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    Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化穿心蓮內(nèi)酯自微乳的工藝

    2021-09-10 08:09:26龍凱花王春柳孫婷婷宗時宇
    西北藥學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:穿心蓮油相面法

    龍凱花,王春柳,李 曄*,張 紅,劉 洋,孫婷婷,宗時宇

    (1.西安培華學(xué)院,西安 710125;2.陜西省中醫(yī)藥研究院, 西安 710003)

    穿心蓮內(nèi)酯為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮(Andrographispaniculata)全草或葉中的主要藥效成分之一,具有清熱解毒和消炎止痛的作用[1-2],臨床主治急性痢疾、胃腸炎、上呼吸道感染和感冒發(fā)燒等[3],但由于穿心蓮內(nèi)酯味極苦,難溶于水,口服生物利用度低,臨床應(yīng)用受到限制[4]。前期通過穿心蓮內(nèi)酯油水分布系數(shù)(P)和溶解度實(shí)驗(yàn)[5],測得其P值為(35.64±0.30),lgP為1.55,當(dāng)-1.0

    1 儀器與試藥

    1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);Sartorius BP211D 型電子分析天平(十萬分之一,德國賽多利斯天平有限公司);HJ-6型多頭磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司);ZEN3600型激光粒度儀(英國Marloven公司);TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);FOEA26810D型超純水系統(tǒng)(法國Millipore公司);KQ-250DE型超聲波清洗器(200 W,40 KHz;昆山市超聲儀器有限公司)。

    1.2試藥 穿心蓮內(nèi)酯原料藥(西安天一生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%,批號 TYM140216);穿心蓮內(nèi)酯對照品(中國食品藥品檢定研究院,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.7%,批號110797-201108);油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M 1944 CS,批號201006)和二乙二醇單乙基醚(TranscutoL HP,批號145177),均購自法國嘉法獅公司;聚乙二醇硬脂酸酯(Kolliphor?HS 15,德國巴斯夫公司,批號29749816K0);水為超純水。

    2 方法與結(jié)果

    2.1穿心蓮內(nèi)酯自微乳的制備 精密稱定穿心蓮內(nèi)酯原料藥、乳化劑、助乳化劑、油相,分別混合乳化劑和助乳化劑、油相和穿心蓮內(nèi)酯,置于37 ℃水浴中,將含藥的油相緩慢加入混勻的混合乳化劑中,中速磁力攪拌10 min至澄清透明,即得穿心蓮內(nèi)酯自微乳(空白自微乳處方中除了不加穿心蓮內(nèi)酯外,其余步驟不變)。

    2.2處方的初步篩選

    2.2.1基質(zhì)種類的篩選 按照2.1項下空白自微乳的制備方法,將不同比例配伍的乳化劑及助乳化劑混合,滴入不同油相,根據(jù)外觀及滴入水中的現(xiàn)象,確定聚乙二醇硬脂酸酯為乳化劑,二乙二醇單乙基醚為助乳化劑,油酸聚乙二醇甘油酯為油相。其余滴入水中均出現(xiàn)乳白色溶液,無法形成穩(wěn)定的自微乳體系。

    2.2.2基質(zhì)用量范圍的篩選 將乳化劑聚乙二醇硬脂酸酯與助乳化劑二乙二醇單乙基醚振蕩混勻,兩者質(zhì)量比(Km)為3∶2、2∶1、1∶1、1∶2、2∶3,混勻后分別與油相油酸聚乙二醇甘油酯按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例振蕩混勻,滴水觀察。以Km、水和油相分別為一角,繪制偽三元相圖。見圖1。通過觀察是否澄清透明及加入水后是否形成淡藍(lán)色乳光確定微乳區(qū)界限,形成自微乳區(qū)域。

    由圖1可知,Km在1∶2、2∶3的范圍變化時,無法形成澄清透明淡藍(lán)色乳光的自微乳溶液,緩慢加水后均形成帶淡藍(lán)色乳光的半渾濁溶液;Km在1∶1、3∶2、2∶1范圍變化時,可以形成澄清透明淡藍(lán)色乳光的自微乳溶液,且Km在3∶2、2∶1時形成的自微乳大于Km在1∶1時形成的自微乳區(qū)域。

    圖1 不同處方比例的偽三元相圖

    2.3考察指標(biāo) 經(jīng)單因素考察,對粒徑、Zeta電位、多分散性指數(shù)(PDI)和飽和載藥量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同水平時,Zeta電位差異較小,粒徑、PDI、飽和載藥量各水平之間差異較顯著。故選擇粒徑、PDI、飽和載藥量為Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方的考察指標(biāo)。

