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    依折麥布固體脂質(zhì)納米粒的制備與大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

    2021-09-10 08:38:36邱愛(ài)麗祁靜波
    西北藥學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:麥布脂質(zhì)電位

    邱愛(ài)麗,王 敏,謝 鵬,祁靜波

    (1.唐山市協(xié)和醫(yī)院藥劑科,唐山 063000;2.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院,唐山 063000)

    依折麥布通過(guò)選擇性抑制腸道內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性以達(dá)到降低膽固醇吸收的目的,是目前唯一的膽固醇吸收抑制劑[1-2]。依折麥布屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS)Ⅱ類藥物,在水中極難溶解(約為2.3 μg·mL-1),不利于藥物口服吸收[3-4],另外依折麥布是P-糖蛋白(P-gp)的底物,口服吸收后在P-gp作用下外排,降低了口服生物利用度,增加了藥物生物變異性[5],嚴(yán)重影響其治療效果。本研究將依折麥布制備成固體脂質(zhì)納米粒,同時(shí)加入D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)對(duì)依折麥布固體脂質(zhì)納米粒(EZE-SLNs)表面進(jìn)行修飾,通過(guò)大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)評(píng)估藥物生物利用度,為依折麥布的口服新劑型研究提供依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1儀器 安捷倫1220型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);DF-101SZ型數(shù)顯轉(zhuǎn)速集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司);Scientz-1200E型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);JEM-1400Flash型透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社);Malvern Zetasizer Nano-ZS型納米粒徑/電位分析儀(英國(guó)馬爾文公司)。

    1.2試藥 依折麥布原料藥(無(wú)錫福祈制藥有限公司,批號(hào)20191214,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%);伊曲康唑(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)100631-201402);山崳酸甘油酯(Compritol-888 ATO,德國(guó)巴斯夫公司);大豆磷脂(南京威爾藥業(yè)股份有限公司);D-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS,江西聯(lián)陸生物科技有限公司);鹽酸和無(wú)水乙醇,均購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司;磷鎢酸鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)和十二烷基硫酸鈉,均購(gòu)自巴斯夫新材料有限公司;pH6.8磷酸鹽緩沖液(PBS,自制)。

    1.3動(dòng)物 Wister種大白鼠,雌雄各半,體質(zhì)量為(200±20) g,天津醫(yī)科大學(xué)提供,合格證號(hào):SYXK(津)2019-004。

    2 方法與結(jié)果

    2.1EZE-SLNs與基于TPGS表面修飾的EZE-SLNs(TPGS-EZE-SLNs)的制備 通過(guò)前期的制備工藝篩選,采用乳化超聲-低溫固化法[6-7]制備EZE-SLNs。按照處方量稱取山崳酸甘油酯2 500 mg加入到乙醇10 mL中攪拌溶解,再稱取依折麥布原料藥250 mg加入到上述乙醇中攪拌溶解,呈透明狀液體,得到油相溶液;另稱取大豆磷脂1 000 mg加入到純化水50 mL中,加熱至75 ℃,攪拌分散形成乳白色液體,得到水相溶液;在3 000 r·min-1磁力攪拌下,將上述油相溶液通過(guò)注射器滴加到水相溶液中,形成乳白色液體,減壓蒸發(fā)除去乙醇,加水定容至50 mL;將超聲探頭置于該溶液中進(jìn)行超聲處理,超聲功率為200 W,超聲10 s,間歇5 s,持續(xù)超聲5 min,超聲結(jié)束后立即將溶液置于冰水浴中冷卻,即得到EZE-SLNs。除在水相中加入TPGS 200 mg外,TPGS-EZE-SLNs的制備工藝和處方中各成分的用量與EZE-SLNs均相同。將制備得到的EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs置于4 ℃冰箱中冷藏,備用。

