苦丁茶中綠原酸及其異構(gòu)體的提取變化分析

林春松，黃青云，張雪芹，劉鴻洲，陳 淳，徐夙俠

(福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006)

綠原酸(Chlorogenic acid)即 3-咖啡酰奎尼酸(3-caffeoylquinic acid，3-CQA)，是由咖啡酸(Caffeic acid)的羧基與奎尼酸(Quinic acid)的 3-羥基酯化形成的羧酚酸。其異構(gòu)體通常泛指由奎寧酸與數(shù)目不等的咖啡酸通過酯化反應(yīng)縮合而成的有機酸類天然成分，這類物質(zhì)是植物體內(nèi)有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界中[1—2]。

由于咖啡酸與奎尼酸結(jié)合位置和結(jié)合數(shù)量的不同，理論上咖啡?？崴峋哂兴姆N異構(gòu)體，而二咖啡?？崴峋哂辛N異構(gòu)體。目前，在植物中發(fā)現(xiàn)的綠原酸類異構(gòu)體主要包括綠原酸、新綠原酸(5-caffeoylquinic acid，5-CQA)、隱綠原酸(4-caffeoylquinic acid，4-CQA)、異綠原酸 A(3,5-dicaffeoylquinic acid，3,5-diCQA)、異綠原酸B(3,4-dicaffeoylquinic acid，3,4-diCQA)、異綠原酸C(4,5-dicaffeoylquinic acid，4,5-diCQA)和分布較窄的洋薊素(Cynarin)(1,5-dicaffeoylquinic acid，1,5-diCQA)[3]。

苦丁茶(Ilex kaushue)又名扣樹，是廣西民間廣為習(xí)用的苦丁茶的原植物。值得注意的是，該種于1981年被誤訂的學(xué)名Ilex kudingcha C.J.Tseng在諸多文章中出現(xiàn)[4]，現(xiàn)與扣樹合并[5]，在《中國植物志》和Flora of China中，Ilex kudingcha C.J.Tseng均作為Ilex kaushue S.Y.Hu的異名處理[6—7]?？喽〔枰彩莻鹘y(tǒng)的藥用植物，具有諸多保健作用，如減肥、調(diào)節(jié)腸道微生物、抗炎、抗氧化、抗癌，預(yù)防胃損傷、神經(jīng)損傷和代謝紊亂等[8—13]，其主要活性成分是含量較高的多酚類物質(zhì)?？喽〔柚芯G原酸類(CQAs)占多酚類成分的90%以上[14]。苦丁茶也因綠原酸類成分含量高被稱為“綠原酸茶”[15]。如今，越來越多的證據(jù)表明，綠原酸類成分具有抗菌抗炎、抗病毒、抗氧化、肝保護、減輕糖尿病、抗組胺、抗癌、神經(jīng)保護及其他生物學(xué)效應(yīng)[16—21]。

然而，正由于咖啡酸對奎尼酸的結(jié)合位置和結(jié)合數(shù)量的不同，綠原酸及其異構(gòu)體在功能上也有較大的差別，異綠原酸A抗胃癌作用突出[21]，同時不僅能高效抑制HIV-1整合酶，還能抑制HIV-1在組織中的復(fù)制[22]；異綠原酸B抗乳腺癌，能抑制人乳腺癌細胞 MCF-7的生長和增殖[21]；而異綠原酸 C抗氧化能力明顯強于其他異構(gòu)體[3]。綠原酸類異構(gòu)體以其豐富的生物活性功能，可分別應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化工工業(yè)等。綠原酸及其異構(gòu)體通常以混合形式存在于植物中，苦丁茶包含了植物中分布的6種主要綠原酸類異構(gòu)體：綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C。為了深入開發(fā)利用植物中的綠原酸類成分，需對其進行提取純化。在報道的純化制備工藝流程中，一些研究關(guān)注到提取的溶劑、溫度、時間等因素對綠原酸類成分總量的影響[1—2,23]，但對其異構(gòu)體成分的變化少見報道。綠原酸類成分為不穩(wěn)定的極性有機酸，在提取過程中易發(fā)生異構(gòu)化，其異構(gòu)化機理尚不清楚。

本研究以苦丁茶為材料，用甲醇、乙醇、丙酮和水等4種常用溶劑與超聲波提取、水浴提取、回流提取等相結(jié)合，考察不同溶劑和提取方法對綠原酸類成分的提取效率及各異構(gòu)體含量的影響，可為植物源綠原酸類成分提取提供參考，也為進一步研究綠原酸異構(gòu)體的轉(zhuǎn)變機理提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

