花生肽對小鼠耐缺氧作用的研究

李臻 于曉晨 胡佳妮 郝云濤 劉欣然 劉睿 珠娜 李勇

摘 要：目的：探討花生肽是否對小鼠具有耐缺氧作用。方法：將150只SPF級BALB/c雄性小鼠隨機分為5組：1個空白對照組、1個乳清蛋白組（500 mg/kg BW）和3個花生肽劑量組（250、500、1 000 mg/kg BW）。連續(xù)灌胃30 d后，測定各組小鼠在常壓缺氧環(huán)境下的存活時間及耗氧量，在亞硝酸鈉中毒導(dǎo)致的缺氧狀況下的存活時間以及急性腦缺血導(dǎo)致的缺氧狀況下的存活時間，來觀察花生肽對小鼠的耐缺氧作用。結(jié)果：與空白對照組相比，花生肽各劑量組小鼠在常壓缺氧環(huán)境下的存活時間及耗氧量顯著增加，在急性腦缺血及亞硝酸鈉中毒所致的缺氧狀態(tài)下的存活時間也明顯延長（P<0.05）;并且與乳清蛋白組相比，花生肽中、高劑量組小鼠在三種缺氧狀態(tài)下的存活時間均明顯延長（P<0.05）。結(jié)論：花生肽對小鼠具有耐缺氧作用。

關(guān)鍵詞：花生肽;耐缺氧;存活時間

缺氧是多種疾病共有的病理過程，也是引起機體損傷乃至死亡的重要原因之一，一方面會影響機體內(nèi)多個系統(tǒng)尤其是神經(jīng)和呼吸系統(tǒng)的正常功能，另一方面還會抑制供能物質(zhì)的有氧氧化過程，影響機體的能量代謝[1-2]，其主要癥狀一般包括心跳加快、耳鳴目眩、記憶力減退、頭暈、惡心、嘔吐等，嚴(yán)重者還會出現(xiàn)全身乏力、器官衰竭、休克甚至死亡[3-5]。隨著社會的發(fā)展，缺氧已經(jīng)成為繁忙都市中一種不可忽視的病癥，中老年人及腦力勞動者均是缺氧的高發(fā)人群[6]。因此，尋求安全有效的缺氧防治手段，緩解缺氧對機體的損傷已經(jīng)成為多學(xué)科共同關(guān)注的熱點。近年來，天然食物活性成分引起了研究者的關(guān)注，并有大量研究證實了天然食物活性成分具有耐缺氧功效，對耐缺氧保健食品的開發(fā)應(yīng)用具有重要的意義。

花生是我國最重要的油料作物之一，營養(yǎng)價值極高。除了豐富的不飽和脂肪酸、維生素E、黃酮類活性物質(zhì)外，花生蛋白也是一種藥食兩用的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[7]?；ㄉ械鞍踪|(zhì)含量占總量的24%～36%，其中必需氨基酸約為總氨基酸的1/3，必需氨基酸種類齊全且組成比與人體近似，谷氨酸和天門冬氨酸含量較高[8]。研究顯示，花生蛋白具有提高記憶力、促進腦細胞發(fā)育、抗衰老等作用[9]?；ㄉビ秃蟮母碑a(chǎn)物花生粕中蛋白質(zhì)含量極高，通過生物酶解技術(shù)從花生粕中制備的花生肽具有分子量小、溶解度高、比蛋白質(zhì)和氨基酸吸收速率快、吸收效率高、安全性高等特點。研究顯示，花生肽具有抗氧化、抗菌、提高免疫力、抗疲勞等多種生理活性，逐漸顯示出其重要的營養(yǎng)作用及廣泛的應(yīng)用前景[10-12]。目前有關(guān)花生肽耐缺氧作用的研究尚處于空白，因此本研究以花生肽為原料，探討其對小鼠的耐缺氧作用，旨在為花生肽在提高缺氧耐受力領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與受試物

選擇150只6～8周齡SPF級BALB/c雄性小鼠，初始體重為25～30 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部屏障級動物室，室內(nèi)溫度控制在（22±2）℃，相對濕度控制在50%～60%，室內(nèi)光暗周期節(jié)律控制在12 h：12 h，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，期間動物自由進食、飲水。

