不同注射條件對(duì)中華蜜蜂工蜂微量注射后生存的影響

劉佳霖 李亞迎 羅文華 曹蘭 高麗嬌 劉懷

（1 重慶市畜牧科學(xué)院，榮昌 402460；2 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715）

蜜蜂成年工蜂的微量注射技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蜜蜂的生物學(xué)研究。在蜜蜂的RNA 干擾試驗(yàn)中，利用微量注射技術(shù)將目的基因的dsRNA 注入工蜂體內(nèi)，可干擾目的基因的表達(dá)，進(jìn)而評(píng)價(jià)目的基因的功能[1]。例如，中華蜜蜂（Apis cerana cerana）工蜂微量注射0.5μLCYP301A1、CYP303A1和CYP306A1的dsRNA能夠顯著降低蟲(chóng)體對(duì)應(yīng)目的基因的相對(duì)表達(dá)量，而下調(diào)的這3 個(gè)P450（Cytochrome P450 monooxygenases）基因能夠顯著提高工蜂飼喂敵敵畏、噻蟲(chóng)嗪、百草枯和溴氰菊酯后的死亡率，表明P450 家族基因參與了中華蜜蜂對(duì)多種農(nóng)藥的解毒代謝[2]。此外，通過(guò)微量注射dsRNA 干擾卵黃原蛋白vitellogenin 基因的表達(dá)能夠顯著增加西方蜜蜂（Apis mellifera）的嗅覺(jué)敏感性[3]，干擾IRS（Insulin receptor substrate）基因的表達(dá)能夠改變工蜂的采集行為[4]。這些研究表明，基于成年工蜂微量注射的RNA 干擾技術(shù)對(duì)研究蜜蜂基因的功能具有十分重要的作用。與此同時(shí)，工蜂的微量注射還應(yīng)用于評(píng)價(jià)不同物質(zhì)及病原微生物對(duì)蜜蜂的影響，如微量注射章魚(yú)胺和酪胺能夠顯著影響蜜蜂的運(yùn)動(dòng)行為[5]。注射接種蜜蜂殘翅病毒能夠顯著降低工蜂的壽命，下調(diào)卵黃原蛋白vitellogenin基因的相對(duì)表達(dá)量；同時(shí)暴露于DWV 和噻蟲(chóng)嗪的工蜂表現(xiàn)出更低的壽命，并導(dǎo)致工蜂提前開(kāi)始采集行為[6]。注射接種蜜蜂以色列急性麻痹病毒能夠改變采集蜂的嗅覺(jué)敏感性，降低采集結(jié)束后的回巢成功率[7]。

盡管蜜蜂成年工蜂的微量注射技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于蜜蜂的生物學(xué)研究，但不同注射條件是否能夠顯著影響工蜂注射后的生存仍沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究基于以前研究中的蜜蜂成年工蜂微量注射方法，通過(guò)單因素試驗(yàn)評(píng)價(jià)了不同注射日齡、麻醉方式、注射部位及注射量對(duì)工蜂注射后15d 生存的影響，以?xún)?yōu)化蜜蜂成年工蜂的微量注射技術(shù)，降低微量注射對(duì)蜜蜂的影響，為后續(xù)開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2020年9月在重慶市榮昌區(qū)重慶市畜牧科學(xué)院進(jìn)行，試驗(yàn)蜜蜂為重慶本地中華蜜蜂，2 個(gè)配置有姐妹蜂王的試驗(yàn)蜂群在自然條件下現(xiàn)代活框飼養(yǎng)，試驗(yàn)蜂群群勢(shì)為5 足框蜂（2 脾子脾和2 脾蜜粉脾），試驗(yàn)期間周?chē)h(huán)境日平均溫度21～27℃。試驗(yàn)開(kāi)始前，將即將出房的封蓋子脾帶回實(shí)驗(yàn)室，并放置在黑暗的人工氣候箱（34℃，相對(duì)濕度70%）中過(guò)夜培養(yǎng)，以獲得新出房的工蜂。待工蜂出房后，24h 內(nèi)將來(lái)自不同蜂群的33～35 只新出房工蜂隨機(jī)移入塑料飼喂盒（17cm×10cm×7cm）中飼養(yǎng)，每個(gè)飼喂盒提供3mL 50%（w/w）的蔗糖溶液，并放入另一個(gè)人工氣候箱（30℃，相對(duì)濕度60%）中黑暗飼養(yǎng)。每天更換飼喂盒中的蔗糖溶液。根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，新出房的工蜂連續(xù)飼喂3d、7d 和12d 后用于中華蜜蜂成年工蜂的微量注射試驗(yàn)。