    2.2制劑性質(zhì)表征

    2.2.1粒徑分布/Zeta電位測(cè)定 使用Malvern Zetasizer Nano-ZS型納米粒徑/電位分析儀測(cè)量EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs的粒徑分布、多聚分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位。樣品的制備方法:取EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs各200 μL,分別置于直徑為1 cm的石英比色杯中,加入去離子水3 mL稀釋,輕輕振搖,置于激光粒度測(cè)定儀中檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)為635 nm,入射角為90°,環(huán)境溫度為25 ℃,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,取平均值,結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 制劑性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

    EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs的粒徑大小相近,均在100 nm左右,文獻(xiàn)報(bào)道[8-9],納米粒子在100 nm左右更容易透過(guò)腸道細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi);Zeta電位是評(píng)價(jià)膠體分散體穩(wěn)定性的重要指標(biāo),其絕對(duì)值越大表明該體系越穩(wěn)定,固體脂質(zhì)納米粒能夠維持穩(wěn)定性需要Zeta電位絕對(duì)值大于30 mV,只有達(dá)到該電位絕對(duì)值,擴(kuò)散層才具有足夠的厚度避免微粒之間聚集[10]。本研究制備的2種固體脂質(zhì)納米粒Zeta電位絕對(duì)值均大于30 mV,且TPGS-EZE-SLNs的Zeta電位絕對(duì)值更大,測(cè)定的電位值能夠間接表明EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs物理穩(wěn)定性良好,不易發(fā)生聚集和沉淀。

    2.2.2微觀形態(tài)觀察 通過(guò)透射電子顯微鏡觀察EZE-SLNs與TPGS-EZE-SLNs的表面形態(tài)。分別取EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs各1滴,滴加到碳涂層的銅網(wǎng)上,再滴加蒸餾水稀釋,揮干水分,滴加質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的磷鎢酸溶液負(fù)染色,再次揮干水分,在透射電鏡下觀察2個(gè)樣品的微觀形態(tài)。見(jiàn)圖1。

    圖1 EZE-SLNs(A)和TPGS-EZE-SLNs(B)的透射電鏡照片

    由圖1可知,EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs均呈球形分布,邊界清晰,無(wú)藥物結(jié)晶析出,粒徑大部分在50~100 nm之間。

    2.3溶出度比較 載藥固體脂質(zhì)納米粒口服進(jìn)入胃腸道后通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入體循環(huán),因此,需要模擬體內(nèi)環(huán)境考察固體脂質(zhì)納米粒在pH值為1.2和pH值為6.8條件下的體外藥物釋放情況,以確定納米粒在被吸收進(jìn)入體循環(huán)之前藥物從納米載體中釋放到釋放介質(zhì)中的程度。采用動(dòng)態(tài)透析法比較EZE-SLNs、TPGS-EZE-SLNs和EZE混懸液的藥物釋放度。選擇截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa的透析膜,將2種固體脂質(zhì)納米粒樣品溶液及EZE混懸液(藥物分散到PVP K30溶液中)置于透析袋中,兩端系緊,藥物含量均為10 mg,釋放介質(zhì)在前2 h選擇pH值為1.2的鹽酸溶液(含十二烷基硫酸鈉質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1),2 h后選擇pH值為6.8的PBS(含十二烷基硫酸鈉質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1),介質(zhì)體積均為500 mL,水浴溫度為37 ℃,攪拌速度為100 r·min-1,在預(yù)定的時(shí)間間隔(0、0.5、1、2、4、6、8、12 h)取樣,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液適當(dāng)稀釋后使用HPLC法進(jìn)行分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣后立即將相同體積的空白釋放介質(zhì)[溫度保持在(37±0.5) ℃]補(bǔ)加到溶出杯中。釋放曲線見(jiàn)圖2。

