成骨細胞能量代謝的研究進展

王銀博 孫維佳 李玉恒 凌樹寬 李英賢*

1 空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系，陜西 西安 710038

2 中國航天員科研訓練中心航天醫(yī)學基礎與應用國家重點實驗室，北京 100094

在骨骼生長發(fā)育以及不斷重塑的過程中，成骨細胞發(fā)揮重要的功能，不斷生成新的骨質(zhì)，增加骨量。成骨細胞分化及功能的異常會引起骨生成障礙、骨平衡紊亂，導致代謝性骨病[1-3]。成骨細胞分化及發(fā)揮功能的不同階段都需要能量參與，能量代謝的異常，會導致其功能的異常。同時，成骨細胞分泌的激素通過內(nèi)分泌系統(tǒng)參與機體代謝調(diào)控[4-6]。隨著研究的不斷深入，近年發(fā)現(xiàn)一些與成骨細胞能量代謝相關的骨代謝疾病[7]。本文將結(jié)合近年的研究，對成骨細胞的能量代謝及調(diào)控機制作以概述。

1 葡萄糖代謝及調(diào)控方式

葡萄糖是骨骼發(fā)育和生長的主要能量來源，并且對維持骨骼系統(tǒng)的穩(wěn)定至關重要[8]。骨切片及小鼠顱骨成骨細胞培養(yǎng)研究表明，成骨細胞主要依靠葡萄糖提供能量，以乳酸為主要最終產(chǎn)物。即使在有氧條件下，三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)也僅起著較小的作用，這種代謝方式稱為有氧糖酵解(aerobic glycolysis)，即Warburg效應[9]。成骨細胞消耗的葡萄糖中80%以上被轉(zhuǎn)化為乳酸[10-12]。進一步研究[13]表明，與分化的成骨細胞相比，人類間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)更加依賴糖酵解來提供能量。但是，hMSCs向成骨細胞誘導分化后，線粒體DNA的拷貝數(shù)、呼吸酶的蛋白亞基、耗氧率和細胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)含量都有所增加，表明線粒體氧化還原功能增強。同樣，利用體外小鼠前成骨細胞進行的一項研究[14]顯示，小鼠前成骨細胞也主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP，而成骨向誘導分化后氧化磷酸化增加。當成骨細胞礦化后，能量代謝又恢復到以糖酵解代謝為主[15]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化過程中氧化磷酸化作用增強，但是葡萄糖氧化磷酸化不是成骨細胞能量代謝的必要方式。用氧化磷酸化抑制劑處理成骨向誘導分化的BMSCs，與非處理組相比，處理組ATP并沒有降低，但是成骨分化受到抑制。分析發(fā)現(xiàn)，線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸進入胞質(zhì)，在ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACLY)作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，能夠使β-Catenin的乙?；饔眉盎钚栽黾樱M而促進成骨分化[16]。同時葡萄糖代謝產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物檸檬酸鹽對于維持骨組織磷灰石納米晶體的結(jié)構(gòu)至關重要，能夠增加骨骼的穩(wěn)定性、強度和抗斷裂性[17-18]。

成骨細胞系基因表達篩查顯示，其穩(wěn)定地表達Glut1、Glut3和Glut4[19-20]。Glut1是原代成骨細胞的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，并且能夠通過抑制腺苷5’-單磷酸激酶和阻斷Runx 2的泛素化來調(diào)節(jié)Runx 2的翻譯后修飾。前成骨細胞中Glut1的選擇性敲除，抑制了體外和體內(nèi)成骨細胞的分化[21]。Mst1/2激酶是成骨細胞分化過程中葡萄糖攝取的重要調(diào)節(jié)劑，通過穩(wěn)定葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut1來調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取。在缺少Mst1/2激酶的情況下，Glut1的表達會丟失，導致AMP依賴性蛋白激酶(AMPK)激活以及Runx2蛋白酶體降解，成骨細胞組織特異性敲除兩種Mst1/2激酶，抑制了骨形成[22]。在成骨細胞分化過程中，p53(一種抑癌基因)的下調(diào)增加了Glut1表達，使代謝途徑進一步向糖酵解轉(zhuǎn)換[23]。Glut4也介導了成骨細胞胰島素刺激的葡萄糖攝取。體外成骨細胞中Glut4的敲低抑制了胰島素刺激的葡萄糖攝取，減少了成骨細胞的增殖以及成熟成骨細胞的數(shù)量。但是體內(nèi)特異性敲除成骨細胞和骨細胞中的Glut4，小鼠骨表型正常[24]。Glut3在成骨細胞中的相關研究尚未見報道。