1.2 主要儀器

人工氣候箱（RXZ智能型），購(gòu)自寧波江南儀器廠；微量注射器（7632-01），購(gòu)自美國(guó)Hamilton 公司；微量注射器針頭（30G），購(gòu)自美國(guó)Hamilton 公司。

2 方法

基于已有研究的蜜蜂成年工蜂微量注射方法[3,8-10]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇的基礎(chǔ)注射條件為：3日齡工蜂，不麻醉，從中華蜜蜂工蜂背部的第4～5 腹節(jié)節(jié)間膜注入1μL 的DEPC 水。通過(guò)單因素試驗(yàn)評(píng)價(jià)不同注射日齡、麻醉方式、注射部位及注射量對(duì)工蜂注射后15d 生存的影響。每個(gè)處理注射30 只工蜂，并重復(fù)3 次。注射完成后的30 只工蜂被放入一個(gè)新的飼喂盒中，提供3mL 50%的蔗糖溶液，置于人工氣候箱（30℃，相對(duì)濕度60%）中黑暗飼養(yǎng)。試驗(yàn)共計(jì)持續(xù)15d，每天記錄各組工蜂的死亡數(shù)，移除死亡的工蜂，并更換蔗糖溶液。

2.1 不同注射日齡對(duì)中華蜜蜂工蜂注射后生存的影響

新出房的工蜂飼喂50%的蔗糖溶液3d、7d 和12d 后用于微量注射試驗(yàn)。3日齡、7日齡或12日齡的工蜂，不麻醉，從背部的第4～5 腹節(jié)節(jié)間膜注入1μL 的DEPC 水。3 個(gè)日齡的工蜂于同一天上午完成注射，注射完成后的工蜂被放入新的飼喂盒中，提供蔗糖溶液，每天檢查工蜂的生存情況。

2.2 不同麻醉方式對(duì)中華蜜蜂工蜂注射后生存的影響

用玻璃試管取2～3 只3日齡的工蜂插入冰內(nèi)放置2～3min（低溫麻醉），待工蜂被麻醉后，將工蜂取出并從背部的第4～5腹節(jié)節(jié)間膜注入1.0μL的DEPC水，同時(shí)設(shè)置不麻醉對(duì)照組。注射完成后的工蜂被放入新的飼喂盒中，提供蔗糖溶液，每天檢查工蜂的生存情況。

2.3 不同注射部位對(duì)中華蜜蜂工蜂注射后生存的影響

3日齡的工蜂，不麻醉，分別從背部的第2～3 腹節(jié)、第3～4 腹節(jié)、第4～5 腹節(jié)或第5～6 腹節(jié)節(jié)間膜注入1.0μL 的DEPC 水。注射完成后的工蜂被放入新的飼喂盒中，提供蔗糖溶液，每天檢查工蜂的生存情況。

2.4 不同注射量對(duì)中華蜜蜂工蜂注射后生存的影響

3日齡的工蜂，不麻醉，從背部的第4～5 腹節(jié)節(jié)間膜注入0.5μL、1.0μL 或2.0μL 的DEPC 水。注射完成后的工蜂被放入飼喂盒中，提供蔗糖溶液，每天檢查工蜂的生存情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在SPSS 21.0 中實(shí)現(xiàn)。采用生存分析的Kaplan-Meier estimator 獲得不同試驗(yàn)組工蜂的生存曲線，利用Log-rank test 分析不同試驗(yàn)組生存曲線的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與此同時(shí)，使用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型（Cox proportional hazards model）獲得不同注射條件與基礎(chǔ)注射條件相比的風(fēng)險(xiǎn)比值，以明確不同注射條件對(duì)工蜂注射后生存的影響。當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)比值<1 時(shí)，表明該注射條件對(duì)工蜂注射后生存的風(fēng)險(xiǎn)小于基礎(chǔ)注射條件，當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)比值>1 時(shí)，表明該注射條件對(duì)工蜂注射后生存的風(fēng)險(xiǎn)大于基礎(chǔ)注射條件。當(dāng)P<0.05 時(shí)，差異達(dá)到顯著水平，當(dāng)P<0.01 時(shí)，差異達(dá)到極顯著水平。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同注射日齡對(duì)中華蜜蜂工蜂注射后生存的影響

