞的生長。

關(guān)鍵詞：黑色素細胞;藜豆;左旋多巴;細胞培養(yǎng)

藜豆（S.capitatum Kuntze）為豆科藜豆屬中以嫩莢及種子供食用的栽培種群，屬一年生纏繞性草本植物，別名虎豆、狗爪豆等。實驗結(jié)果表明藜豆提取物富含左旋多巴。[1]左旋多巴是黑質(zhì)紋狀體多巴胺以及皮膚細胞黑色素合成的底物，被廣泛地用于治療人類的帕金森病，而且在離體條件下，還選擇性地抑制人類黑色素瘤（Melanoma）色素細胞的生長。[2]

本實驗基于黑色素細胞培養(yǎng)體系探索藜豆提取物左旋多巴對于黑色素細胞的作用，筆者建立了體外藜豆提取物左旋多巴對于黑色素細胞作用的藥物模型，采用不同濃度藜豆提取物左旋多巴作用于黑色素細胞來觀察其對黑色素生物活性的影響。

1.藜豆對黑色素細胞的藥理作用

1.1黑色素細胞合成過程 酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下生成多巴繼而氧化為多巴醌，多巴醌發(fā)生多聚化反應(yīng)而形成無色的多巴素。在異構(gòu)酶的作用下，多巴素形成真黑色素?！?-4】

1.2藜豆的藥理作用 藜豆的主要成分為左旋多巴，左旋多巴為體內(nèi)合成多巴胺的前體物，經(jīng)血腦屏障進入中樞，經(jīng)多巴脫羧酶作用轉(zhuǎn)化多巴胺。[5]此外，藜豆及其變種在治療男性不育癥、降血糖、抗蛇毒等其他方面的藥理作用及其機制也是研究重點，相關(guān)的氨基酸、生物堿、多酚、蛋白質(zhì)等活性成分正在被逐步揭示。鑒于我國具有豐富的藥用植物資源，藜豆及其變種對于上述疾病的藥理作用等方面的深入研究和資源開發(fā)利用仍有待進一步重視和加強。[6]

1.3藜豆提取物左旋多巴對黑色素細胞的藥理作用 藜豆提取物左旋多巴，最終合成多巴胺，多巴胺在體內(nèi)氧化成多巴醌，多巴醌進入真黑素通路形成真黑素。[7]從而通過這一巧妙的方式，無需酪氨酸和多巴的參與形成黑色素。適用于酪氨酸缺乏患者，增強黑色素的形成.[8]

2.實驗材料與方法

2.1主要試劑及儀器 藜豆提取物（植提專家公司）;;胰蛋白酶（索萊寶公司）;DMEM（Hyclone公司）;新生牛血清（四季青公司）;中性蛋白酶（奧博星公司）;F12培養(yǎng)液（biosharp公司）;RPMI1640（biosharp公司）;中性蛋白酶（coolaber公司）;臺盼藍染色液（biosharp公司）;倒置顯微鏡（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院提供）。

2.2實驗方法

2.2.1藜豆提取物的制備（植提專家公司提供） 將藜豆粉碎為80目細粉，用30%乙醇 0.1%醋酸水溶液冷浸三次，每次20小時后過濾，減壓濃縮至豆粉的三倍。薄膜蒸發(fā)濃縮至析出左旋多巴，冷置24小時，過濾，用冷水洗滌制得粗品。將粗品用24倍量純水，10%活性炭重結(jié)晶，40℃鼓風(fēng)干燥制得藜豆提取物[9]。

2.2.2樣品液的配置 稱取藜豆提取物7.5g，溶于10mL 3%冰醋酸，加30mL 75%乙醇，用200目過濾網(wǎng)過濾再用10mL乙醇清洗過濾網(wǎng)。將濾液用蒸餾水稀釋到500mL，取5mL樣品，再次使用蒸餾水稀釋到500mL。

2.2.3紫外分光光度計測定方法及結(jié)果 分別取適量配好樣本液，在紫外波長280nm的范圍內(nèi)測量吸光值，并在標準品左旋多巴濃度圖上找出相應(yīng)濃度并計算含量。測量的吸光值為0.175，據(jù)計算測得藜豆提取物左旋多巴為8.56%。

