花生黑腐病抗病品種篩選及抗病相關(guān)酶活性測定

袁匯濤 張云霞 向梅梅 羅 梅 董章勇

(1仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物健康創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225；2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225)

花生黑腐病(peanut black rot)是由花生黑腐病菌(Calonectria ilicicola，冬青麗赤殼，無性階段為寄生柱帚霉Cylindrocladium parasiticum)引起的花生毀滅性病害。該病于1966年首次在美國喬治亞州的花生產(chǎn)區(qū)被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后擴(kuò)散到日本、韓國和澳大利亞等國家[2－6]。2009年，我國首次發(fā)現(xiàn)花生黑腐病，部分花生產(chǎn)區(qū)發(fā)病率高達(dá)50%[7]；隨后，還發(fā)現(xiàn)了由花生黑腐病菌引起的大豆紅冠腐病，該菌對華南地區(qū)的優(yōu)質(zhì)大豆品種具有極強(qiáng)的侵染力，個別地塊發(fā)病率高達(dá)80%[8]。潘汝謙等[9]根據(jù)國際植物檢疫措施標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的有害生物風(fēng)險性分析程序，評估得出花生黑腐病菌在中國屬于高度風(fēng)險性有害生物，對花生和大豆等作物的生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。我國修訂的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》將花生黑腐病菌列為新外來入侵檢疫性病菌[10]。

花生黑腐病菌的侵染力強(qiáng)，寄主范圍廣，能以微菌核的形式在土壤中存活很長時間，可通過種子、帶菌土壤、病殘組織等多種途徑傳播[9，11－12]。一旦侵染發(fā)病，可引起花生的果針、莢果和根系變黑腐爛，最終導(dǎo)致患病植物萎焉和死亡，造成損失一般在10%以上，受害嚴(yán)重時損失率高達(dá)50%[1，6]。殺菌劑雖然可以有效減少苗期病害的產(chǎn)量損失[6，13－14]，但篩選和培育抗病品種是防治病害最為經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的途徑[15－19]。藍(lán)國兵等[20]用苗期接種法對廣東推廣種植的15 個主要花生品種的花生黑腐病抗性水平進(jìn)行了鑒定，篩選到2 個抗病品種，1 個高感品種。但該研究篩選的花生品種數(shù)量較少，且未對其抗性機(jī)制進(jìn)行探究。

本研究擬通過幼芽水培接種方法對128 個花生品種進(jìn)行花生黑腐病的抗性鑒定，通過盆栽接種方法進(jìn)行檢驗(yàn)，并測定花生接種病原菌后抗病相關(guān)酶活性的變化，以期為花生黑腐病抗病育種及品種的田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生黑腐病菌菌株Ci14017 分離自廣東省梅州市花生田間病株，由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。128 個供試花生品種(或材料)由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鄭奕雄教授惠贈。

1.2 抗病性評價標(biāo)準(zhǔn)

根腐等級參照Dong 等[21]的方法劃分為5 級，分級標(biāo)準(zhǔn)描述如下:0 級:沒有癥狀；1 級:莖基部輕微變褐；2 級:莖基部變黑，主根變黑長度小于50%；3 級:莖基部變黑，主根變黑長度大于50%，有少許次生根存在；4 級:主根完全變黑并開始腐爛，次生根腐爛掉落；5 級:主根完全變黑腐爛，植株萎蔫甚至死亡。

病情指數(shù)＝∑(各級發(fā)病株數(shù)×各級代表數(shù)值)/(調(diào)查總數(shù)×最高病情級數(shù))×100。

免疫(Ⅰ):病情指數(shù)＝0；高抗(HR):0<病情指數(shù)≤10；中抗(MR):10<病情指數(shù)≤20；中感(MS):20<病情指數(shù)≤30；高感(HS):病情指數(shù)>30。

1.3 水培花生的抗病性測定

選取健康的花生種子放入培養(yǎng)皿中，加無菌水放置于30℃培養(yǎng)箱中黑暗催芽2 d。每隔12 h 換一次水。選取胚根1～2 cm 長的幼芽用于試驗(yàn)。

將花生黑腐病菌接種于馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose，PD)培養(yǎng)液中，25℃、180 r·min－1培養(yǎng)5 d。用滅菌紗布過濾菌液，刮取菌絲，吸干水分后稱取5 g 菌絲加入1 L 無菌水中勻漿備用。幼芽以0.5%菌絲懸浮液浸泡10 min 接種，保濕2 d 后水培，25℃光照培養(yǎng)室中生長10 d 后觀察。對128 份花生品種進(jìn)行抗病性鑒定，以無菌水為對照，每個品種3 次重復(fù)，每個重復(fù)10 株。

1.4 盆栽花生的抗病性測定

稱取30 g 燕麥粒煮沸30 min，裝入100 mL 組培瓶中滅菌，將花生黑腐病菌接種至燕麥粒培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，晾干備用。