花生肽，呈淡黃色的固體粉末，主要成分為小分子肽混合物，其中分子質(zhì)量小于2 000 Da的小分子低聚肽占80%以上。

1.2 試劑與儀器

250 mL磨口瓶，橡膠塞，玻璃管，上海禾汽玻璃儀器有限公司;亞硝酸鈉，AR，重慶百倍精細化工廠;鈉石灰，AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司;凡士林。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與干預(yù) 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，將動物按體重隨機分為5組：1個空白對照組、1個乳清蛋白對照組（500 mg/kg BW）和花生肽低、中、高劑量組（250、500、1 000 mg/kg BW），每組30只。每日經(jīng)灌胃給予受試樣品，空白對照組給予蒸餾水，其余干預(yù)組給予相應(yīng)濃度的受試物溶液，灌胃量為0.1 mL/10 g BW。動物每周稱體重1次，根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃量，觀察動物的一般情況，包括攝食、毛色、精神狀態(tài)、日常活動情況等，連續(xù)灌胃干預(yù)30 d。干預(yù)結(jié)束后每組隨機分為A、B、C等3個亞組，A亞組小鼠進行常壓耐缺氧實驗，B亞組小鼠進行亞硝酸鈉中毒存活實驗，C亞組小鼠進行急性腦缺血性缺氧實驗。

1.3.2 常壓耐缺氧實驗 末次灌胃1 h后，將A亞組小鼠分別放入250 mL磨口瓶中（盛有10 g鈉石灰），每瓶1只，利用橡膠塞和玻璃管與裝有水的100 mL量筒相連，磨口瓶與量筒之間再連接1個緩沖瓶以防止水倒吸進入磨口瓶內(nèi)，用凡士林將各連接處及瓶口密封，將玻璃管插入液面之下（附圖）。立即計時，以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠因缺氧死亡的時間及耗氧量，并計各干預(yù)組小鼠相較于空白對照組小鼠存活時間的延長率及耗氧量的增加率。

存活時間延長率=（干預(yù)組小鼠存活時間-空白對照組小鼠存活時間）/（空白對照組小鼠存活時間）*100%（1）

耗氧量增加率=（干預(yù)組小鼠耗氧量-空白對照組小鼠耗氧量）/（空白對照組小鼠耗氧量）*100%（2）

1.3.3 亞硝酸鈉中毒存活實驗 末次灌胃1 h后，對B亞組小鼠腹腔注射亞硝酸鈉240 mg/kg BW，注射完成后立即計時，以小鼠呼吸停止為終點，觀察小鼠亞硝酸鈉中毒后的存活時間，并計算各干預(yù)組小鼠相較于空白對照組小鼠存活時間的延長率，計算方法同1.3.2。

1.3.4 急性腦缺血性缺氧實驗 C亞組小鼠在末次灌胃1 h后，用剪刀自頸部逐只斷頭，小鼠斷頭后開始張口喘氣時立即用秒表計時，觀察小鼠從開始張口喘氣至停止呼吸的時間，并計算各干預(yù)組小鼠相較于空白對照組小鼠存活時間的延長率，計算方法同1.3.2。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用R 3.5.2軟件進行單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生肽對小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響

相較于空白對照組，乳清蛋白組和花生肽各劑量組小鼠常壓耐缺氧存活時間均顯著延長（P<0.05），延長率分別為9.89%（乳清蛋白組）、12.19%（花生肽低劑量組）、22.03%（花生肽中劑量組）、23.51%（花生肽高劑量組）;相比于乳清蛋白組，花生肽中、高劑量組的小鼠在常壓缺氧環(huán)境下的存活時間均顯著延長（P<0.05）。此外，與空白對照組相比，乳清蛋白組和花生肽低、中、高劑量組小鼠常壓耐缺氧耗氧量均顯著增加，增加率分別為8.17%、32.68%、41.18%、43.46%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與乳清蛋白組相比較，花生肽各劑量組小鼠耗氧量均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 花生肽對小鼠亞硝酸鈉中毒缺氧存活時間的影響

相較于空白對照組，花生肽低、中、高劑量組小鼠亞硝酸鈉中毒缺氧存活時間均顯著延長，延長率分別為22.57%、28.68%、32.40%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），乳清蛋白組則無顯著差異;相較于乳清蛋白組，花生肽中、高劑量組小鼠在亞硝酸鈉中毒所致缺氧狀態(tài)下的存活時間均顯著延長（P<0.05）（表2）。

2.3 花生肽對小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間的影響

與空白對照組相比，乳清蛋白組及花生肽低、中、高劑量組小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間均顯著延長（P<0.05），延長率分別為10.27%、22.86%、25.62%、29.57%;與乳清蛋白組相比，花生肽低、中、高劑量組小鼠在急性腦缺血所致缺氧狀態(tài)下的存活時間均明顯延長（P<0.05）（表3）。

