Hedgehog信號通路與“腎虛血瘀”骨代謝失常的實驗研究

鄧洋洋 劉明欣 孫鑫 王慶諺 蔣寧 高巳東 王重一 林浩楠 鄭洪新

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是最常見的骨骼疾病，是一種以骨量低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal-osteoporosis，PMOP)在骨質(zhì)疏松癥中占有比例最大，其骨折而帶來的致死、致殘率極高，是亟待解決的重要問題。Hedgehog信號通路對骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用，近年來其在骨生物學(xué)中的作用受到更多的關(guān)注。本研究以Hedgehog信號通路PTCH1和Gli3為切入點(diǎn)，旨在觀察補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方左歸丸、活血化瘀中藥復(fù)方身痛逐瘀湯對PMOP模型大鼠的療效影響，為臨床防治PMOP以及骨重建失常引起的其他慢性疾病提供最佳的中醫(yī)藥治療方案，并為其作用機(jī)制提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級SD大鼠，雌性，3～4月齡，50只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001[2-3]。

1.1.2實驗藥品：補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方：左歸丸(購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)；活血化瘀中藥復(fù)方：身痛逐瘀湯(購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院)；陽性對照藥：骨疏康顆粒。

1.1.3主要試劑和儀器：ELISA試劑盒(美國R&D systems公司)、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Erase(Takara公司)、Brilliant III Ultra-Fast SYBR? Green QPCR Master Mix(Agilent Technologies公司)等。雙能 X 線骨密度分析儀(美國 Lunar公司)、Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀(德國安捷倫)、PROTEANTMⅡ聚丙烯凝膠電泳(美國LTI)、凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能)、XE380超低溫冰箱(法國)、3111二氧化碳培養(yǎng)箱(美國)、IX71FL倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)、KOHTRON高速低溫離心機(jī)(瑞典)、DU640核酸蛋白分析儀(美國)、Bio-Rad550型酶標(biāo)儀(美國)、PCS-SP2激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)、ALP30R50液氮生物容器(中國精騏)等。

1.2 方法

1.2.1實驗動物模型建立和分組：采用一次性手術(shù)摘除大鼠雙側(cè)卵巢造模方法[注：去卵巢大鼠是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型]。術(shù)后3 d，進(jìn)行實驗分組。按體重分層后按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為補(bǔ)腎填精組、活血化瘀組、陽性對照組、模型空白組及正常組。

1.2.2實驗給藥劑量和方法：給藥劑量：大鼠等效劑量按成人每日用藥量的6.3倍計算，給藥容積為1 ml/100 g體重。給藥方法：補(bǔ)腎填精組給予左歸丸，活血化瘀組給予身痛逐瘀湯，陽性對照組給予骨疏康顆粒，模型空白組和正常組給予等體積的生理鹽水。每日灌胃1次。每周稱重1次，根據(jù)體重變化重新計算給藥劑量，共灌胃12周。最后一次灌胃禁食24 h后取材。

1.2.3標(biāo)本采集與檢測

1.2.3.1骨密度：取各組大鼠左側(cè)股骨，剔除肌肉，生理鹽水沖洗，紗布包好后封存，應(yīng)用雙能X線骨密度分析儀檢測[2-3]。

1.2.3.2骨組織和腎組織PTCH1和Gli3蛋白含量測定：取出右側(cè)股骨和左腎后，一部分用錫紙包好，具體檢測步驟按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3.3骨組織和腎組織PTCH1和Gli3mRNA表達(dá)測定：取出右側(cè)股骨和左腎后，一部分放入有Trizol液的EP管，使用Primer-BLAST設(shè)計引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 骨密度結(jié)果

各組間比較，模型空白組比正常組骨密度降低，具有顯著性差異(P<0.01)，說明造模成功。補(bǔ)腎填精組、陽性藥物對照組比模型空白組的骨密度提高，具有顯著性差異(P<0.01)，活血化瘀組比模型空白組的骨密度提高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示補(bǔ)腎填精、活血化瘀中藥復(fù)方可以提高大鼠去勢后骨密度，糾正骨代謝失常，其中補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方優(yōu)于活血化瘀中藥復(fù)方[2-3]。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨密度檢測結(jié)果比較

2.2 各組大鼠骨組織中PTCH1mRNA及其蛋白表達(dá)