將T09、AS09、P562、桂花35、云花生1 號等5 個花生品種催芽，以帶菌燕麥粒拌土接種法進(jìn)行溫室盆栽抗性試驗(yàn)，接種濃度為0.5%，每次品種3 次重復(fù)，每次重復(fù)10 株。25℃恒溫光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d 后觀察。

1.5 抗病相關(guān)酶的提取和活性測定

以T09 和P562 兩個花生品種為研究對象，采用上述幼芽水培的方法進(jìn)行病原菌接種。每個處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)15 粒種子。分別于接種后0、0.25、0.5、1、3、5、7、9 d 取樣，提取粗酶液進(jìn)行酶活性的測定。

過氧化物酶(peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo-nialyase，PAL) 和多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)提取和活性測定參照范蘭蘭等[22]的方法；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的提取和活性測定參照王輝[23]的方法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用Excel 軟件與DPS 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 水培花生的抗病性評價

由表1 可知，病情指數(shù)大于30 的品種有72 個，病情指數(shù)為20～30 的品種有43 個，病情指數(shù)為10～20品種有13 個，病情指數(shù)在10 以下的品種有1 個。由此可知，128 個花生品種中，對花生黑腐病表現(xiàn)出免疫、高抗、中抗、中感、高感的品種分別有0、1、13、42 和72 個，分別占供試花生品種的0、0.8%、10.2%、33.7%和56.3%。其中，T09 的病情指數(shù)最低，為8.0，發(fā)病率為36.7%；P562 的病情指數(shù)最高，為46.0，發(fā)病率為100%。

表1 128 個花生品種抗花生黑腐病的病情統(tǒng)計Table 1 Disease statistics of 128 peanut varieties resistant to peanut black rot

2.2 盆栽花生的抗病性評價

以水培測試后確定不同抗性的T09(HR)、AS09(MR)、P562(HS)、桂花35(HS)、云花生1 號(MS)為研究對象，以帶菌燕麥粒拌土接種法進(jìn)行花生盆栽抗性試驗(yàn)。接種30 d 后觀察發(fā)現(xiàn)，接種花生黑腐病菌的花生植株全部發(fā)病，根部基本變黑或腐爛死亡，而對照花生根莖健康無病癥(圖1)。其中，P562 花生發(fā)病最為嚴(yán)重，植株死亡率為41.1%，部分植株莖基部已經(jīng)長出紅色子囊果；桂花35 發(fā)病程度次之，植株死亡率為25%，亦有部分死亡植株莖基部長出子囊果；而云花生、AS09、T09 發(fā)病程度較輕，死亡率分別為15%、13.3%和11.1%(表2)。由此可見，T09 最抗病，P562最感病。盆栽試驗(yàn)的結(jié)果與幼芽水培接種試驗(yàn)的結(jié)果一致。

2.3 抗病相關(guān)酶活性的變化

2.3.1 PAL 活性的變化 由圖2 可知，T09 和P562兩個品種接種花生黑腐病菌后，PAL 活性均升高。其中，高抗品種T09 的PAL 活性在接種后0.5 和5 d 分別出現(xiàn)高峰，而高感品種P562 在接種后1 d 出現(xiàn)高峰。T09最大峰值為451.09 U·g－1·h－1FW，P562最大峰值為318.37 U·g－1·h－1FW?？共∑贩N在接種病原菌后PAL 活性峰值出現(xiàn)較早，峰值出現(xiàn)的次數(shù)也較多；感病品種在接種病原菌后PAL 活性峰值出現(xiàn)較晚，峰值出現(xiàn)的次數(shù)較少。

表1(續(xù))

2.3.2 PPO 活性的變化 由圖3 可知，T09 和P562 兩個品種接種花生黑腐病菌后PPO 活性均升高，高抗品種T09 的PPO 活性在接種后0.5 d 出現(xiàn)峰值，最大峰值為271.67 U·g－1·min－1FW；高感品種P562 在接種后1 d出現(xiàn)峰值，最大峰值為160.02 U·g－1·min－1FW。高抗品種接種病原菌后其酶活性出現(xiàn)峰值較早且峰值大，而高感品種接種病原菌后其酶活性出現(xiàn)峰值較晚且峰值較小。

表2 不同花生抗性品種室內(nèi)盆栽試驗(yàn)花生黑腐病的發(fā)病情況Table 2 Incidence of black rot of peanut in laboratory pot experiment of different peanut resistant varieties

2.3.3 POD 活性的變化 由圖4 可知，兩個品種接種花生黑腐病菌后POD 活性均升高，其中，高抗品種T09的POD 活性在接種后0.5 d 出現(xiàn)高峰，最大峰值為239.23 U·g－1·min－1FW，高感品種P562 均在接種后0.25 d 出現(xiàn)高峰，最大峰值為135.75 U·g－1·min－1FW。高抗品種接種病原菌后其酶活性雖出現(xiàn)峰值較晚但峰值較高，而高感品種接種病原菌后其酶活性雖出現(xiàn)峰值較早但峰值較低。

