永州野生茶資源分布及其親緣關(guān)系分析

盧作斌 沈程文 楊旭初 何哲 唐六合 朱青輝 程艷紅

摘要：江華苦茶是湖南省珍貴的地方茶樹種質(zhì)資源之一。近年來，對永州野生茶樹資源的調(diào)查主要圍繞江華瑤族自治縣的多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，對其他縣區(qū)涉及很少。從永州地理及自然環(huán)境特點(diǎn)上看，適合野生茶的生長區(qū)域應(yīng)更為廣闊。因此，對其具體分布情況和種群特征作進(jìn)一步研究十分必要。對永州3條山系分布的原始型茶樹資源進(jìn)行采樣比對分析，所調(diào)查區(qū)域的野生茶資源表型特性為小喬木、中葉類種，水浸出物含量32.8%～35.4%，茶多酚含量21.27%～23.55%。分子標(biāo)記結(jié)果顯示永州區(qū)域內(nèi)野生茶樹間關(guān)聯(lián)度較大，均可與江華苦茶聚為一類，且具有良好的發(fā)酵茶加工特性。

關(guān)鍵詞：永州野生茶;江華苦茶;茶樹資源;聚類分析;主導(dǎo)品種

Distribution of Wild Tea Resources in

Yongzhou and Analysis of Its Relationship

LU Zuobin1， SHEN Chengwen2， YANG Xuchu1，3， HE Zhe1，3， TANG Liuhe1，3， ZHU Qinghui1，3， CHENG Yanhong1，3

1. Futian Tea House， Yongzhou 425000， China; 2. Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China;

3. Yongzhou Tea Research Institute， Yongzhou 425000， China

Abstract： Jianghua bitter tea is one of the precious local tea germplasm resources in Hunan province. In recent years，the investigation of wild tea tree resources in Yongzhou has mainly focused on villages and towns in Jianghua Yao?Autonomous County， and has rarely? involved few other counties and districts. According to the characteristics of?Yongzhou geography and natural environment， the growing area suitable for wild tea should be more extensive.?Therefore， it is necessary to further study its specific distribution and population characteristics. The results show thatthe phenotypic characteristics of wild tea resources were small trees and mid-leaf species， and the biochemical?characteristics were as follows： water extract ranged from 32.8% to 35.4%， tea polyphenol ranged from 21.27% to?23.55%. The results of molecular markers showed that the relationship between wild tea trees in Yongzhou area arehighly correlated and they could be clustered with Jianghua bitter tea. They had good processing characteristics.?Therefore， Jianghua bitter tea， as a unique local tea resource in Yongzhou， has the advantage of becoming the dominantcultivar in local tea industry. While the dominant product of Yongzhou tea can be classified into black tea or other?fermented tea.

Keywords： wild tea resources in Yongzhou， Jianghua bitter tea， tea resources， cluster analysis， dominant cultivars

永州位于湖南省南部，區(qū)域內(nèi)主要山脈有越城嶺—四明山系、都龐嶺—陽明山系、萌渚嶺—九嶷山系，海拔400 m以上的山嶺面積1.2萬km2，占總面積的50%。永州屬亞熱帶大陸性季風(fēng)濕潤氣候，四季分明，平均氣溫17.6 ℃，平均降雨量1 200～1 900 mm，山區(qū)多于平崗區(qū)[1]，地理與氣候條件適合茶樹生長。

江華苦茶的研究源于20世紀(jì)60年代，已經(jīng)在茶樹群體歸類、生化成分及適制性等方面有較全面的研究。陳亮等[2]從形態(tài)學(xué)特征將江華苦茶歸屬阿薩姆茶類;李丹等[3]從形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、酶學(xué)、化學(xué)以及分子生物學(xué)方面研究江華苦茶種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，認(rèn)為江華苦茶屬過渡類型茶樹，且親緣關(guān)系更接近于原始型;劉寶祥等[4]對江華苦茶的生化成分、適制性和適應(yīng)性等研究表明，江華苦茶的茶多酚及其兒茶素類物質(zhì)含量較高，制紅茶品質(zhì)優(yōu)良;李賽君等[5]從江華苦茶群體資源中選育出優(yōu)質(zhì)高咖啡堿紅茶新品種瀟湘紅21-1。劉寶祥等[4]發(fā)現(xiàn)江華苦茶原始群落主要分布在江華瑤族自治縣的大圩、碼市、二岔河、具江、湘江、河路口等鄉(xiāng)鎮(zhèn)。永州其他縣區(qū)同樣廣泛分布著野生茶資源，其生物學(xué)特征及群體歸類如何少有研究報(bào)道，且從永州地理及自然環(huán)境特點(diǎn)上看，適合野生茶的生長區(qū)域應(yīng)更為廣闊。因此，對永州野生茶樹的具體分布情況和種群特征作進(jìn)一步調(diào)查研究十分必要。