3 討論

缺氧廣泛地存在我們的生活和工作中，輕度缺氧主要會引起機體的代償反應(yīng)，重度缺氧則會導(dǎo)致中樞神經(jīng)、循環(huán)、呼吸等多個系統(tǒng)及組織和細胞的功能障礙[13-14]。耐缺氧能力的提高即是提高機體儲備和利用氧的能力以及組織細胞對缺氧環(huán)境的適應(yīng)能力。有文獻報道乳清蛋白的攝入增加可以提高機體的耐缺氧能力[15]，故本研究設(shè)立了與花生肽蛋白質(zhì)含量相當(dāng)?shù)娜榍宓鞍讓φ战M，用來探索花生肽的耐缺氧功效是來源于小分子肽類物質(zhì)的活性還是由于單純的蛋白質(zhì)攝入增加所致。封閉的磨口瓶中氧氣含量有限，會隨著小鼠的呼吸形成缺氧環(huán)境，小鼠在常壓密閉環(huán)境下的存活時間可以反映其對缺氧的耐受能力[16]。傳統(tǒng)的常壓耐缺氧實驗方法只能測量小鼠在廣口瓶中的存活時間，改進后的實驗裝置利用橡膠管將廣口瓶與緩沖瓶及裝有水的量筒相連接，由于小鼠呼吸造成廣口瓶內(nèi)氣壓下降，液體會通過橡膠管進入緩沖瓶中，觀察量筒液面下降的體積即可測量小鼠的耗氧量[17]。本研究顯示，與空白對照組相比，花生肽低、中、高劑量組小鼠常壓耐缺氧存活時間顯著延長，分別延長了12.19%、22.03%、23.51%，乳清蛋白組延長了9.89%，并且與乳清蛋白組相比，花生肽中、高劑量組小鼠存活時間顯著延長;此外，與空白對照組及乳清蛋白對照組相比，花生肽各劑量組小鼠常壓耐缺氧耗氧量均顯著增加。提示花生肽可以提高小鼠的常壓耐缺氧能力，且效果優(yōu)于乳清蛋白。

二價鐵血紅蛋白可以攜帶氧，而三價鐵血紅蛋白則不具有攜氧能力，腹腔注射亞硝酸鈉會將血紅蛋白中的二價鐵氧化為三價鐵，造成血紅蛋白攜氧能力的下降，導(dǎo)致組織缺氧的發(fā)生[18]。在本研究中，相較于空白對照組，花生肽低、中、高劑量組小鼠亞硝酸鈉中毒缺氧存活時間分別延長了22.57%、28.68%、32.40%，乳清蛋白組小鼠的存活時間則無明顯的延長，提示花生肽對小鼠因亞硝酸鈉中毒引起的缺氧狀況具有一定的緩解作用，可延長其中毒后存活時間。

大腦的氧氣供應(yīng)需要依賴于血流。斷頸后小鼠大腦的血供停止，氧氣供應(yīng)也隨之停止，此時原有的血液和氧短暫地維持了大腦的功能，繼而出現(xiàn)規(guī)律張口喘氣的現(xiàn)象;以喘氣時間為指標(biāo)，可以觀察花生肽對小鼠急性腦缺血性缺氧的保護作用[19]。本實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，花生肽低、中、高劑量組小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間分別延長了22.86%、25.62%、29.57%，乳清蛋白組延長了10.27%;此外，相較于乳清蛋白組，花生肽各劑量組小鼠存活時間也顯著延長。提示花生肽對小鼠急性腦缺血引起的缺氧具有保護作用，可以延長小鼠斷頭后張口喘氣的時間，且其保護作用比乳清蛋白更強。

綜上，本研究結(jié)果表明，花生肽能延長小鼠常壓耐缺氧存活時間、亞硝酸鈉中毒存活時間和急性腦缺血性缺氧存活時間，對小鼠具有耐缺氧作用，但其中的機制尚未明確，需要進一步研究探討。

4 結(jié)論

本研究以空白對照組和乳清蛋白組為對照，以小鼠在常壓缺氧環(huán)境下的存活時間及耗氧量、在亞硝酸鈉中毒及急性腦缺血所致的缺氧狀態(tài)下的存活時間為指標(biāo)，探討花生肽對小鼠的耐缺氧作用。實驗結(jié)果顯示，花生肽可以顯著延長小鼠常壓耐缺氧存活時間、亞硝酸鈉中毒存活時間和急性腦缺血性缺氧存活時間，并且效果優(yōu)于乳清蛋白，表明花生肽具有耐缺氧作用，但其作用機制有待進一步探討。

參考文獻

[1]MacIntyre N R.Tissue hypoxia：implications for the respiratory clinician[J].Respir Care，2014，59（10）：1590-1596.