2.2.3體外給藥細胞模型的建立 3g藜豆提取物與120mL黑色素培養(yǎng)基攪勻，配為25mg/mL藜豆提取物混合液。在細胞傳代第三代時，設(shè)立1、2、3號板作為空白對照組（對應(yīng)標為4、5、6號板），7號板加入黑色素培養(yǎng)基與0.22微米過濾后的藜豆提取物混合液2：1（97.31mg/mL藜豆提取物混合液），8號板加入培養(yǎng)基：藥物1：1（146.02mg/mL藜豆提取物混合液），9號板加入培養(yǎng)基2：3（175.23mg/mL藜豆提取物混合液）。加藥后培養(yǎng)48h，繼續(xù)培養(yǎng)7、8、9代細胞，觀察黑色素細胞數(shù)量變化。[10]

3.黑素細胞體外培養(yǎng)

3.1黑色素細胞培養(yǎng)基的配置 胎牛血清90mL，DMEM/F12培養(yǎng)基450mL，DMEM高糖培養(yǎng)基360mL，雙抗1mL，堿性成纖維細胞生長因子2g，加入碳酸氫鈉調(diào)PH到7.2-7.4，0.22um濾器過濾，分裝成12mL/瓶，做好標記，封口，4℃冷藏。

3.2黑色素細胞原代培養(yǎng) 取4只小鼠頸椎脫位法處死，用肥皂水和11號手術(shù)刀刀片小心將小鼠背部毛發(fā)刮除，用眼科剪和眼科鑷分別將4只小鼠背部皮膚取下。去除皮下組織，酒精浸泡2min再用含雙抗的PBS液（含青霉素、鏈霉素1mL/L）浸泡10min。用11號手術(shù)刀刀片將皮切成2-3 mm寬的皮條。放入到0.25%的Dispase I酶中，4℃消化20-24h。在超凈工作臺內(nèi)用眼科鑷、眼科剪將皮條的表皮、真皮分離，將分離出來的表皮剪碎，加入0.25%的胰蛋白酶，放入37℃水浴鍋內(nèi)消化10 min。加入等量的終止液終止胰蛋白酶的消化后用吸管吹打混合均勻。分別放入4個離心管中離心機1000 rpm離心10 min棄去上清。4支離心管加入DMEM培養(yǎng)基重懸，平均放入4個6孔培養(yǎng)板中，分別標記為原代1板、2板、3板、4板，加入黑色素細胞專用培養(yǎng)基，封口膜封口放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后換液進行傳代。[7]

3.3 黑素細胞傳代培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察黑色素細胞生長情況，培養(yǎng)板中細胞差不多鋪滿培養(yǎng)板時，吸去培養(yǎng)基。每孔加入1 mL的0.25%胰蛋白酶，蓋好培養(yǎng)板，十字搖晃，放入培養(yǎng)箱中37℃消化8 min、18min、28min，隨時觀察細胞消化情況。消化完成后，加入等量的終止液終止消化。用吸管反復(fù)吹打分別放入離心管中，離心機1000rpm離心10min。棄去上清液，每孔加入2mL的黑色素細胞專用培養(yǎng)基，重懸后吸取進行細胞計數(shù)，按照10^5細胞濃度將每個板重新接種到2個新的6孔細胞培養(yǎng)板中，封口膜封口、標記，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，采用配對t檢驗分析，P<0.05為差異具有顯著性。

4.實驗結(jié)果

4.1實驗數(shù)據(jù) 小鼠黑色素細胞傳代后進行每一代每號板mei4孔的觀察。在第二代1號板平均細胞數(shù)為432、2號板平均細胞數(shù)為597，3號板平均細胞數(shù)為658;在第三代培養(yǎng)時，細胞1號板平均細胞數(shù)為264、2號板平均細胞數(shù)為674，3號板平均細胞數(shù)為271，見表1。于第三代細胞給予干預(yù)處理，對照組加入同體積培養(yǎng)液，實驗組設(shè)立不同藥物濃度梯度（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）。在第四代1號板（記為4號板）平均細胞數(shù)為234、2號板（記為5號板）平均細胞數(shù)為583，3號板（記為6號板）平均細胞數(shù)為264，97.31mg/mL藜豆提取物混合液的7號板平均細胞數(shù)為264、146.02mg/mL藜豆提取物混合液8號板平均細胞數(shù)為355， 175.23mg/mL藜豆提取物混合液9號板平均細胞數(shù)為47;在第五代1號板（記為4號板）平均細胞數(shù)為173、2號板（記為5號板）平均細胞數(shù)為251，3號板（記為6號板）平均細胞數(shù)為112，97.31mg/mL藜豆提取物混合液的7號板平均細胞數(shù)為0、146.02mg/mL藜豆提取物混合液8號板平均細胞數(shù)為421， 175.23mg/mL藜豆提取物混合液9號板平均細胞數(shù)為0，見表2。