    圖2 EZE-SLNs、TPGS-EZE-SLNs和EZE混懸液的體外藥物釋放曲線

    由圖2可知,EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs前2 h在pH值為1.2的鹽酸中的釋放量基本一致,約有25%的藥物從載藥固體脂質(zhì)納米粒中釋放出來(lái),隨后置于pH值為6.8 PBS中,在12 h約有80%的藥物釋放;EZE混懸液藥物釋放較為緩慢,前2 h在pH值為1.2的鹽酸中僅有約5%的藥物釋放,在pH值為6.8的PBS中12 h藥物釋放量也僅僅達(dá)到約18%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與EZE混懸液相比,EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs均能提高藥物的釋放度,有望改善藥物的生物利用度。

    2.4模擬人體生理環(huán)境穩(wěn)定性考察 固體脂質(zhì)納米粒在胃腸道內(nèi)滯留一段時(shí)間才能被吸收進(jìn)入體內(nèi),因此,胃腸道中的液體環(huán)境會(huì)對(duì)納米粒的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響,進(jìn)而阻礙藥物吸收[11]。因此本研究考察EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在模擬人工胃液(SGF)或模擬人工腸液(SIF)中的粒徑及Zeta電位變化,結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

    圖3 EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在SGF中的粒徑及Zeta電位變化

    圖4 EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在SIF中的粒徑及Zeta電位變化

    由圖3和圖4可知,EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在SGF中前30 min粒徑呈增加趨勢(shì),平均直徑均達(dá)到200~300 nm,隨后粒徑不再增加,測(cè)得固體脂質(zhì)納米粒的Zeta電位為-8~-10 mV,Zeta電位絕對(duì)值降低,導(dǎo)致納米粒之間發(fā)生聚集,粒徑增大。相反,EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs在SIF中的粒徑基本保持不變,測(cè)得Zeta電位顯示與初始值相近,為-35~-38 mV。

    2.5藥動(dòng)學(xué)研究

    2.5.1色譜條件 色譜柱為安捷倫Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為水-乙腈(30∶70);流速為1.0 mL·min-1;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為232 nm[12]。

    2.5.2血漿處理 大鼠眼眶取血,用內(nèi)壁涂有肝素鈉的圓底離心管收集血液,以4 000 r·min-1離心10 min,收集血漿,取大鼠血漿150 μL,置于尖底離心管中,加入質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的伊曲康唑甲醇溶液10 μL作為內(nèi)標(biāo),渦旋混合5 min,加入乙腈200 μL,再渦旋混合,沉淀血漿蛋白,以10 000 r·min-1離心10 min,取上清液20 μL,按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)藥物含量,計(jì)算藥物質(zhì)量濃度。

    2.5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取依折麥布對(duì)照品10.0 mg,置于100 mL量瓶中,加入甲醇溶解并稀釋定容,搖勻,得依折麥布對(duì)照品儲(chǔ)備液(含依折麥布為100 mg·L-1)。將上述對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成依折麥布質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 mg·L-1,得系列質(zhì)量濃度的依折麥布甲醇對(duì)照品溶液。取空白大鼠血漿150 μL,置于尖底離心管中,精密加入上述系列質(zhì)量濃度的依折麥布甲醇對(duì)照品溶液10 μL,配制成含有依折麥布質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg·L-1的血漿樣品,渦旋混合5 min,再按照2.5.2項(xiàng)下血漿處理方法操作,按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)藥物含量,以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、藥物質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸,得方程:A=63.564C-1.316(r=0.999 2),線性關(guān)系良好。

    2.5.4精密度及提取回收率 按照2.5.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線方法,取150 μL空白大鼠血漿,置于尖底離心管中,精密加入10 μL系列質(zhì)量濃度的依折麥布甲醇對(duì)照品溶液,配制成含有依折麥布質(zhì)量濃度分別為0.05、0.5、5.0 mg·L-1的溶液,渦旋混合5 min,再按照2.5.2項(xiàng)下血漿處理方法操作,按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)藥物含量,考察方法精密度和提取回收率。結(jié)果顯示,上述低、中和高3種藥物質(zhì)量濃度的提取回收率分別為92.1%、95.2%、97.2%,精密度RSD值為3.9%,說(shuō)明本方法提取回收率較高,精密度較好,符合方法要求。