[2]Jha N K，Jha S K，Sharma R，et al.Hypoxia-induced signaling activation in neurodegenerative diseases：targets for new therapeutic strategies[J].J Alzheimers Dis，2018，62（1）：15-38.

[3]Dousset E，Decherchi P，Grelot L，et al.Comparison between the effects of chronic and acute hypoxemia on muscle afferent activities from the tibialis anterior muscle[J].Exp Brain Res，2003，148（3）：320-327.

[4]Johnson B D，Joseph T，Wright G，et al.Rapidity of responding to a hypoxic challenge during exercise[J].Eur J Appl Physiol，2009，106（4）：493-499.

[5]滕進忠，梁艷，邵人杰.高壓氧抗疲勞作用機制及研究進展[J].人民軍醫(yī)，2010，53（11）：879-880.

[6]羅翔丹，潘風(fēng)光，張鐵華，等.鹿茸多肽對小鼠耐缺氧和抗疲勞能力的影響[J].食品科學(xué)，2008，29（4）：386-388.

[7]劉連紅，陳飛，張麗，等.花生的藥用成分及其提取分離技術(shù)的研究進展[J].生物加工過程，2018，16（4）：40-48.

[8]Toomer O T.Nutritional chemistry of the peanut（Arachis hypogaea）[J].Crit Rev Food Sci Nutr，2018，58（17）：3042-3053.

[9]鄧源喜，張姚瑤，董曉雪，等.花生營養(yǎng)保健價值及在飲料工業(yè)中的應(yīng)用進展[J].保鮮與加工，2018，18（6）：166-169.

[10]劉麗娜，何東平，張聲華，等.化學(xué)發(fā)光法對花生多肽的體外抗氧化活性和對DNA損傷的保護作用的研究[J].中國糧油學(xué)報，2011，26（4）：69-73.

[11]陳彤，王常青，白云云，等.花生餅粕酶解多肽抑菌作用的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2015，4（7）：23-25.

[12]Ye X Y，Ng T B.Hypogin，a novel antifungal peptide from peanuts with sequence similarity to peanut allergen[J].J Pept Res，2001，57（4）：330-336.

[13]Darby I A，Hewitson T D.Hypoxia in tissue repair and fibrosis[J].Cell Tissue Res，2016，365（3）：553-562.

[14]吳立玲.病理生理學(xué)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2011.

[15]陳偉.補充乳清蛋白對優(yōu)秀皮劃艇運動員在高原訓(xùn)練中的作用[D].杭州：浙江大學(xué)，2006.

[16]汪海.職業(yè)性高原病藥物治療學(xué)[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2010.

[17]徐愷，劉云，王亞恩，等.南極磷蝦脫脂蛋白肽抗疲勞和耐缺氧實驗研究[J].食品科學(xué)，2011，32（11）：310-313.

[18]王為光.實用血液病學(xué)[M].西安：西安交通大學(xué)出版社，2017.

[19]任金威，李迪，孫靖琴，等.吉林人參低聚肽對小鼠耐缺氧作用的研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2018，24（12）：54-57.

Anti-hypoxia Effect of Peanut Peptides in Mice

LI Zhen，YU Xiao-chen，HU Jia-ni，HAO Yun-tao，LIU Xin-ran，LIU Rui，ZHU Na，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：【Objective】 To investigate whether the peanut peptide has anti-hypoxia effect in mice.【Method】 A total of 150 male specific pathogen free（SPF）BALB/c mice were randomly assigned into 5 groups，including a control group，a whey protein group（500 mg/kg BW），and three peanut peptide groups（250，500，1 000 mg/kg BW），all the mice were treated with intragastric administration for 30 days.The anti-hypoxia effect of peanut peptide was observed through measuring the survival time and oxygen consumption of mice in each group in normal pressure hypoxia environment，the survival time under hypoxia caused by sodium nitrite poisoning and the survival time under hypoxia caused by acute cerebral ischemia.【Result】 Compared with those in control group，the survival time of normal pressure hypoxia tolerance test，sodium nitrite poisoning survival test and acute cerebral ischemia hypoxia test of mice in all peanut peptide groups were significantly prolonged（P<0.05 for all）.Compared with those in the whey protein group，the survival times of mice in the middle and high dose peanut peptide groups under the three types of hypoxia were significantly prolonged（both P<0.05）.【Conclusion】 Peanut peptide has anti-hypoxia effect in mice.

Keywords：peanut peptide;anti-hypoxia effect;survival time

作者簡介：李 臻（1996— ），男，碩士，研究方向：營養(yǎng)與疾病。

通信作者：李 勇（1958— ），男，教授，研究方向：營養(yǎng)與疾病。