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    響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論優(yōu)化紫姜總黃酮的提取工藝

    2021-09-10 08:09:20韓福國(guó)郝艷麗范雪梅趙重博劉清飛
    西北藥學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:優(yōu)化

    李 格,張 靜,韓福國(guó),郝艷麗,范雪梅,趙重博,劉清飛*

    (1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),咸陽 712046;2.清華大學(xué)藥學(xué)院,北京 100084)

    紫姜為多年生姜科植物小花山柰(Kaempferiaparviflora)的根莖,主產(chǎn)于泰國(guó)北部和東北部、老撾、東南亞一帶,又稱泰國(guó)人參,因其呈深紫色至黑色,故又稱為黑姜[1]。紫姜具有悠久的應(yīng)用歷史,主治炎癥、潰瘍、痛風(fēng)、變態(tài)反應(yīng)、胃腸功能紊亂等多種疾病[2]。現(xiàn)代藥理研究表明,紫姜的藥理作用主要包括抗炎、抗癌、抗變態(tài)反應(yīng)、抗菌和抗高血壓等,這與其所含活性成分甲氧基黃酮類成分有關(guān)[3-4],但關(guān)于紫姜中黃酮類成分的提取工藝未見相關(guān)報(bào)道。

    為了進(jìn)一步對(duì)紫姜中黃酮類成分進(jìn)行深入研究,有效開發(fā)利用紫姜資源,本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論,進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià),對(duì)紫姜黃酮類成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。其優(yōu)點(diǎn)在于響應(yīng)面法可連續(xù)對(duì)實(shí)驗(yàn)各因素水平進(jìn)行分析,能夠?qū)⒏饕蛩鼐哂写硇缘臈l件進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn),回歸擬合各因素與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系并進(jìn)行分析,給出三維立體曲面圖[5-6],更直觀地觀察出優(yōu)化區(qū)域,選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的優(yōu)化條件[7]。信息熵理論作為一種客觀評(píng)價(jià)提取工藝的新方法,將多項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)綜合成單一的度量指標(biāo),對(duì)多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),從而確定最佳工藝參數(shù)[8]。

    1 儀器與試藥

    1.1儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RT-12SF型粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);MS104S型分析天平(寧波新芝生物科技股份有限公司);LD5-2B型離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司);Milli-Q型超純水儀(美國(guó)Milipore公司)。

    1.2試藥 紫姜藥材購(gòu)于廣西楷泰生物科技有限公司(批號(hào)201805),經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳曦研究員鑒定為姜科植物小花山柰(Kaempferiaparviflora)的干燥根莖。對(duì)照品:3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮(批號(hào)A13O11W127279,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%);3,5,7-三甲氧基黃酮(批號(hào)Y06N11W130397,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%);3,5,7,4′-四甲氧基黃酮(批號(hào)Y16O11W127642,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。5,7,4′-三甲氧基黃酮對(duì)照品(批號(hào)C116685430,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),上海麥克林生化科技有限公司;5,7-二甲氧基黃酮對(duì)照品(批號(hào)201512,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%),上海一基實(shí)業(yè)有限公司;3,5,7,3′,4′-五甲氧基黃酮對(duì)照品(批號(hào)DL019201,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),北京盈澤納新化工技術(shù)研究院與北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司聯(lián)合研制;乙腈(色譜純),Sigma-Aldrich公司;甲酸(色譜純),北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司?;瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

    圖1 紫姜中6種黃酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

    2 方法與結(jié)果

    2.1HPLC法測(cè)定6種黃酮類成分含量

    2.1.1色譜條件 Lichrospher RP-18 endcapped色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動(dòng)相:0.5 mL·L-1甲酸(A)-0.5 mL·L-1甲酸乙腈(B),梯度洗脫(0~10 min,38%B;10~20 min,38%B~40%B;20~35 min,40%B;35~50 min,40%B~44%B;50~55 min,44%B~38%B;55~60 min,38%B)。流速:0.8 mL·min-1;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):350 nm,進(jìn)樣量:10 μL。色譜圖見圖2。

    圖2 HPLC圖

    2.1.2混合對(duì)照溶液的制備 精密稱取6種成分的對(duì)照品適量,置于10 mL量瓶中,加乙醇溶解并定容,制成質(zhì)量濃度分別為102.00、296.25、213.00、262.50、102.50、86.80 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液,混勻后置于4 ℃冰箱中冷藏,備用。

    2.1.3供試品溶液的制備 取紫姜干燥藥材,粉碎,過4號(hào)篩,精密稱定藥材粉末1 g,置于具塞錐形瓶中,按照液料比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇,超聲提取2次,以3 500 r·min-1離心10 min,合并上清液,上清液即為供試品溶液,4 ℃冷藏保存。取供試品溶液適量,置于2 mL EP管中稀釋一定倍數(shù),用0.45 μm微孔濾膜過濾,進(jìn)樣分析。

    2.1.4線性關(guān)系考察 精密稱取6種對(duì)照品適量,加乙醇制成質(zhì)量濃度分別為200.0、592.5、426.0、523.0、205.0、108.5 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液,用乙醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析,記錄峰面積值。將所得峰面積(y)與各對(duì)照品質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