在97.31mg/mL，146.02mg/mL，175.23mg/mL不同藥物濃度下，隨著藥物濃度的不斷增大，4代黑色素細胞凋亡率不斷上升。當(dāng)細胞培養(yǎng)到第5代時，低濃度和高濃度藥物作用下，均出現(xiàn)了細胞損傷，相反，中濃度藥物作用下，黑色素細胞凋亡率較上一代有所減少，表現(xiàn)出藥物在適宜濃度下對黑色素細胞的促進作用。

第四代細胞培養(yǎng)中，空白組配對低、中、高藥物濃度組均未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。第五代細胞培養(yǎng)中，空白組配對低、中、高藥物濃度組均顯示出統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。綜合數(shù)據(jù)可知，其中，低、高濃度組藥物（97.31mg/mL、175.23mg/mL），表現(xiàn)出對黑色素細胞的抑制作用，而中濃度組藥物（146.02mg/mL）則表現(xiàn)出對黑色素細胞的促進生長的作用。

5.結(jié)論

4代空白組與對不同濃度對照組統(tǒng)計學(xué)相比均無明顯差異。5代空白組與不同濃度對照組（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。4代黑色素細胞隨著給藥濃度的增大凋亡率逐漸增加，當(dāng)藥物濃度為146.02mg/mL作用于黑色素細胞5代時，發(fā)現(xiàn)藥物具有促進黑色素細胞生長的作用。當(dāng)藥物濃度為97.31mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素細胞5代時，發(fā)現(xiàn)藥物具有顯著抑制黑色素細胞生長的作用。

6.分析與討論

黑色素是由3，4-二羥苯丙氨酸或酪氨酸經(jīng)過系列反應(yīng)形成，在動物體內(nèi)，黑色素是一種存在于皮膚、毛發(fā)的黑褐色的色素，合成并存儲于黑素細胞中。黑色素能對抗紫外線，它能夠?qū)⒔^大多數(shù)的紫外線轉(zhuǎn)換為熱量散失，避免紫外線對深層細胞造成損傷。因此，皮膚才能夠保持正常的色度。當(dāng)黑色素合成減少，皮膚就會造成色素缺失，形成白斑，會產(chǎn)生一些疾病，例如白癜風(fēng)、白化癥等。

各種色素缺失性皮膚病，是以皮膚局部功能性黑素細胞缺失為主要病理性特征的一類難治性皮膚病，目前尚無滿意的臨床治療方案。在正常生理狀態(tài)下，黑色素和合成與代謝處于動態(tài)平衡中。酪氨酸酶與血液中的酪氨酸發(fā)生反應(yīng)，生成黑色素前體物質(zhì)“多巴”，多巴經(jīng)系列氧化還原反應(yīng)可以生成黑色素。本實驗采用藜豆提取物左旋多巴作用于黑素細胞，探究藥物對黑色素細胞的雙向調(diào)節(jié)作用[11]。

本文驗證了低、高濃度組藜豆提取物左旋多巴藥物（97.31mg/mL、175.23mg/mL），表現(xiàn)出對黑色素細胞的抑制作用，而中濃度組藥物（146.02mg/mL）則表現(xiàn)出對黑色素細胞的促進生長的作用。其機制可能為;第一，藥物促進DNA損傷組織中細胞凋亡，而中等濃度下藥物促進未凋亡細胞快速增殖;第二，藜豆提取物左旋多巴作用于細胞后，負反饋調(diào)節(jié)抑制酪氨酸酶活性，只有在中等濃度下對黑色素細胞的增殖作用大于酪氨酸酶活性減低影響;第三，藜豆提取物左旋多巴可能參與信號通路參與或調(diào)控了某一成分對黑色素合成的抑制作用，而在中等藥物濃度下此作用被翻轉(zhuǎn);其四，需進一步明確黑色素其他調(diào)控機制，如促進黑色素分解及代謝，調(diào)控酪氨酸酶翻譯后的修飾，抑制角質(zhì)形成細胞對黑素小體的攝取和吞噬等，藜豆提取物左旋多巴對黑色素細胞的作用可能受到以上幾個方面的共同作用。[12]