一、材料與方法

1. 調(diào)研方法

對永州3條山系內(nèi)分布的原始型茶樹資源進(jìn)行調(diào)研，并對野生茶資源集中分布區(qū)域的茶樹資源進(jìn)行采樣分析。

調(diào)研方法依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)業(yè)野生植物調(diào)查技術(shù)規(guī)范》（NY/T 1669—2008），按4個(gè)步驟進(jìn)行。第一步，文獻(xiàn)調(diào)研：綜合收集各種文獻(xiàn)資料，整理分析調(diào)查對象的分布、數(shù)量等歷史載錄情況，為走訪調(diào)查制定大致的行程路線。第二步，走訪調(diào)查：結(jié)合文獻(xiàn)資料收集數(shù)據(jù)，經(jīng)初步篩查后，在調(diào)查區(qū)域內(nèi)，通過走訪咨詢經(jīng)驗(yàn)豐富的群眾、技術(shù)人員、有關(guān)專家和農(nóng)戶等，了解當(dāng)?shù)匾吧栀Y源種類、分布、種群數(shù)量等相關(guān)信息。第三步，野外調(diào)查，收集樣本：按設(shè)計(jì)的調(diào)查路線，進(jìn)行實(shí)地踏查。對現(xiàn)場感觀有一定特質(zhì)的群體，采集標(biāo)本作進(jìn)一步鑒定。拍攝相關(guān)影像資料和GPS定位，完整載錄分布點(diǎn)數(shù)等數(shù)據(jù)信息。第四步，檢驗(yàn)、檢測：對野外采集的茶標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)、化學(xué)、分子識別檢測，為確定茶樹種群及其相似性分析提供依據(jù)。

2. 生化成分分析

對收集到的野生茶樹鮮葉及利用其加工而成的紅茶樣品進(jìn)行生化成分檢測，檢測指標(biāo)為水浸出物、茶多酚、游離氨基酸和咖啡堿，檢測方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)。

3. 簡單重復(fù)序列（SSR）分析

DNA提取使用Ezup柱式植物組織基因組DNA抽屜試劑盒，編號B518261，生工生物（上海）工程股份有限公司生產(chǎn)。

簡單重復(fù)序列分析具體步驟如下：取96孔板使用記號筆分別標(biāo)明板名，制作SSR檢測表，并生成上機(jī)表。使用連續(xù)加樣器，吸取990 μL HIDI和10 μL LIZ500混合物，加入到96孔板，每孔10 μL。將96孔板置于平板離心機(jī)中，12 000 r/min離心15 s。對照檢測表，在96孔板對應(yīng)的孔中加入1 μL樣品。將96孔板再次離心后置于PCR儀，引物信息和PCR反應(yīng)條件分別如表1、表2。反應(yīng)結(jié)束后立即將96孔板置于冰水混合物上急速冷卻后使用Genemapper軟件進(jìn)行SSR分析。

二、結(jié)果與分析

1. 野生茶樹主要分布區(qū)

調(diào)查結(jié)果顯示，永州野生茶樹資源主要分布在寧遠(yuǎn)、藍(lán)山等8個(gè)縣（區(qū)），各縣（區(qū)）具體分布地點(diǎn)如表3。因東安縣川巖、大盛等地野生茶分布面積不大，調(diào)查中僅對寧遠(yuǎn)棉花坪排山坳村等7個(gè)縣（區(qū)）的8個(gè)野生茶資源集中分布地實(shí)地采樣進(jìn)一步分析，具體采樣地點(diǎn)見表4。

2. 形態(tài)學(xué)特征

從調(diào)查結(jié)果看，野生茶樹大多分布在山谷沿岸山坡上，以間伐性林地、竹地為密集區(qū)，植株基本處于林木冠層之下。分布區(qū)域海拔在400～1 500 m之間，以海拔400～1 000 m區(qū)域?yàn)橹鳌?/p>