    表1 甲氧基黃酮類成分的回歸方程及線性范圍

    2.1.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.1.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄各組分峰面積。計(jì)算6種成分峰面積RSD值依次為0.69%、0.68%、0.50%、0.71%、0.78%、0.87%,表明儀器精密度良好。

    2.1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批供試品溶液,分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。計(jì)算6種成分峰面積RSD值分別為0.36%、0.15%、0.27%、0.72%、0.27%、0.13%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.1.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取紫姜藥材粉末,按照2.1.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,并按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣6次。計(jì)算6種成分峰面積RSD值分別為0.35%、0.45%、0.34%、0.44%、0.79%、0.15%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.1.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取含量已知的紫姜粉末6份,每份1 g,按照2.1.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,精密加入等量的對(duì)照品,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣3次。計(jì)算6種成分的平均回收率依次為101.17%、100.98%、107.54%、101.50%、104.81%、101.34%。RSD值分別為0.03%、0.03%、0.00%、0.02%、0.01%、0.01%,表明該方法回收率高,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

    2.2甲氧基黃酮類成分超聲提取工藝單因素考察 為了優(yōu)化紫姜中6種主要甲氧基黃酮類成分超聲提取工藝,分別對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間進(jìn)行單因素考察,按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

    2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 固定液料比為25∶1,超聲時(shí)間為50 min,設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。以各成分的含量對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)作圖,見圖3A。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,各成分含量趨勢(shì)基本一致,乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%~50%時(shí),各成分含量呈上升趨勢(shì),乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%~90%時(shí),各成分含量趨平。故選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%~60%進(jìn)行優(yōu)化考察。

    2.2.2液料比考察 固定超聲時(shí)間為50 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,設(shè)置液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1,各成分的含量對(duì)液料比作圖,見圖3B。由圖3B可知,隨著液料比的增大,各成分含量趨勢(shì)基本一致。當(dāng)液料比在5∶1~10∶1時(shí),各成分含量呈上升趨勢(shì),當(dāng)液料比在10∶1~40∶1時(shí),各成分含量幾乎未變。故選取液料比在5∶1~15∶1范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化考察。

    2.2.3超聲時(shí)間考察 固定液料比為10∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,設(shè)置超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60、70、80、90 min,各成分的藥材百分含量對(duì)超聲時(shí)間作圖,見圖3C。由圖3C可知,當(dāng)超聲時(shí)間在20~30 min時(shí),只有3種成分含量有明顯的增加,當(dāng)超聲時(shí)間在30~90 min時(shí),只有1種成分在70 min時(shí)含量有明顯的增加,其他化合物的含量幾乎不變。出于實(shí)際生產(chǎn)考慮,選擇超聲時(shí)間在30 min較為合適,故選取超聲20~40 min進(jìn)行優(yōu)化考察。

    圖3 不同因素對(duì)提取效果的影響

    2.3響應(yīng)面法優(yōu)化紫姜中甲氧基黃酮類成分 參考有關(guān)中藥中總黃酮的提取工藝[9-14],結(jié)合單因素考察結(jié)果,設(shè)定各因素最佳取值范圍,采用響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論對(duì)該工藝進(jìn)一步優(yōu)化。

    2.3.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)響應(yīng)面組合實(shí)驗(yàn)原理,以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)和超聲時(shí)間(C)為考察因素,以6種甲氧基黃酮類成分在的含量計(jì)算所得綜合評(píng)分(M)為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用三因素三水平響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素與水平見表2,方案與結(jié)果見表3。由于提取次數(shù)不是連續(xù)變量因素[14],故將其設(shè)置為2次。

    表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

    2.3.2M值的計(jì)算 以紫姜中6種主要的甲氧基黃酮類成分的含量為指標(biāo),采用信息熵法[15],計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)和M值,建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣(Xij)mn,對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,建立概率矩陣(Pij)mn,將原始評(píng)價(jià)矩陣轉(zhuǎn)為“概率矩陣”。

    計(jì)算每項(xiàng)指標(biāo)的信息熵,得到評(píng)價(jià)指標(biāo)的信息熵Hi={0.999 8、0.997 3、0.998 2、0.998 3、0.997 9、0.998 0};計(jì)算第i項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)Wi={0.019 0、0.257 1、0.171 4、0.161 9、0.200 0、0.190 5};計(jì)算M值。

    (Mi為6種成分含量,Mimax為各成分的最高含量,Wi為各成分權(quán)重系數(shù))。結(jié)果見表3。由表3可知M值在0.670~0.987之間。

    2.3.3模型擬合與方差分析 通過Design-Expert 10.0.7軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以M作為響應(yīng)值,得到乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)和超聲時(shí)間(C)的二項(xiàng)式回歸擬合方程。