而在臨床上常常使用左旋多巴來治療帕金森患者，有證據(jù)表明這些患者患黑色素瘤的幾率卻大大增加。我們希望可以通過此次實驗探究出藜豆提取物左旋多巴與黑色素細胞是否有著直接或間接的聯(lián)系，以此來進一步探討臨床上是否可以使用這種藥物來影響患者的黑色素細胞含量。現(xiàn)階段的藜豆及其變種的研究還處于藥效學(xué)驗證階段，除了對黑色素的作用外，藜豆對防治帕金森、男性不育癥的治療等疾病積極作用仍是有利的。雖然其成分的具體藥理作用還有待進一步的研究與發(fā)現(xiàn)，但如果我們能找到既能有效治療帕金森，又能最大程度上減少患黑色素瘤的幾率時的左旋多巴使用量，那對臨床上左旋多巴相關(guān)藥物應(yīng)用等方面開辟了更新更廣的前景。

綜上所述，藜豆提取物左旋多巴在適當(dāng)濃度146.02mg/mL能夠促進黑色素細胞的增殖。濃度為97.31mg/mL、175.23mg/mL藜豆提取物左旋多巴抑制黑色素細胞的生長。因此，藜豆提取物左旋多巴對黑色素細胞具有雙向調(diào)節(jié)的作用。我們將會在接下來的實驗中，設(shè)立更加精確的給藥梯度以更深入地探究藜豆提取物左旋多巴促進黑色素細胞增殖的給藥范圍。同時，有關(guān)黑色素相關(guān)檢測的一些實驗學(xué)方法如氫氧化鈉裂解法、比色法定量檢測、Masson-Fontana氏黑色素染色法等也仍需在后續(xù)實驗中補充。

此外，關(guān)于藜豆提取物左旋多巴對小鼠黑色素細胞的作用機制尚未探索，希望在之后的實驗中能明確于黑色素細胞密切相關(guān)酶mRNA、DNA表達水平，使得藜豆提取物左旋多巴在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用更加廣泛。[13]

參考文獻：

[1]Liu Shuyuan，Zhang Qiqi，Guan Changfei，Wu Daying，Zhou Tianshan，Yu Youben. Transcription factor WRKY14 mediates resistance of tea plants （Camellia sinensis （L.） O. Kuntze） to blister blight[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2021（prepublish）.

[2]潘鵬偉，王雪晶，丁雪冰，何一昕，梁東曉，方艷博，劉丹丹，滕軍放，苗旺.帕金森病與癌癥發(fā)病相關(guān)機制研究進展[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2016，19（06）：123-125.

[3]馬梓育，陸洋.體內(nèi)黑色素合成、調(diào)控及常用天然、中藥來源的黑色素抑制劑[J].中國中藥雜志，2020，45（24）：5898-5916.

[4]王磊，劉軍.黑色素形成分子機制研究進展[J].新疆大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2019，36（04）：468-474+499.

[5]鄧霖芳，譚蓓蓓，竇冕，郝麗莉，劉江云，楊世林.HPLC同時測定貓豆中左旋多巴及其衍生物含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（07）：845-848.

[6]溫紅，譚蓓蓓，竇冕，鄧霖芳，單佳晶，李君山，劉江云.藜豆及其變種的藥理作用研究進展[J].中國藥房，2018，29（04）：568-571.

[7]Roy Swarup，Rhim Jong-Whan. Fabrication of pectin/agar blended functional film： Effect of reinforcement of melanin nanoparticles and grapefruit seed extract[J]. Food Hydrocolloids，2021，118.

[8]羅曉君，蔣詠梅，章文賢.黑色素的生成機制、相關(guān)疾病及抑制策略概述[J].生物學(xué)教學(xué)，2021，46（02）：5-7.

[9]溫紅，譚蓓蓓，竇冕，鄧霖芳，單佳晶，李君山，劉江云.藜豆及其變種的藥理作用研究進展[J].中國藥房，2018，29（04）：568-571.

[10]石占全. 小鼠黑色素細胞體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究[D].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[11]李士俠. 牛樟芝提取物對黑素細胞的影響[D].齊魯工業(yè)大學(xué)，2017.

[12]王蔚，陳琳，王偉偉，張建勇，江和源.茶葉有效成分對黑色素形成的抑制作用[J].茶葉科學(xué)，2021，41（01）：7-18.

[13]劉玉榮，曹雅菲，雒洋洋，高怡，劉景源，劉君星.丁香精油對黑色素細胞抗氧化特性及黑色素生成的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2021，44（01）：48-49+52.

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目《藜豆提取物左旋多巴對黑色素細胞的作用》（202011230065）