本研究顯示，不同注射日齡能夠顯著影響中華蜜蜂工蜂注射后的生存時(shí)間（圖1A，χ2=24.82，df=2，P<0.01）。7日齡和12日齡工蜂注射后的平均生存時(shí)間分別為9.22d（χ2=11.01，P<0.01）和7.67d（χ2=23.82，P<0.01），極顯著低于3日齡工蜂的11.44d；但7日齡工蜂和12日齡工蜂注射后的生存時(shí)間差異不顯著（χ2=3.16，P>0.05）。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，與3日齡工蜂相比，7日齡工蜂和12日齡工蜂注射后的風(fēng)險(xiǎn)比為1.78（χ2=9.33，P<0.01）和2.38（χ2=21.67，P<0.01），高日齡（7日齡和12日齡）工蜂注射后的生存風(fēng)險(xiǎn)極顯著高于3日齡工蜂。

3.2 不同麻醉方式對(duì)中華蜜蜂工蜂注射后生存的影響

如圖1B 所示，低溫麻醉不能顯著影響工蜂注射后的生存時(shí)間（χ2=1.53，df=1，P>0.05）。與不麻醉相比，中華蜜蜂工蜂低溫麻醉后注射的風(fēng)險(xiǎn)比為1.27，雖然低溫麻醉能夠?qū)し渥⑸浜蟮纳娈a(chǎn)生更大的風(fēng)險(xiǎn)，但未達(dá)到顯著水平（χ2=1.44，P>0.05）。

3.3 不同注射部位對(duì)中華蜜蜂工蜂注射后生存的影響

不同注射部位能夠顯著影響工蜂注射后的生存時(shí)間（圖1C，χ2=134.28，df=3，P<0.01）。工蜂從背部第2～3 腹節(jié)節(jié)間膜注射后的平均生存時(shí)間為4.48d，極顯著低于從第3～4 腹節(jié)（χ2=61.59，P<0.01）、第4～5腹節(jié)（χ2=80.37，P<0.01）和第5～6腹節(jié)（χ2=64.66，P<0.01）節(jié)間膜注射；工蜂從第3～4 腹節(jié)、第4～5 腹節(jié)和第5～6 腹節(jié)節(jié)間膜注射后的生存時(shí)間差異不顯著（P>0.05）。與第4～5 腹節(jié)節(jié)間膜相比，從第2～3 腹節(jié)、第3～4 腹節(jié)和第5～6 腹節(jié)節(jié)間膜注射的風(fēng)險(xiǎn)比為4.91、1.27 和1.24，工蜂從背部第2～3 腹節(jié)節(jié)間膜微量注射的風(fēng)險(xiǎn)極顯著高于從第4～5 腹節(jié)節(jié)間膜注射（χ2=72.42，P<0.01）。

3.4 不同注射量對(duì)中華蜜蜂工蜂注射后生存的影響

注射量不能顯著影響中華蜜蜂工蜂注射后的生存時(shí)間（圖1D，χ2=3.17，df=2，P>0.05）。與1.0μL相比，微量注射0.5μL 和2.0μL 的風(fēng)險(xiǎn)比為1.04（χ2=0.03，P>0.05）和1.36（χ2=2.39，P>0.05），差異不顯著。