    M=0.96+0.06A+0.089B-0.012C-0.016AB-9.325×10-3AC-8.45×10-3BC-0.013A2-0.1B2-0.019C2

    方差分析結(jié)果見表4。由表4可知,模型F值為62.19,整體模型的顯著水平為P<0.000 1,表示此回歸模型極顯著,說明各指標(biāo)和M值的關(guān)系可以運(yùn)用此模型來函數(shù)化;失擬項(xiàng)F=6.85,P=0.047 0<0.05,可用該方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析,同時(shí)從軟件分析數(shù)值可以得到模型的R2為0.987 6,Radj2為0.971 8,說明回歸方程的擬合度良好;差異系數(shù)為1.79,實(shí)驗(yàn)精確度良好,以上數(shù)據(jù)表明,該模型可以很好地被用來預(yù)測(cè)紫姜中主要黃酮類成分的提取工藝的優(yōu)化。因素A、B、B2以及C2對(duì)M值的影響極為顯著(P<0.000 1),而因素C、A2以及交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)M值影響無顯著差異(P>0.05)。

    2.3.4兩兩因素交互作用分析 利用Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到兩兩因素的交互作用對(duì)M值影響的響應(yīng)面圖與等高線圖,結(jié)果見圖4。利用響應(yīng)面圖可以對(duì)影響M值的任意2個(gè)因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià),曲面陡峭呈鐘罩形即表示交互作用顯著,曲面平滑則相反,等高線圖的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓表示兩因素交互作用顯著,圓形則相反。

    圖4 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

    由圖4可知,固定乙醇體積分?jǐn)?shù),隨著液料比的增加,M值呈先升后降的趨勢(shì),在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%~60%、液料比為11∶1~15∶1時(shí),M值最高。固定液料比,M值隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈增高趨勢(shì),而提取時(shí)間對(duì)M值的影響并不明顯,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%~60%、提取時(shí)間為20~25 min時(shí),M值最高。由相應(yīng)的等高線圖可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)所呈現(xiàn)的等高線分布較為密集,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)M值的影響較提取時(shí)間大,根據(jù)等高線的橢圓規(guī)則來判斷乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間有較為顯著的交互作用,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)不變時(shí),提取時(shí)間的增加對(duì)M值大小的影響并不明顯,可能原因是部分甲氧基黃酮類化合物在超聲過程中結(jié)構(gòu)受到了破壞或發(fā)生轉(zhuǎn)變,故提取時(shí)間不宜過長(zhǎng)。固定提取時(shí)間,隨著液料比的增加,M值呈先升后降的趨勢(shì),在液料比為11∶1~15∶1、提取時(shí)間為20~25 min時(shí),M值最高。通過模擬分析優(yōu)化工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,液料比為11.93∶1,提取2次,每次23.41 min,預(yù)測(cè)M值為1.024,考慮到生產(chǎn)實(shí)際操作,最終將其確定為乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,液料比為12∶1,提取2次,每次25 min。

    2.3.5優(yōu)化工藝驗(yàn)證 精密稱取3份藥材,每份1.0 g,按照2.3.4項(xiàng)下優(yōu)化工藝提取,其驗(yàn)證結(jié)果M值為0.994,RSD值為0.34%,在此條件下,6種成分的提取率分別為0.09%、0.71%、2.89%、1.22%、0.40%、0.49%,總提取率為5.80%,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)M值與模型預(yù)測(cè)值高度接近,表明模型準(zhǔn)確可信,可用此方法提取紫姜中6種甲氧基黃酮類成分。

    3 討論

    黃酮類化合物是一大類天然有機(jī)產(chǎn)物,廣泛存在于植物中,是許多中草藥的有效成分之一,具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎鎮(zhèn)痛、抗衰老[16]等多種生物活性,是國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[17]。甲氧基黃酮類化合物是紫姜的主要成分[18-19],脂溶性較好,易吸收,含有多個(gè)甲氧基獨(dú)特結(jié)構(gòu),在抗癌活性的篩選過程中較其他黃酮顯現(xiàn)出更強(qiáng)的抗癌活性[20]。為了更好地開發(fā)利用紫姜資源,有必要對(duì)紫姜中甲氧基黃酮進(jìn)行更加深入、系統(tǒng)地研究。

    文中運(yùn)用響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論對(duì)紫姜中的主要成分進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。響應(yīng)面法通過擬合二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)方程構(gòu)建響應(yīng)曲面,用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)對(duì)其交互作用進(jìn)行全面的分析[21],通過對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲時(shí)間的多元回歸及二項(xiàng)擬合建立M值與各因素的回歸方程,計(jì)算紫姜中各指標(biāo)的含量變化規(guī)律。但對(duì)于多變量的研究,單純的運(yùn)用響應(yīng)面法并不能精確地構(gòu)造用于確定性分析的近似多項(xiàng)式。因此,本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合運(yùn)用信息熵理論,分析各因素的交互作用,更加客觀、清楚地反映出各成分在不同提取條件下的變化規(guī)律,篩選出優(yōu)化工藝,提高了實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明篩選出的優(yōu)化工藝能有效提高紫姜中甲氧基黃酮類成分的提取率,為紫姜的進(jìn)一步研究開發(fā)提供參考。

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