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    黃芩苷β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體的制備與藥動(dòng)學(xué)研究

    2021-09-10 08:39:10
    西北藥學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:包合物水浴脂質(zhì)體

    余 清

    (湖北六七二中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430070)

    黃芩苷是從唇形科植物黃芩(Scutellariaba-icalensisGeorgi)的干燥根莖中提取分離出的黃酮類化合物,具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎、抗病毒等藥理作用[1]。已有文獻(xiàn)表明,黃芩苷對(duì)乙肝的3種抗原具有明顯抑制作用,對(duì)慢性乙肝并發(fā)癥也具有良好的治療效果[2-3],主治急慢性肝炎,療效確切[4]。黃芩苷水溶性差,生物利用度低,限制了其臨床應(yīng)用[5]。為了提高黃芩苷的溶解性,增加其口服生物利用度,研究人員已將其制備成固體脂質(zhì)納米粒[6]、納米晶[7]、固體分散體[8]及磷脂復(fù)合物[9]等新型給藥系統(tǒng)。β-環(huán)糊精(β-CD)包合物[10]已在提高難溶性藥物的水溶性、改善藥物生物利用度及增加藥物穩(wěn)定性等方面得到了廣泛關(guān)注,其脂質(zhì)體具有控制藥物釋放、延長(zhǎng)藥物半衰期、提高藥物生物利用度等優(yōu)勢(shì)[11]。因此,本研究擬將黃芩苷首先制備成β-CD包合物,再包載到脂質(zhì)體中,制備成β-CD包合物脂質(zhì)體載藥系統(tǒng),并通過大鼠口服考察其生物利用度情況,為黃芩苷的口服新劑型研究提供依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1儀器 U3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司);BXXW-LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī)(北京市博翔興旺科技發(fā)展有限公司);Nicolet 380型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR,美國(guó)Nicolet公司);Nano ZS90納米粒度及Zeta電位儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);JEM-2100F型透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。

    1.2試藥 黃芩苷(四川省玉鑫藥業(yè)有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.60%,批號(hào)190806);黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%,批號(hào)110715-201312);蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%,批號(hào)100080-201406);大豆卵磷脂(SPC,沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司);膽固醇(安徽酷爾生物工程有限公司);乙酸乙酯和β-CD(分析純),均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);磷鎢酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);pH 6.8磷酸鹽緩沖液(PBS,自制);甲醇和乙腈(色譜純,F(xiàn)isher公司);氯仿(北京化工廠);水為超純水。

    2 方法與結(jié)果

    2.1黃芩苷β-CD包合物的制備及包合率測(cè)定 采用飽和水溶液法制備黃芩苷β-CD包合物[12-13],稱取處方量β-CD加入到一定溫度水中攪拌溶解,制成β-CD飽和溶液;稱取處方量黃芩苷乙醇溶液緩慢滴加到β-CD飽和溶液中,恒溫水浴并持續(xù)攪拌1 h,冷卻到室溫,置于冰箱中冷藏一晝夜,沙漏抽濾,無(wú)水乙醇洗滌3次,冷凍干燥去除水分,即得黃芩苷β-CD包合物。

    精密稱取黃芩苷β-CD包合物1.0 g,加入到乙醇中超聲15 min,加乙醇定容至20 mL,離心,移取全部上清液,減壓干燥,殘留物用甲醇10 mL溶解,過0.22 μm微孔濾膜,進(jìn)樣檢測(cè)藥物含量,計(jì)算包合率。

    2.2正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化黃芩苷β-CD包合物制備工藝 選取對(duì)黃芩苷β-CD包合物制備工藝影響較大的3個(gè)因素,即攪拌速度、水浴溫度以及藥物與載體質(zhì)量比,每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平,以包合率作為考察指標(biāo),采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳制備工藝[14],正交實(shí)驗(yàn)的各因素與水平見表1,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