圖1 不同注射條件對(duì)中華蜜蜂工蜂微量注射后生存的影響

4 討論

為了優(yōu)化中華蜜蜂成年工蜂的微量注射技術(shù)，明確不同注射條件是否能夠顯著影響工蜂注射后的生存，本研究利用單因素試驗(yàn)評(píng)價(jià)了不同注射日齡、麻醉方式、注射部位及注射量對(duì)工蜂注射后15d 生存的影響。結(jié)果顯示，不同注射條件能夠?qū)し渥⑸浜蟮纳娈a(chǎn)生不同的影響。工蜂進(jìn)行微量注射時(shí)的日齡能夠顯著影響工蜂注射后的生存時(shí)間，7日齡和12日齡工蜂微量注射后的生存風(fēng)險(xiǎn)顯著高于3日齡工蜂。該結(jié)果表明，低日齡的工蜂可能更適宜于開(kāi)展蜜蜂的微量注射試驗(yàn)。在以前的研究中，絕大部分學(xué)者采用低日齡（0～5日齡）的工蜂進(jìn)行微量注射[2,10-13]，間接表明利用低日齡的工蜂開(kāi)展微量注射試驗(yàn)?zāi)軌蛴行Ы档妥⑸鋵?duì)蜜蜂的影響，提高后續(xù)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。此外，本研究采用實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的方式獲得不同日齡的工蜂，但長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)室離群飼養(yǎng)可能會(huì)對(duì)工蜂產(chǎn)生不利的影響，進(jìn)而提高微量注射對(duì)工蜂生存的風(fēng)險(xiǎn)。Li 等人[7]利用從蜂群中獲得的采集蜂評(píng)價(jià)了注射接種IAPV 對(duì)蜜蜂嗅覺(jué)敏感性的影響，表明利用從蜂群中獲得的高日齡工蜂開(kāi)展微量注射試驗(yàn)可能降低了注射對(duì)蜜蜂的影響。因此，若必須選擇高日齡的蜜蜂開(kāi)展微量注射試驗(yàn)，建議直接從蜂群中選擇對(duì)應(yīng)日齡的工蜂，并縮短試驗(yàn)時(shí)間，以降低微量注射對(duì)后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

從工蜂腹部進(jìn)行微量注射是以前研究中常用的注射方法，但不同研究中注射的部位存在很大差異[3,5,10,11,14]。本研究顯示，中華蜜蜂工蜂從背部第2～3 腹節(jié)節(jié)間膜注射后的平均生存時(shí)間顯著低于從第3～4 腹節(jié)、第4～5 腹節(jié)和第5～6 腹節(jié)節(jié)間膜注射，表明不同注射部位能夠?qū)し洚a(chǎn)生不同的影響。腹部是蜜蜂消化和生殖的中心，包含復(fù)雜的消化、循環(huán)、呼吸、神經(jīng)、生殖和分泌等系統(tǒng)[15]。從腹部不同的部位進(jìn)行微量注射可能會(huì)對(duì)其內(nèi)部的復(fù)雜結(jié)構(gòu)造成不同的傷害，最終對(duì)工蜂產(chǎn)生不同的影響。在開(kāi)展中華蜜蜂工蜂微量注射時(shí)，應(yīng)選擇從背部第3～4 腹節(jié)、第4～5 腹節(jié)或第5～6 腹節(jié)節(jié)間膜進(jìn)行注射，以降低微量注射對(duì)工蜂的影響。

低溫麻醉是蜜蜂生物學(xué)研究中常用的麻醉方式[16-18]，也廣泛應(yīng)用于工蜂的微量注射[3,7,8]。本研究顯示，低溫麻醉并不能夠顯著影響工蜂注射后的生存。因此，低溫麻醉仍是提高蜜蜂工蜂微量注射效率的有效方式。此外，本研究選擇以前研究中常用的3 個(gè)注射量（0.5μL、1.0μL 和2.0μL）[2,5,19]，評(píng)價(jià)了不同注射量對(duì)工蜂注射后生存的影響。結(jié)果顯示，微量注射0.5μL、1.0μL 和2.0μL 的DEPC 水并不能顯著影響注射后工蜂的生存，表明這3 個(gè)注射量均可在工蜂的微量注射中使用。劉麗等人研究顯示[10]，與微量注射1μL 和2μL 的DEPC 水相比，注射3μL 和4μL 能夠提高工蜂的死亡率，表明注射量的提高能夠?qū)γ鄯洚a(chǎn)生更大的影響。因此，在實(shí)際的微量注射試驗(yàn)中，需要盡可能提高注射溶液的溶度，減少注射量，降低微量注射對(duì)工蜂的影響，以保證后續(xù)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

綜上，本研究認(rèn)為，低日齡的工蜂更適宜于開(kāi)展中華蜜蜂的微量注射試驗(yàn)，在注射前可以采用低溫麻醉工蜂的方式提高注射效率，推薦的注射方法為：從中華蜜蜂工蜂背部第4～5 腹節(jié)節(jié)間膜微量注射1.0μL的注射液。