參與成骨細胞糖酵解的調(diào)控除了葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族外，還包括缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors，HIF)、Wnt信號、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)和Notch信號。

BMSCs、前成骨細胞以及成骨細胞以糖酵解為主的代謝方式可能與骨髓微環(huán)境中氧含量較低有關，缺氧會增加缺氧誘導因子及其靶基因的表達，例如Glut1、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，這對于糖酵解代謝非常重要[25]。在前成骨細胞中表達穩(wěn)定形式的HIF1α，出生后小鼠前成骨細胞中HIF1α通過使成骨細胞群的顯著擴增，刺激了松質(zhì)骨形成。另一方面，HIF1α通過上調(diào)丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase1，PDK1)和糖酵解關鍵酶來刺激骨骼中的糖酵解[26]。

Wnt信號是刺激小鼠和人類骨生長發(fā)育的主要調(diào)控信號[27]。Wnt信號能夠調(diào)控合成代謝功能以及成骨細胞譜系細胞中糖代謝[28-29]。Wnt3a通過增加糖酵解關鍵酶的水平誘導糖酵解，此代謝調(diào)節(jié)通過Wnt共同受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5(low-density lipoprotein receptor-relatedprotein 5，LRP5)介導，并由RAC1下游的mTORC2/AKT信號傳導，而不依賴β-Catenin。小鼠中LRP5的缺失會降低出生后的骨量，血清乳酸水平也相應降低。相反，LRP5的激活突變導致糖酵解水平增加，小鼠骨量增加[30]，Wnt3a還上調(diào)了丙酮酸脫氫酶活性的負調(diào)節(jié)劑丙酮酸脫氫酶激酶1，減少了進入TCA的丙酮酸量。成骨細胞組織特異性Lrp5敲除的小鼠，出現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥，并且葡萄糖耐量和胰島素敏感性降低[31]，顯示出糖代謝障礙。這些研究充分說明，Wnt信號介導的有氧糖酵解是骨合成代謝的基本程序。

PTH是血清鈣水平的關鍵調(diào)節(jié)劑，負責調(diào)節(jié)骨合成代謝。PTH能夠刺激成骨細胞有氧糖酵解，增加葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生。與Wnt信號類似，PTH增加了MC3T3-E1細胞中糖酵解酶(己糖激酶2、LDHA和PDK1)的蛋白質(zhì)水平。放射性標記的葡萄糖實驗表明，PTH可抑制葡萄糖進入三羧酸循環(huán)。進一步分析其機制，有氧糖酵解的增加是繼PTH誘導的胰島素樣生長因子(insulin-like Growth Factor，IGF)信號之后產(chǎn)生，而IGF的代謝作用取決于mTORC2的激活。PTH功能的實現(xiàn)依賴于環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、IGF1R和磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)/AKT /雷帕霉素靶蛋白復合體2(mammalian target of rapamyoin Complex 2，mTORC2)信號的激活。重要的是，糖酵解的藥理干擾會抑制間歇性PTH的骨合成代謝作用。說明PTH通過IGF信號刺激有氧糖酵解有助于骨合成代謝[32]。

經(jīng)典Notch信號在骨形成中起負調(diào)節(jié)作用。Notch信號對骨骼發(fā)揮作用的機制之一是抑制早期成骨細胞中的糖酵解和隨后的成骨細胞分化。Notch 2激活后，NICD(Notch細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)結(jié)構(gòu)域釋放，易位至細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子RBPjk和轉(zhuǎn)錄共激活因子Maml1-3(mastermind-like transcriptional coactivator)相互作用，并誘導尚未被識別的阻遏物的轉(zhuǎn)錄激活，進而抑制糖酵解酶、線粒體復合體I基因的表達，導致線粒體呼吸作用、超氧化物產(chǎn)生和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)活性降低[33]。在成骨細胞和骨細胞中，PTH能夠抑制Notch信號的傳導，同時增加了這兩種途徑協(xié)同影響成骨細胞代謝的可能性[34]。