    表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

    由表2和表3可知,對(duì)黃芩苷β-CD包合物的包合率影響順序大小依次為C(藥物與載體質(zhì)量比)>A(攪拌速度)>B(水浴溫度)。方差分析結(jié)果顯示,藥物與載體質(zhì)量比與攪拌速度對(duì)包合率具有顯著影響(P<0.05),水浴溫度影響不顯著(P>0.05)。根據(jù)直觀分析結(jié)果,確定黃芩苷β-CD包合物在制備過程中攪拌速度為120 r·min-1,水浴溫度為55 ℃,藥物與載體質(zhì)量比為1∶3。

    2.3黃芩苷β-CD包合物的驗(yàn)證 按照質(zhì)量比為1∶3稱取黃芩苷和β-CD,混合研磨后過80目篩,制備黃芩苷β-CD物理混合物。分別取黃芩苷、β-CD、黃芩苷與β-CD物理混合物以及黃芩苷β-CD包合物,采用FTIR進(jìn)行光譜分析。測(cè)定條件:掃描范圍為2 000~400 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為1次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

    圖1 黃芩苷β-CD包合物的紅外光譜

    β-CD和黃芩苷紅外光譜圖中可找到物理混合物的所有特征峰,說明物理混合物中β-CD與黃芩苷并未發(fā)生相互作用。相比于黃芩苷紅外光譜圖,黃芩苷β-CD包合物紅外光譜圖中1 500~1 700 cm-1范圍的苯環(huán)特征峰、1 220~1 300 cm-1范圍的苯環(huán)C=C伸縮振動(dòng)的特征峰、1 000~1 100 cm-1范圍的苯環(huán)呼吸振動(dòng)峰和 C-O-C 伸縮振動(dòng)的特征峰發(fā)生位移且峰強(qiáng)度明顯減弱,表明黃芩苷與β-CD不是簡(jiǎn)單的物理混合,而是發(fā)生了明顯的相互作用,證明包合物已經(jīng)形成。

    2.4黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的制備 本研究采用薄膜-超聲分散法[15]制備黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體。按處方量稱取大豆卵磷脂、膽固醇和油酸,加入適量的氯仿溶解,移至茄形瓶中,固定到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上,在65 ℃水浴溫度中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿溶劑,在瓶?jī)?nèi)壁最終形成均勻的半透明狀薄膜。向茄形瓶中加入一定量的黃芩苷β-CD包合物水溶液,充分振搖,在50 ℃水浴條件下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)水化薄膜,直至全部洗脫,得到黃芩苷β-CD包合物初懸液,水浴超聲0.5 h,依次經(jīng)0.22、0.10 μm微孔濾膜擠出,即得黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體。

    2.5黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的性質(zhì)研究

    2.5.1粒徑分布及Zeta電位測(cè)定 采用Nano ZS90納米粒度及Zeta電位儀測(cè)定黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的平均粒徑和Zeta電位。取適量黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體樣品溶液,加入超純水稀釋后放入樣品池測(cè)定粒徑,另取黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體樣品用超純水稀釋200倍后放入樣品池測(cè)定Zeta電位,每份樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。見圖2和圖3。

    由圖2和圖3可知,黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體呈單峰分布,平均粒徑為(90.82±4.59) nm(n=3),多分散性指數(shù)(PDI)為(0.212±0.007)(n=3),說明黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的粒徑分布均勻;Zeta電位為(-41.8±1.9) mV(n=3),說明黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體表面帶負(fù)電荷,電荷絕對(duì)值大于30 mV,說明粒子間存在較強(qiáng)的靜電排斥力,有利于黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

    圖2 黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的粒徑分布

    圖3 黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的Zeta電位分布

    2.5.2透射電鏡觀察 取上述最佳工藝制備的黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體適量,滴到300目銅網(wǎng)格上,靜置2 min,用濾紙除去表面水分,晾干,滴加20 mg·mL-1磷鎢酸負(fù)染色10 min,晾干后用透射電子顯微鏡觀察黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的形態(tài)和大小,結(jié)果見圖4。