    2.3.1粒徑(Y1)與PDI(Y2)的測定 取2.1項下制備的穿心蓮內(nèi)酯自微乳適量,用50倍量的純水稀釋,攪拌分散均勻,采用激光粒度儀分別測定粒徑與PDI。

    2.3.2飽和載藥量(Y3) 取2.1項下制備的穿心蓮內(nèi)酯自微乳適量,加入過量穿心蓮內(nèi)酯原料藥,密封超聲30 min后在37 ℃水浴中振蕩24 h,以4 000 r·min-1離心15 min,取上清液并稀釋,用高效液相色譜(HPLC)法測定穿心蓮內(nèi)酯的含量,即飽和載藥量。

    2.4Box-Behnken優(yōu)化自微乳處方

    2.4.1Box-Behnken 以乳化劑聚乙二醇硬脂酸酯的含量(A)、助乳化劑二乙二醇單乙基醚的含量(B)和油相聚乙二醇甘油酯的含量(C)為自變量,各因素設(shè)置三水平,用-1、0、+1表示,因素及水平見表1;以粒徑(Y1)、PDI(Y2)、飽和載藥量(Y3)為考察指標(biāo),采用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行三因素、三水平設(shè)計, 每個水平平行測定3次,求平均值,實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表2。

    表1 因素與水平

    表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

    2.4.2模型擬合 采用Design-Expert 8.06,以粒徑、PDI、飽和載藥量3個評價指標(biāo),對乳化劑、助乳化劑和油相3個因素進(jìn)行二項式擬合,方程擬合為:

    Y1=20.92-0.48A-0.72B+1.79C+0.60AB-0.083AC+2.97BC-3.59A2+3.08B2+2.60C2(P=0.004 4,r1=0.919 3)

    Y2=0.16+0.058A+0.033B-0.019C+0.10AB+0.021AC+9.97×10-3BC-0.015A2+0.035B2-0.029C2(P<0.000 1,r2=0.982 4)

    Y3=15.19-1.82A-0.43B+0.084C-0.42AB+1.69AC-0.42BC-1.36A2+0.79B2-0.58C2(P=0.001 2,r3=0.945 2)

    由上述結(jié)果可知,評價指標(biāo)Y1、Y2、Y3的r值均大于0.90,顯著水平P值均小于0.01,說明擬合良好,差異具有高度顯著統(tǒng)計學(xué)意義[19]。對該模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

    由表3可知,所建模型經(jīng)檢驗(yàn)具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),說明模型與實(shí)際情況吻合良好;模型失擬項檢驗(yàn)無顯著性(P=0.653 9),說明未知因素對模型擬合結(jié)果干擾小,模型誤差較小[20]。

    表3 方差分析結(jié)果

    2.4.3效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 采用Design-Expert 8.06軟件繪制三維效應(yīng)面圖,見圖2。各處方乳化后粒徑均小于40 nm,且處方加水后均能形成澄清透明、淡藍(lán)色乳光的溶液,說明各處方乳化劑、助乳化劑和油相的選擇種類合適,比例適當(dāng)。

    由圖2可知,隨著Km值的增大,粒徑先增大后減小,PDI增大,飽和載藥量減小,由此可知,Km值是影響自微乳的重要因素。自微乳處方優(yōu)化的原則是粒徑小(穩(wěn)定性高且容易吸收)、PDI小(粒徑均一)、飽和載藥量大,結(jié)合圖1Km值在1∶1、3∶2、2∶1范圍變化時,可以形成澄清透明、淡藍(lán)色乳光的自微乳溶液,綜合考慮Km值確定為1∶1,通過Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行分析,最終得出的最優(yōu)處方為:乳化劑聚乙二醇硬脂酸酯與助乳化劑二乙二醇單乙基醚Km為1∶1,乳化劑和助乳化劑總量與油相聚乙二醇甘油酯的比例為9∶1。

    圖2 3個因素對粒徑、PDI、飽和載藥量的三維效應(yīng)面影響

    2.4.4處方預(yù)測及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最優(yōu)處方比例,按照2.1項下方法制備3批樣品,觀察外觀并將實(shí)測值與預(yù)測值進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見表4。測定制備的自微乳溶液Zeta電位,考察是否穩(wěn)定。見圖3。