2.3.4 SOD 活性的變化 由圖5 可知，兩個品種接種花生黑腐病菌后SOD 活性均升高，其中，高抗品種T09 在接種后的第7 天出現(xiàn)高峰，最大峰值為28.08 U·g－1·h－1FW；高感品種P562 在接種后的第3 天出現(xiàn)高峰，最大峰值為16.79 U·g－1·h－1FW。

3 討論

本研究使用幼芽水培接種的方法對128 個花生品種的抗性進(jìn)行篩選，通過帶菌燕麥粒拌土接種的方法對不同抗性水平的5 個品種進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果與幼芽水培接種鑒定的結(jié)果一致。關(guān)于花生黑腐病抗性鑒定方法有田間自然誘發(fā)鑒定和溫室人工接種鑒定兩種[20]。然而，田間影響花生黑腐病發(fā)生的因素有很多，因此田間自然誘發(fā)的鑒定結(jié)果穩(wěn)定性不高，試驗(yàn)重復(fù)性較差。溫室人工接種鑒定方法有微菌核拌土接種法和麥粒菌種拌土接種法，但微菌核拌土接種最少需要12 周，麥粒菌種拌土接種最少需要7 周，試驗(yàn)周期較長[21，24]。本研究所建立的菌絲懸浮液浸泡幼芽，保濕后水培的花生黑腐病抗性鑒定方法簡便、高效，10 d 即可獲得結(jié)果，且所得結(jié)果穩(wěn)定性好、重復(fù)性高，非常適合應(yīng)用于苗期抗病品種的大規(guī)模篩選。

本研究的128 個花生品種對黑腐病表現(xiàn)出抗病和感病的品種分別為14 和114 個，占11%和89%。藍(lán)國兵等[20]對15 個花生品種進(jìn)行抗性水平鑒定，獲得抗病和感病品種分別為9 和6 個，占60%和40%。抗感品種的比例有較大差別，原因可能有以下三點(diǎn):首先，使用的花生品種不一樣，難以直接對比；其次，接種方法和抗性標(biāo)準(zhǔn)不同也可能會造成鑒定結(jié)果的差異；再次，其他研究選擇的是致病力中等的菌株進(jìn)行抗病性鑒定，而本研究所用的Ci14017 菌株則是高致病力菌株，雖然沒有直接比較兩者之間的致病力差異，但使用的菌株不同也可能是造成鑒定結(jié)果的比例有差異的原因。本研究盡管沒有篩選出對花生黑腐病免疫的品種，但只要擴(kuò)大篩選范圍，將會繼續(xù)豐富抗病品種的數(shù)量，為花生品種的推廣和布局提供更充足的依據(jù)。

本研究所鑒定的128 份品種多數(shù)為農(nóng)家種和外引材料，未涉及非近緣種和野生種。抗性鑒定結(jié)果表明，雖然不同遺傳背景花生品種對黑腐病的抗性存在差異，但大部分為感病品種，高抗花生黑腐病型材料嚴(yán)重缺乏。本研究結(jié)果表明，表現(xiàn)中抗的品種大部分為農(nóng)家種，因此應(yīng)重視和加強(qiáng)對農(nóng)家種、野生種和非近緣種的篩選鑒定。同時，要特別重視材料水平抗性的鑒定和篩選，確保材料抗病性的穩(wěn)定和適用范圍。

PAL、PPO、POD 和SOD 被認(rèn)為和抗病性密切相關(guān)[25－28]，在抗病花生品種中酶的活性會顯著升高[22，29]。本研究選用高抗品種T09 以及高感品種P562 測定PAL、PP、 POD 和SOD 活性。在接種花生黑腐病菌之前，T09 的4 種酶活性都比P562 的高，說明這些酶都不同程度地參與了花生的抗病性，并且在抗病品種中參與程度更高。在接種花生黑腐病菌之后，T09 的4 種酶活峰值比P562 的更高，表明在病原菌的脅迫下，抗病品種的防御相關(guān)酶得到充分的誘導(dǎo)，更多抗性物質(zhì)被調(diào)用，形成保護(hù)屏障，抵抗病原微生物的侵害。

4 結(jié)論

本研究128 個花生品種對花生黑腐病表現(xiàn)出抗病和感病的品種分別14 和114 個，占11%和89%；其中T09 為高抗品種，P562 為感病性最高的高感品種。在接種花生黑腐病菌之前，T09 的PAL、PPO、POD 和SOD 四種酶活性都比P562 的高；在接種花生黑腐病菌之后，T09 的四種酶活峰值均比P562 的更高。本研究為后續(xù)深入探討花生黑腐病的抗病機(jī)制及花生高抗品種的選育奠定了基礎(chǔ)。