    圖4 黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的透射電鏡圖

    由圖4可知,黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體粒徑相對(duì)均一,外觀圓整,無(wú)黏連,粒徑大部分在100 nm左右,說明本研究制備的黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體質(zhì)量較好。

    2.6體外藥物釋放研究 采用透析袋擴(kuò)散法考察黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體在不同pH值介質(zhì)中的體外藥物釋放特性,將黃芩苷1.5 mg溶于無(wú)水乙醇中作為對(duì)照組,取黃芩苷β-CD包合物溶液以及黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體溶液作為實(shí)驗(yàn)組(黃芩苷含量與對(duì)照組相同)。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣品分別置于透析袋中,扎緊兩端,置于釋放介質(zhì)50 mL中,0~2 h釋放介質(zhì)為pH1.2鹽酸溶液(SDS質(zhì)量濃度為3.5 mg·mL-1),2~12 h釋放介質(zhì)為pH6.8 PBS(SDS質(zhì)量濃度為3.5 mg·mL-1),于37 ℃恒溫?fù)u床上以100 r·min-1勻速振搖,于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取釋放介質(zhì)1 mL,并補(bǔ)充等量釋放介質(zhì),釋放介質(zhì)經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,續(xù)濾液采用HPLC法測(cè)定藥物含量,并計(jì)算累積釋放度,繪制釋放度-時(shí)間曲線,見圖5。

    圖5 釋放度-時(shí)間曲線 (n=6)

    由圖5可知,黃芩苷與黃芩苷β-CD包合物在2 h內(nèi)基本釋放完全,而黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體在12 h釋放度為82.3%,表明黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體具有良好的緩釋性能。

    2.7體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

    2.7.1色譜條件 迪馬C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(含甲酸質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1),梯度洗脫程序見表4,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,流速為1 mL·min-1,柱溫為33 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。

    表4 洗脫條件

    2.7.2血漿中藥物的提取與處理 取待測(cè)大鼠血漿100 μL,置于1.5 mL EP管中,加入質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的黃芩苷溶液10 μL以及內(nèi)標(biāo)溶液,渦旋60 s,加入適量乙酸乙酯進(jìn)行萃取,渦旋5 min,以3 500 r·min-1離心15 min,吸取900 μL上清液,置于1.5 mL EP管中,37 ℃條件下氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉?00 μL甲醇復(fù)溶,渦旋5 min,以15 000 r·min-1離心15 min,取上清液20 μL進(jìn)樣分析。黃芩苷含量按照2.7.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄黃芩苷峰面積(As)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai),計(jì)算As與Ai的比值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥質(zhì)量濃度。

    2.7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 向不同質(zhì)量濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入0.2 mL大鼠空白血漿,制備成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的血漿樣品。血漿樣品按照2.7.2項(xiàng)下方法處理,藥物質(zhì)量濃度按照2.7.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。記錄黃芩苷峰面積(As)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai),計(jì)算As與Ai的比值,以藥物質(zhì)量濃度(C)與該比值作線性回歸,得回歸方程為:As/Ai=275.31C-0.123(r=0.996 3)。

    2.7.4精密度和提取回收率測(cè)定 取大鼠空白血漿200 μL,配制黃芩苷低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品,血漿樣品按照2.7.2項(xiàng)下方法處理,考察方法精密度及提取回收率情況。結(jié)果顯示,血漿樣品測(cè)定方法精密度RSD≤5.9%,低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品中黃芩苷的絕對(duì)回收率在84.9%~94.1%之間,符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定,該方法可用于大鼠血漿中黃芩苷的含量測(cè)定。