2 氨基酸代謝及調(diào)控機制

膳食蛋白質(zhì)的攝入量與骨骼健康密切相關，成骨細胞表達的氨基酸受體和轉(zhuǎn)運蛋白可根據(jù)氨基酸利用率的波動來調(diào)節(jié)細胞能量代謝[35]。顱骨和長骨外植體中谷氨酰胺的攝取和代謝活躍[36]。穩(wěn)定的同位素示蹤實驗已提供直接證據(jù)，表明在Wnt3a誘導的成骨細胞分化過程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物α-酮戊二酸(a-KG)，進一步氧化轉(zhuǎn)化為檸檬酸鹽，增加線粒體中的能量產(chǎn)生[37]。BMSCs的增殖和分化都需要谷氨酰胺代謝的參與，谷氨酸代謝異常會導致BMSCs增殖和分化異常，進而影響骨平衡[38]。研究人員[39]發(fā)現(xiàn)，骨骼干細胞(skeletal stem cells, SSCs)即BMSCs，成骨向分化消耗較多的谷氨酰胺，谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)催化谷氨酰胺生成谷氨酸，谷氨酸進一步轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸。α-酮戊二酸作為三羧酸循環(huán)代謝中間物，對于SSCs增殖、分化和定位非常重要。SSCs特異性敲除GLS后，骨量明顯減少。細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基足以實現(xiàn)原發(fā)性顱蓋骨成骨細胞和人成骨細胞細胞系的最大增殖。但是，當刺激細胞礦化時，葡萄糖不足以支持其能量需求。只有在細胞培養(yǎng)基中補充葡萄糖和谷氨酰胺后，才能在培養(yǎng)物中觀察到高水平的骨鈣素表達和礦化結(jié)節(jié)，顯示了谷氨酰胺對骨礦化的重要性[40]。

Wnt信號可正向調(diào)控谷氨酰胺代謝并且促進骨骼合成代謝[28]。在Wnt3a誘導的成骨細胞分化過程中，Wnt3a刺激谷氨酰胺在TCA中的分解代謝，該反應需要mTORC1的激活，不依賴β-Catenin。Wnt誘導的谷氨酰胺濃度的降低觸發(fā)了GCN2(general control nonderepressible 2)介導的整合應激反應(integrated stress response，ISR)，ISR激活了成骨細胞分化過程中促進蛋白質(zhì)合成代謝的基因表達。在模擬人骨硬化癥的Wnt信號過度活躍的小鼠模型中，GLS的藥理抑制導致的谷氨酰胺分解代謝受阻或GCN2的缺失抑制了過多的骨形成[37]。該研究說明，谷氨酰胺不僅是重要的能源提供者，而且還是成骨細胞蛋白質(zhì)合成的重要調(diào)控因子。另外，雌激素相關受體α(estrogen-related receptorα, ERRα)能夠與GLS啟動子上的響應元件結(jié)合，誘導GLS的轉(zhuǎn)錄。抑制ERRα/GLS通路，hMSCs成骨向分化受抑制[41]。miR-206可以直接與GLS mRNA的3'-UTR區(qū)結(jié)合，導致GLS表達和谷氨酰胺代謝受到抑制，進而抑制BMSCs向成骨分化[42]。