苦丁茶購自廣西林業(yè)科學(xué)研究院。

新綠原酸標準品購自 Sigma-Aldrich(美國密歇根州圣路易斯)，3-CQA、4-CQA、3.5-diCQA、4.5-diCQA、3.4-diCQA 和咖啡酸購自成都Mann-Stewart生物技術(shù)有限公司(中國成都)。甲醇(分析純，吉安豪邁精細化工實業(yè)有限公司)，乙醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)，丙酮(分析純，上?；瘜W(xué)試劑廠)，甲酸(分析純，上海麥克林生化公司)，乙腈(色譜純，Tedia公司，美國)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity UPLC儀(包括 Waters Acquity BEH C18色譜柱、自動進樣器、Binary溶劑管理系統(tǒng)，二極管陣列檢測器DAD，柱溫箱和化學(xué)工作站)。Milli-Q Direct 8 水純化系統(tǒng)(法國)，BS124S、BS423S Sartorius電子天平(德國)，SB25-12DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，DK-80型電熱恒溫器(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，KDM型調(diào)溫電熱套(山東華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 苦丁茶中綠原酸類成分提取

將同一批苦丁茶粉碎過80目篩，放入4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.1.1 超聲波提取(a)

溶劑分別為甲醇(100%、70%、50%、40%)，乙醇(100%、70%、50%、40%)，丙酮(70%、50%)和水，稱取0.4 g過篩的苦丁茶放入10 mL離心管，加入8 mL溶劑，超聲波設(shè)置400 W、30 ℃、30 min，超聲過程中人工搖勻2次，放置2 h，再超聲30 min。補足超聲處理過程中損失的溶劑后搖勻，過濾待測。

1.2.1.2 水浴提取(b)

溶劑分別為甲醇(100%、70%、50%、40%)，乙醇(100%、70%、50%、40%)，丙酮(70%、50%)和水，精確稱量2 g過篩的苦丁茶放入具塞三角燒杯中，分別加入40 mL溶劑。為提高提取效率，水浴溫度設(shè)置為靠近提取溶劑的沸點。提取溶劑為甲醇時，水浴溫度60 ℃；提取溶劑為乙醇時，水浴溫度75 ℃；提取溶劑為丙酮時，水浴溫度55 ℃；用水為溶劑提取時，水浴溫度80 ℃。水浴提取2 h，每30 min搖勻一次。補足水浴過程中損失的溶劑后再次搖勻，過濾待測。

1.2.1.3 回流提取(c)

溶劑分別為 70%甲醇、70%乙醇、40%乙醇、70%丙酮，分別稱量 100 g過篩的苦丁茶，加入1000 mL溶劑回流提取1.5 h，過濾后向濾渣中再加入1000 mL相應(yīng)溶劑回流1.5 h，過濾后合并濾液，減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，40倍液溶解后過濾待測。

1.2.2 綠原酸類成分的UPLC檢測

色譜柱為 Waters Acquity BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱溫35 ℃，流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，流速0.3 mL·min-1。洗脫條件：0～5 min，A相由90%線性變化為80%；5～9 min，A相80%線性變化為60%；9～12 min，A相由60%線性變化為90%。DAD檢測器，檢測波長326 nm。

2 結(jié)果與分析

使用UPLC儀及優(yōu)化的色譜條件，6個綠原酸類成分及咖啡酸在6 min內(nèi)完成分離，標準品及部分提取樣品的色譜圖見圖1。

在超聲波提取中，使用甲醇溶劑時，70%、50%、40%甲醇的提取效率較接近，提取的綠原酸及其異構(gòu)體相對比例變化小，其總綠原酸類成分以70%甲醇提取量稍高，達177.96 mg·g-1(表1)。而用乙醇溶劑時，各濃度乙醇提取效率均較低，其中40%乙醇提取量稍高，總綠原酸類成分為93.24 mg·g-1。這可能是在30 ℃較低溫度時，各濃度乙醇對苦丁茶材料的浸潤性低于其他溶劑，盡管有超聲波輔助，對綠原酸類成分的提取效率仍然較低。用丙酮提取時，兩種濃度的丙酮提取效率都較高，結(jié)果相近，其中70%丙酮提取時，總綠原酸成分為 197.87 mg·g-1，異綠原酸A達101.35 mg·g-1。用水提取時，總綠原酸類成分為 132.56 mg·g-1，異綠原酸 A 65.72 mg·g-1，游離咖啡酸含量在所有樣品中最高，為1.30 mg·g-1，這可能是在超聲波水提條件下，綠原酸類成分的水解作用最強。

在水浴提取中，使用甲醇溶劑提取時，各濃度甲醇溶劑的提取效果較為接近，70%濃度仍能獲得較好的效果，總綠原酸成分達177.94 mg·g-1，其中異綠原酸A含量最高(90.39 mg·g-1)；使用乙醇溶劑時，40%濃度提取效果較好，總綠原酸類含量為170.33 mg·g-1，異綠原酸 A 為 68.77 mg·g-1；70%和50%丙酮都有較好的提取效果，總綠原酸類分別可達 200.96 mg·g-1和 191.39 mg·g-1；用水作溶劑提取時，總綠原酸類成分為124.97 mg·g-1，其中異綠原酸A含量較其他提取方法低，為32.22 mg·g-1，而異綠原酸B及隱綠原酸達最高，分別為16.96 mg·g-1、7.91 mg·g-1，在圖1:I中能看到明顯差異。

圖1 部分測試樣品的UPLC譜圖Fig.1 Ultra Performance Liquid Chromatographys of partial samples