    2.7.5動(dòng)物分組及給藥 取禁食12 h的Wistar大鼠,隨機(jī)分為A、B組,每組6只,其中A組作為實(shí)驗(yàn)組,口服黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體樣品3 mL,B組作為對(duì)照組,口服黃芩苷混懸液1 mL。給藥后每組分別在 0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼眶取血,所得血樣置于肝素浸潤(rùn)過的離心管中,以4 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液,-20 ℃保存,備用。血漿樣品按照2.7.2項(xiàng)下方法處理,血藥質(zhì)量濃度按照2.7.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品中黃芩苷的質(zhì)量濃度。

    血藥質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)采用DAS 2.0 (Drug And Statistics for Windows)軟件進(jìn)行擬合分析,根據(jù)赤池信息判據(jù)最小原則(AIC)確定最佳藥代動(dòng)力學(xué)模型,并求得以下主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù):血漿藥物消除半衰期(t1/2)、消除速率常數(shù)(Ke)、表觀分布容積(Vd)、血漿清除率(CL)、0~t時(shí)間點(diǎn)的藥-時(shí)曲線下面積(AUC(0~t))、0~∞時(shí)間點(diǎn)的藥-時(shí)曲線下面積(AUC(0~∞))、吸收速率常數(shù)(Ka)、血藥達(dá)峰質(zhì)量濃度(Cmax)、血藥達(dá)峰時(shí)間(tmax),結(jié)果見表5。計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)黃芩苷的血藥質(zhì)量濃度,繪制血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線,見圖6。

    表5 給藥后黃芩苷主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) (n=6)

    圖6 黃芩苷的血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線 (n=6)

    由表5可知,采用DAS 2.0軟件進(jìn)行擬合分析,根據(jù)AIC值最小原則確定黃芩苷符合權(quán)重因子為1的一室模型。以黃芩苷成分為考察指標(biāo),相比于黃芩苷混懸液,黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體的t1/2明顯延長(zhǎng),其中t1/2、Cmax和AUC(0~∞)分別為黃芩苷混懸液的2.16、0.78、2.15倍。

    根據(jù)表5AUC數(shù)據(jù)計(jì)算黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體對(duì)相同劑量的黃芩苷混懸液的相對(duì)生物利用度(Fr),F(xiàn)r=AUC自制制劑÷AUC參比制劑×100%。

    將黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體和黃芩苷混懸液的AUC(0~t)代入公式計(jì)算Fr:Fr=14.077÷7.635×100%=1.844%,表明將黃芩苷制備成β-CD包合物脂質(zhì)體后與混懸液相比,生物利用度有了較大的提高。

    3 討論

    黃芩是一種具有良好保肝護(hù)肝作用的中藥[16],其主要活性成分黃芩苷也被證明對(duì)乙肝以及乙肝并發(fā)癥具有確切療效[17-18]。但黃芩苷水溶性差、生物利用度低,限制了其臨床應(yīng)用。因此采用制劑手段提高黃芩苷的生物利用度對(duì)黃芩苷的臨床應(yīng)用具有重要意義[19-20]。

    本研究采用飽和水溶液法制備黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃芩苷β-CD包合物的最佳工藝處方為:攪拌速度為120 r·min-1,水浴溫度為55 ℃,藥物與載體質(zhì)量比為1∶3。采用薄膜-超聲分散法制備黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體,平均粒徑為(90.82±4.59) nm,Zeta電位為(-41.8±1.9) mV。體外溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體具有明顯的緩釋作用。大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示,黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的AUC(0~∞)增加,Cmax降低,t1/2延長(zhǎng),分別為黃芩苷混懸液的2.15、0.78、2.16倍,說明將黃芩苷制備成β-CD包合物脂質(zhì)體后可提高黃芩苷的生物利用度,延長(zhǎng)其半衰期。

    綜上所述,本研究制備的黃芩苷β-CD包合物脂質(zhì)體具有良好的緩釋效果,且明顯提高了黃芩苷的生物利用度,說明本研究所用劑型提高了黃芩苷的臨床應(yīng)用價(jià)值,也對(duì)黃芩苷新劑型的開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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