3 脂肪酸代謝及調(diào)控機制

成骨細胞可攝取脂肪酸并且通過β-氧化提供能量，脂肪酸的利用受到激素的控制。例如，維生素D刺激脂肪酸利用而胰島素減少脂肪酸利用[43]，研究[44]預測棕櫚酸酯的氧化產(chǎn)生的能量相當于成骨細胞利用葡萄糖獲得能量的40%～80%。體外誘導成骨細胞進一步骨向分化，脂肪酸氧化顯著增加，礦化的成骨細胞中脂肪酸分解代謝活性比增殖細胞高3倍。體外抑制成骨細胞脂肪酸氧化能夠抑制其礦化和生長[45-46]。正在生長發(fā)育的小鼠和大鼠膳食適當添加不飽和脂肪酸，對成骨細胞的性能具有積極作用，能夠降低骨質(zhì)疏松癥的風險[47]。左旋肉堿和硫酸脫氫表雄酮(dehydroepiandrosteronesulfate，DHEAS)能夠通過脂肪酸代謝促進能量產(chǎn)生，其含量隨著年齡的增長而下降，體外成骨細胞培養(yǎng)，左旋肉堿單獨處理或與DHEAS聯(lián)合處理均可增加棕櫚酸的氧化，而單獨左旋肉堿或單獨DHEAS處理可增加堿性磷酸酶(a lkaline phosphatase，ALP)活性和I型膠原蛋白(collagen type I，Col1a1)水平。這表明，在體外成骨細胞中，左旋肉堿可以增加能量產(chǎn)生，左旋肉堿和DHEAS可以提高骨形成蛋白的產(chǎn)生[48]。此外，去卵巢大鼠(骨質(zhì)疏松癥模型)應用左旋肉堿口服補充劑可防止骨質(zhì)流失[49]。成熟成骨細胞中的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2(carnitine palmityl transferase 2，Cpt2)敲除產(chǎn)生了性別差異的骨表型，雄性僅在青春期快速生長階段表現(xiàn)出小梁骨體積的短暫減少，而雌性在發(fā)育和成熟整個生命周期，骨小梁均未達到峰值體積，并且在股骨遠端和L5椎骨中表現(xiàn)出骨量減少，添加外源雌激素可加劇這種缺陷[50]。高水平Omega-3脂肪酸喂養(yǎng)的年輕小鼠，表現(xiàn)出更加快速的軟骨細胞增殖和分化能力，加速軟骨生長，高水平Omega-3脂肪酸有助于形成更好的骨小梁和骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且能夠增加骨量、增強骨硬度[51]。以上這些研究表明脂肪酸的利用是維持正常骨骼結(jié)構(gòu)的關鍵因素之一，而且受到性激素的調(diào)節(jié)。

小鼠體內(nèi)和體外研究均表明，LRP介導的Wnt信號增強了成熟成骨細胞的脂肪酸氧化。成骨細胞和骨細胞中LRP5或LRP6的特異性敲除會減少小鼠的骨量。LRP5和LRP6敲除的前成骨細胞體外分化受到損害，顱骨前成骨細胞未能分化成成熟成骨細胞，而是獲得了軟骨細胞樣表型，骨骼發(fā)育需要LRP5和LRP6的表達[52]。經(jīng)典Wnt/β-Catenin信號也參與調(diào)控成骨細胞的脂肪酸代謝[53]。體外成骨細胞實驗顯示，刺激Wnt信號增強了脂肪酸的分解代謝，β-Catenin的遺傳缺陷顯著降低了油酸鹽的氧化，同時減少了成骨細胞的成熟并代償性增加了糖酵解代謝。成骨細胞特異性β-Catenin 基因缺陷的小鼠呈現(xiàn)出低骨質(zhì)量表型且白色脂肪組織質(zhì)量增加、血脂異常和胰島素敏感性受損，其原因是β-Catenin基因突變體導致骨骼中介導脂肪酸β氧化的酶表達水平降低。這些結(jié)果表明，Wnt信號對脂肪酸利用的影響是通過其經(jīng)典的信號通路完成[54]。

綜合以上研究，成骨細胞能量代謝方式比較明確，以有氧糖酵解為主，葡萄糖氧化磷酸化、氨基酸代謝和脂肪酸代謝為輔，并受Wnt信號、PTH、Notch信號的影響(圖 1)。骨細胞的能量代謝方式目前尚未見報道。

圖1 成骨細胞的能量代謝及調(diào)控機制示意圖

4 展望

骨質(zhì)疏松癥的主要特征是在成骨細胞與破骨細胞共同作用下骨量下降和骨三維結(jié)構(gòu)遭到破壞[55]。骨質(zhì)疏松性骨折導致老年人生活質(zhì)量下降, 是老年人常見的死亡原因之一[56]。通過對成骨細胞與破骨細胞能量代謝特征的研究，有望進一步尋找可控靶點，對骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生進行有效的干預。