各組大鼠骨組織中PTCH1mRNA相對表達(dá)量方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補(bǔ)腎填精組下調(diào)PTCH1 mRNA相對表達(dá)量優(yōu)于活血化瘀組和陽性藥物對照組。各組大鼠骨組織中PTCH1蛋白方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補(bǔ)腎填精組下調(diào)PTCH1 蛋白含量優(yōu)于活血化瘀組。見表3。

表3 大鼠股骨中PTCH1mRNA相對表達(dá)量和PTCH1蛋白含量結(jié)果

2.3 各組大鼠腎組織中PTCH1mRNA及其蛋白表達(dá)

各組大鼠腎組織中PTCH1mRNA方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補(bǔ)腎填精組下調(diào)PTCH1 mRNA相對表達(dá)量優(yōu)于活血化瘀組。各組大鼠腎組織中PTCH1蛋白方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，補(bǔ)腎填精組比陽性對照組顯著降低(P<0.01)，補(bǔ)腎填精組比陽性對照組顯著升高(P<0.01)，提示補(bǔ)腎填精組下調(diào)蛋白含量優(yōu)于活血化瘀組和陽性藥物對照組，但沒有陽性藥物對照組下調(diào)得好。見表4。

表4 大鼠腎組織PTCH1mRNA相對表達(dá)量和PTCH1蛋白含量結(jié)果

2.4 各組大鼠骨組織中Gli3mRNA及其蛋白表達(dá)

各組大鼠骨組織中Gli3mRNA方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組大鼠比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比活血化瘀組降低(P<0.05)、補(bǔ)腎填精組比陽性對照組顯著降低(P<0.01)，提示補(bǔ)腎填精組下調(diào)Gli3mRNA相對表達(dá)量優(yōu)于活血化瘀組和陽性藥物對照組。各組大鼠骨組織中Gli3蛋白方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比活血化瘀組降低(P<0.05)，提示補(bǔ)腎填精組下調(diào)Gli3蛋白含量優(yōu)于活血化瘀組；補(bǔ)腎填精組比陽性對照組顯著上升(P<0.01)，提示陽性對照組下調(diào)Gli3蛋白含量優(yōu)于補(bǔ)腎填精組。見表5。

表5 大鼠股骨中Gli3mRNA相對表達(dá)量和Gli3蛋白含量結(jié)果

2.5 各組大鼠腎組織中Gli3mRNA及其蛋白表達(dá)

各組大鼠腎組織中Gli3mRNA方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補(bǔ)腎填精組下調(diào)Gli3mRNA相對表達(dá)量優(yōu)于活血化瘀組。各組大鼠腎組織中Gli3蛋白方面，各個組間比較，模型空白組比正常組顯著升高(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比模型空白組顯著降低、活血化瘀組比模型空白組顯著降低、陽性對照組比模型空白組顯著降低，均具有顯著性差異(P<0.01)；補(bǔ)腎填精組比活血化瘀組顯著降低(P<0.01)，提示補(bǔ)腎填精組下調(diào)Gli3蛋白含量優(yōu)于活血化瘀組；陽性對照組比補(bǔ)腎填精組顯著下降(P<0.01)，提示陽性對照組下調(diào)Gli3蛋白含量優(yōu)于補(bǔ)腎填精組。見表6。

表6 大鼠腎組織中Gli3mRNA相對表達(dá)量和Gli3蛋白含量結(jié)果

3 討論

3.1 PMOP的中醫(yī)病因病機(jī)

中醫(yī)“腎藏精主骨”理論是藏象學(xué)說的重要組成部分，從“腎主骨”理論防治骨代謝失常的疾病特別是骨質(zhì)疏松癥,在臨床上具有特色和優(yōu)勢?！澳I主骨”理論最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》諸多篇章，如《素問·宣明五氣》曰：“腎主骨”。在《素問·上古天真論》這一篇，將女子以七為序，男子以八為序，分別論述了腎中精氣從稚嫩到充盛繼而衰減，人的外在形體的齒、發(fā)、骨有著相應(yīng)的變化?？梢姡梭w的骨骼得到充足的腎精滋養(yǎng)才能正常的發(fā)育生長，維持堅實的狀態(tài)。當(dāng)腎藏精失職，腎精氣虧虛，骨失所養(yǎng)，便形成骨質(zhì)疏松癥。