    2.5.5藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 取18只體質(zhì)量為180~220 g的Wistar大鼠,雌雄各半,隨機(jī)分為A、B和C 3組,每組6只,實(shí)驗(yàn)前將大鼠禁食12 h,自由飲水。A組大鼠灌胃給予EZE混懸液(藥物分散到PVP K30溶液中),B組大鼠灌胃給予EZE-SLNs,C組大鼠灌胃給予TPGS-EZE-SLNs,給藥劑量均為5 mg·kg-1,在給藥后0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h時(shí)間點(diǎn)采用毛細(xì)管眼眶取血,每次收集約0.5 mL血樣,置于內(nèi)壁涂有肝素鈉的尖底離心管中,以4 000 r·min- 1離心10 min,取上層血漿于-20 ℃冷凍保存。血漿樣品按照2.5.2項(xiàng)下血漿處理方法操作,按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)藥物含量,使用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)分析軟件計(jì)算以下藥動(dòng)學(xué)參數(shù):達(dá)峰時(shí)間(tmax)、達(dá)峰質(zhì)量濃度(Cmax)、藥時(shí)曲線下面積(AUC0~∞)、半衰期(t1/2)和消除速率(CL),并采用t檢驗(yàn)分析不同給藥組之間的差異性,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表2 大鼠藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

    圖5 平均血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線

    3 討論

    為了增加藥物溶解度以及提高生物利用度,研究人員嘗試將依折麥布制備成固體分散體[13]、介孔二氧化硅載藥[14]和自乳化釋藥系統(tǒng)[15-16]等新型給藥系統(tǒng)。固體脂質(zhì)納米粒是20世紀(jì)90年代開(kāi)始研究的較為成熟的一種納米藥物給藥系統(tǒng),是由生物相容性良好的天然或合成脂質(zhì)和表面活性劑構(gòu)成,藥物包裹在納米粒的脂質(zhì)內(nèi)部或吸附在納米粒表面,SLNs屬于納米膠態(tài)分散體系,粒徑在50~1 000 nm之間,能夠顯著提高藥物的溶解度和溶出速率,是極具開(kāi)發(fā)潛力的納米粒給藥系統(tǒng)[17-18]。TPGS屬于非離子表面活性劑,文獻(xiàn)報(bào)道[19-20],TPGS能夠抑制P-gp對(duì)底物的外排作用,改變生物膜的流動(dòng)性,提高藥物的生物利用度,作為一種安全的藥用輔料已被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于藥品中。

    由大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果可知,與EZE混懸劑組相比,EZE-SLNs組和TPGS-EZE-SLNs組的AUC0~∞顯著增加,分別是EZE混懸劑組的1.76倍和2.08倍,說(shuō)明大鼠口服EZE-SLNs和TPGS-EZE-SLNs可以顯著提高藥物的生物利用度;EZE-SLNs組和TPGS-EZE-SLNs組的Cmax分別是EZE混懸劑組的1.44倍和1.81倍,2種固體脂質(zhì)納米粒均提高了藥物的Cmax,這可歸因于依折麥布制備成固體脂質(zhì)納米粒后,粒徑急劇減小,比表面積急劇增大,改善了藥物的溶解性,在進(jìn)入體內(nèi)后能夠快速、充分地被十二指腸及小腸上皮細(xì)胞吸收。此外,TPGS-EZE-SLNs組的AUC0~∞與Cmax分別是EZE-SLNs組的1.19倍和1.26倍,說(shuō)明TPGS-EZE-SLNs提高藥物生物利用度更顯著,這歸因于TPGS-EZE-SLNs處方中的TPGS抑制了腸上皮細(xì)胞膜中的P-gp的活性,降低了對(duì)依折麥布的外排作用,提高了藥物的生物利用度。

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