    圖3 自微乳的粒徑分布、PDI和電位

    表4 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方再驗(yàn)證

    觀察3批自微乳外觀,均呈澄清透明、淡藍(lán)色乳光的溶液。通過比較實(shí)測值與預(yù)測值,粒徑、PDI和飽和載藥量的偏差小于7.0%,說明建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測效果良好,測得自微乳粒徑為39.04 nm,PDI為0.15,Zeta電位為-29.80 mV,說明穩(wěn)定性好。

    2.5自微乳制備工藝考察

    2.5.1混合方法選擇 分別對3種常用的混合方法:渦旋振蕩、超聲混合、磁力攪拌進(jìn)行考察,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)超聲混合時間較長且不宜混勻;渦旋振蕩時間較短但適合制備少量樣品;而磁力攪拌可以滿足大量樣品制備的要求,混合充分且時間短。

    2.5.2攪拌速度考察 取優(yōu)化的穿心蓮內(nèi)酯自微乳溶液適量,37 ℃下以低速、中速和快速分別磁力攪拌10 min,測定乳化時間,低速、中速、快速攪拌自乳化時間分別為(78±8)、(59±5)、(47±4) s。雖然乳化時間越短越好,但是通過測定3種速度制備的自微乳粒徑,發(fā)現(xiàn)快速攪拌制備的自微乳粒徑不均一,因此選擇中速攪拌。

    2.5.3攪拌時間考察 取優(yōu)化的穿心蓮內(nèi)酯自微乳溶液適量,37 ℃下中速磁力攪拌10、20、30 min,測定粒徑大小分別為(38.58±0.73)、(36.25±0.21)、(38.01±1.45) nm。時間大于10 min時,粒徑大小變化較小,10 min時粒徑大小均一且較小,故確定攪拌時間為10 min最佳。

    綜上所述,最終確定的自微乳制備工藝為:按處方比例稱取穿心蓮內(nèi)酯、油相、乳化劑和助乳化劑,在(37±1) ℃下,將含藥的油相緩慢加入混勻的混合乳化劑中,中速磁力攪拌10 min至澄清透明,即得澄清透明的穿心蓮內(nèi)酯自微乳。

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)通過偽三元相圖確定能形成自微乳的乳化劑和助乳化劑比例,在5個比例中,Km在1∶2、2∶3范圍變化時,緩慢加水后形成淡藍(lán)色乳光的半渾濁溶液;Km在1∶1、3∶2、2∶1范圍變化時,緩慢加水后可形成淡藍(lán)色乳光的澄清透明溶液,且Km越大,形成的自微乳區(qū)域越大,為Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化自微乳處方提供乳化劑與助乳化劑的比例范圍。

    由圖2可知,當(dāng)乳化劑用量不變時,隨著油相用量的增大,粒徑增大,飽和載藥量增大;當(dāng)助乳化劑用量不變時,隨著油相用量的增大,粒徑增大,飽和載藥量先增大后減小(但變化趨勢不明顯)。由此可知,油相的用量對粒徑及飽和載藥量的影響較大,油相用量減小有助于減小粒徑,但可能會引起飽和載藥量的降低,所以通過Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化穿心蓮內(nèi)酯自微乳處方,根據(jù)該方法建立的數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面圖,充分考慮了乳化劑、助乳化劑、油相三因素之間的交互作用,從而方便、直觀、科學(xué)地確定最佳處方為:聚乙二醇硬脂酸酯為乳化劑,二乙二醇單乙基醚為助乳化劑,油酸聚乙二醇甘油酯為油相,Km為1∶1,乳化劑和助乳化劑總量與油相的比例為9∶1,穿心蓮內(nèi)酯15.87 mg。通過驗(yàn)證,預(yù)測性良好。

    在Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方再驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,PDI的偏差比較大,為6.25%,是因?yàn)镻DI本身較小,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一般小于0.4,所以容易在實(shí)驗(yàn)或驗(yàn)證處方的過程中出現(xiàn)偏差,可以考慮在后續(xù)的自微乳處方篩選中舍棄該指標(biāo),以實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)的目標(biāo)。

    綜合偽三元相圖法、Box-Behnken效應(yīng)面法及制備工藝考察,最終確定了穿心蓮內(nèi)酯自微乳的制備方法,通過平行樣品的外觀、粒徑、Zeta電位和PDI等考察,表明制備方法穩(wěn)定、可靠、便捷,但其體內(nèi)釋藥行為有待進(jìn)一步研究。

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