各采集點(diǎn)野生茶樹植株形態(tài)特征如表5。因湖南省茶葉研究所在20世紀(jì)70年代就對江華縣的野生茶形態(tài)學(xué)、生理等方面做了較系統(tǒng)成熟的研究，本次江華采集的樣品只做SSR分析，形態(tài)、生理方面的數(shù)據(jù)參考前人的研究結(jié)果[3-4，6-8]。野生茶樹的植株為小喬木、中葉類種，樹高一般在5 m以下，主干直徑3～25 cm，3～4個(gè)一級分枝，葉片長9～14 cm、葉寬3～5 cm，葉片大多橢圓形、葉尖漸尖，葉脈9～12對。

3. 生化成分

各取樣茶樹秋季對夾葉的生化成分含量見表6。江華苦茶適制紅茶，成品茶以春茶為主，因此，取各采集點(diǎn)茶樹春季一芽二葉制成紅茶后檢測生化成分含量，檢測結(jié)果見表7。

4. SSR檢測結(jié)果

在道縣清塘鎮(zhèn)小塘村等6個(gè)野生茶密集分布區(qū)，每個(gè)區(qū)采集3個(gè)鮮葉樣品，對這18個(gè)樣品（表8）作SSR檢測及相似性歸集。

DNA分子圖譜（圖1）顯示，6個(gè)野生茶樣品的DNA表觀圖譜很相似。進(jìn)一步做聚類相似性歸集，UPGMA聚類樹（圖2）顯示，各資源之間相似系數(shù)在0.45～0.65之間，符合江華苦茶群體各單株間存在較高的遺傳多樣性（相似系數(shù)0.44～0.84），各茶樹資源之間相似系數(shù)在0.45～0.65之間。18個(gè)野生茶樹資源總共可分為3大類，江華苦茶8號和道縣1號樣品分別聚為一類，江華苦茶9號與零陵10～12號、金洞13～15號和雙牌16～18號樣品聚為一類，江華苦茶7號與道縣2～3號和雙牌4～6號樣品聚為一類。在聚類結(jié)果中，不同類群的單株間也存在較為明顯的表型差異[9]，除道縣1號樣品外，其他永州野生茶資源都與江華苦茶群體親緣關(guān)系較近。

三、小結(jié)與討論

本研究對永州3條山系內(nèi)分布的原始型茶樹資源進(jìn)行調(diào)研，并對野生茶資源典型代表區(qū)域的茶樹資源進(jìn)行采樣分析。植株形態(tài)特征及現(xiàn)場考察發(fā)現(xiàn)，所有永州野生茶資源均符合小喬木主要形態(tài)學(xué)特征。從采樣地點(diǎn)的地理信息和植株分布零散、無規(guī)律、密度稀少的特征看，所采樣本屬于地方原始種，不是人工種植品種。至于植株形態(tài)的一級分枝部位有較大差異的原因，可能在于采集點(diǎn)雙牌單江的茶樹資源因低部位分枝被截?cái)?，在主? m處有明顯疤痕，所以現(xiàn)有分枝部位上移;金洞、道縣、寧遠(yuǎn)的茶樹資源均存在被低位砍伐重生跡象，但主干分明;陽明山的茶樹資源地處高海拔，植株有明顯主干，但樹冠高度及寬幅受每年積雪覆蓋難以擴(kuò)張。

江華苦茶作為湖南省4個(gè)地域特色茶樹品種之一，其茶多酚及兒茶素類物質(zhì)含量較高，是適制紅茶的特異種質(zhì)資源，制作的紅茶品質(zhì)優(yōu)良，香氣獨(dú)特，花蜜香濃郁，湯色紅濃，滋味濃醇，收斂性強(qiáng)，葉底紅亮[10-12]，本研究采用功夫紅茶加工工藝也得到了優(yōu)質(zhì)的野生紅茶產(chǎn)品。生化成分檢測結(jié)果顯示，來自不同縣（區(qū)）的茶樹資源其水浸出物、茶多酚、氨基酸、咖啡堿含量與江華苦茶樣品含量無明顯差異。

綜上所述，永州區(qū)域內(nèi)分布的原始型茶樹資源可與江華苦茶原始型群體種聚為一類，親緣關(guān)系近。

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