在回流提取中，由于苦丁茶經(jīng)水沸提取后粘稠度高極難過濾，因此本實驗未考察苦丁茶的水沸煎煮提取。在甲醇、乙醇和丙酮提取溶劑中，100 g苦丁茶樣品經(jīng)70%甲醇溶劑回流提取，冷凍干燥后得粗提物41.6 g，70%乙醇、40%乙醇、70%丙酮回流提取100 g樣品干燥后分別得粗提物42.77 g、40 g、42.43 g，40倍溶劑溶解后測試計算各綠原酸類成分含量。UPLC圖譜分別見圖1:J～M。由表1數(shù)據(jù)可見，70%甲醇、70%乙醇、40%乙醇、70%丙酮4種溶劑回流提取的綠原酸類成分的總量較為接近，分別為 197.26 mg·g-1、190.26 mg·g-1、176.44 mg·g-1、194.65 mg·g-1，但綠原酸及其異構(gòu)體相對含量差別較大。在回流提取的綠原酸類成分中，異綠原酸A和異綠原酸C是最主要的兩種異構(gòu)體，不同提取溶劑中兩異構(gòu)體的含量之和較為接近?；亓魇褂玫娜軇┌此崛〉漠惥G原酸A的含量從高到低順序為70%丙酮(102.54 mg·g-1)、70%甲醇(82.71 mg·g-1)、70%乙醇(66.54 mg·g-1)、40%乙醇(51.75 mg·g-1)。而就異綠原酸C的量而言，這個順序正好相反，依次為40%乙醇(72.49 mg·g-1)、70%乙醇(72.34 mg·g-1)、70%甲醇(58.32 mg·g-1)、70%丙酮(38.24 mg·g-1)。這兩個異構(gòu)體各自的含量在4種溶劑提取后差異很大，而其含量之和卻較為接近，提示這兩個異構(gòu)體之間存在大比例的轉(zhuǎn)換。

表1 不同溶劑、方法提取苦丁茶中綠原酸類成分含量(mg·g-1)Table 1 Contents of chlorogenic acids in Kudingcha extracted by different solvents and methods (mg·g-1)

從本研究的數(shù)據(jù)分析，相對于丙酮溶液提取，70%甲醇、70%乙醇、40%乙醇的回流提取過程中，異綠原酸A和異綠原酸C的量發(fā)生了明顯的此消彼長變化，表明在加熱的醇溶液中異綠原酸A轉(zhuǎn)化成異綠原酸 C。而其他成分的變化相對總的綠原酸成分變化較少，尚不能得出明確的轉(zhuǎn)化關(guān)系。

3 討論

大量文獻報道了對苦丁茶綠原酸類成分的HPLC測定，本研究采用UPLC縮短了分離時間，苦丁茶中6種綠原酸類成分及咖啡酸可在6 min內(nèi)實現(xiàn)分離。

綠原酸及其異構(gòu)體為不穩(wěn)定的極性有機酸，易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化[24]。在205 ℃烘焙條件下，咖啡的7種綠原酸類成分在 7 min時約有 60%損失，而在19 min時，損失近100%。Dawidowicz等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在設(shè)定的加壓高溫條件下(100～200 ℃)，5-咖啡酰奎寧酸在水溶液加熱過程中有多種產(chǎn)物出現(xiàn)，在 100℃時有單咖啡?？鼘幩岙悩?gòu)體出現(xiàn)，而在135 ℃以上時，出現(xiàn)極少量的異綠原酸C。在常用的回流加熱過程中，反式-5-咖啡?？鼘幩嵩诩状?、乙醇、丙醇及其水溶液中發(fā)生轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生的衍生物不僅與加熱時間和pH值相關(guān)，也與醇的種類和醇/水混合物的相對濃度相關(guān)[26]。本研究26個提取處理表明，超聲波、水浴和回流提取中，丙酮作為提取溶劑時都能獲得較高的提取效率，易獲得較多的綠原酸類成分和高含量的抗癌成分異綠原酸 A。而最常用的溶劑乙醇在本試驗設(shè)定的超聲波和水浴提取條件下，并未達到理想的提取效果。在不同溶劑的回流提取中，雖然提取的綠原酸類成分總量接近，但兩種成分異綠原酸A和異綠原酸C的含量有較大差異。在生產(chǎn)中，可根據(jù)物質(zhì)成分的需要選用提取方法。相對于不同條件下的丙酮溶液提取，醇溶液特別是乙醇溶液的回流提取使異綠原酸C的量大幅增加，相應(yīng)的異綠原酸A的量大幅減少，表明在醇加熱條件下，異綠原酸A轉(zhuǎn)化為異綠原酸C。

異綠原酸C是具有多種生物活性的物質(zhì)，在綠原酸類成分中，其抗氧化性是最強的，但目前只能從植物中提取，尚無合成轉(zhuǎn)化的報道。而異綠原酸A已由Raheem等[27]在2011年實現(xiàn)了全合成。本文的數(shù)據(jù)也為獲得抗氧化能力更強的異綠原酸C提供了新方法，即在一定條件下醇加熱使其中的異綠原酸A轉(zhuǎn)化為異綠原酸C的方法。