由于絕經(jīng)后女性往往臟腑生理功能衰退，影響精、氣、血、津液的生成和運(yùn)行，常常發(fā)生氣虛無力行血，導(dǎo)致血液運(yùn)行遲緩，久而久之形成瘀血，使血脈、經(jīng)絡(luò)不通，不通則痛，骨骼產(chǎn)生疼痛的癥狀。孫益等[4]通過臨床流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，瘀血質(zhì)占絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的11%，且臨床癥狀上患者出現(xiàn)腰背部明顯的刺痛、固定不移、動則加重、舌暗有瘀斑、脈細(xì)澀等表現(xiàn)。所以針對上述PMOP的中醫(yī)病因病機(jī)，本次研究采用補(bǔ)腎填精、活血化瘀法進(jìn)行干預(yù)治療，并且比較兩種不同治療方法的療效。臨床上中藥骨疏康顆粒具有補(bǔ)腎益氣，活血壯骨的功效，主治腎虛、氣血不足所致的中老年骨質(zhì)疏松癥，伴有腰脊酸痛、足膝酸軟、神疲乏力等癥狀。臨床應(yīng)用十余年，療效肯定，所以本次研究選取中藥骨疏康顆粒作為陽性藥物對照組。

研究結(jié)果提示，補(bǔ)腎填精、活血化瘀中藥復(fù)方、陽性藥物對照組均可以提升大鼠股骨骨密度，其中補(bǔ)腎填精組和陽性藥物對照組在提高骨密度方面，與模型組比較具有顯著性差異?；钛鼋M在提高骨密度方面與模型組比較差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。從骨密度數(shù)值來看，補(bǔ)腎填精組高于活血化瘀組，但補(bǔ)腎填精、活血化瘀組之間比較差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。說明兩種中藥復(fù)方都能夠促進(jìn)骨骼修復(fù)，對PMOP的骨代謝失衡起到調(diào)節(jié)作用，從而起到防治作用。

3.2 Hedgehog信號與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

3.2.1Hedgehog信號與骨代謝：Hedgehog( hedgehog，HH) 信號通路對骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用，近年來其在骨生物學(xué)中的作用受到更多的關(guān)注。HH信號通路對骨形成及MSCs 成骨分化進(jìn)行調(diào)控[5]。Hedgehog蛋白家族主要包括3種同源蛋白質(zhì)，分別是Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和Desert Hedgehog(DHH)。本研究團(tuán)隊在前期工作的基礎(chǔ)上圍繞Hedgehog信號通路開展了探討PMOP骨代謝失常的分子機(jī)制研究。研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠Hedgehog信號通路中蛋白家族SHH、Gli1異常表達(dá)，可能是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的機(jī)制之一[2-3]。

3.2.2PTCH1、Gli3與骨代謝：Hedgehog信號通路發(fā)生作用的過程中，Hedgehog信號分子可與細(xì)胞表面受體PTCH1結(jié)合，使靶基因平滑受體Smo活化，活化的Smo與類運(yùn)動蛋白Cos2等結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物可激活Hedgehog信號通路中鋅指蛋白家族Glis，促使Glis進(jìn)入核內(nèi)聚集并激活轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而啟動下游靶基因的表達(dá)[5]。PTCH1是Hedgehog信號通路中一個關(guān)鍵的結(jié)合點(diǎn)[6]。PTCH1究竟在PMOP發(fā)病機(jī)制中扮演何種角色，是否因為PTCH1的異常改變導(dǎo)致Hedgehog信號通路被激活而引起骨代謝異常，將是本次實驗繼續(xù)關(guān)注的內(nèi)容，即試探討PMOP的發(fā)病機(jī)制與PTCH1和Gli3的關(guān)系。

4 小結(jié)

本研究結(jié)果表明，正常組大鼠骨、腎組織中可以表達(dá)PTCH1和Gli3mRNA及其蛋白。與正常組比較，模型組大鼠骨組織和腎組織中PTCH1和Gli3mRNA表達(dá)及其蛋白含量顯著升高；與模型空白組比較，各個用藥組均能使PTCH1和Gli3mRNA表達(dá)及其蛋白含量顯著下調(diào)；各個用藥組間比較，補(bǔ)腎填精組PTCH1和Gli3mRNA表達(dá)及其蛋白含量下調(diào)優(yōu)于活血化瘀組，有顯著性差異。研究結(jié)果提示，PTCH1mRNA及蛋白含量和Gli3mRNA及蛋白含量在去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨組織和腎組織中顯著升高，提示PTCH1和Gli3可能參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨代謝失衡的發(fā)生和進(jìn)展。補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方和活血化瘀中藥復(fù)方可下調(diào)PTCH1和Gli3mRNA相對表達(dá)量及其蛋白含量，這可能是起到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制之一。