響應面法結合信息熵理論優(yōu)化紫姜總黃酮的提取工藝

李 格，張 靜，韓福國，郝艷麗，范雪梅，趙重博，劉清飛*

(1.陜西中醫(yī)藥大學，咸陽 712046；2.清華大學藥學院，北京 100084)

紫姜為多年生姜科植物小花山柰(Kaempferiaparviflora)的根莖，主產(chǎn)于泰國北部和東北部、老撾、東南亞一帶，又稱泰國人參，因其呈深紫色至黑色，故又稱為黑姜[1]。紫姜具有悠久的應用歷史，主治炎癥、潰瘍、痛風、變態(tài)反應、胃腸功能紊亂等多種疾病[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，紫姜的藥理作用主要包括抗炎、抗癌、抗變態(tài)反應、抗菌和抗高血壓等，這與其所含活性成分甲氧基黃酮類成分有關[3-4]，但關于紫姜中黃酮類成分的提取工藝未見相關報道。

為了進一步對紫姜中黃酮類成分進行深入研究，有效開發(fā)利用紫姜資源，本實驗采用響應面法結合信息熵理論，進行多指標綜合評價，對紫姜黃酮類成分的提取工藝進行優(yōu)化。其優(yōu)點在于響應面法可連續(xù)對實驗各因素水平進行分析，能夠?qū)⒏饕蛩鼐哂写硇缘臈l件進行組合實驗，回歸擬合各因素與響應值的函數(shù)關系并進行分析，給出三維立體曲面圖[5-6]，更直觀地觀察出優(yōu)化區(qū)域，選擇實驗設計中的優(yōu)化條件[7]。信息熵理論作為一種客觀評價提取工藝的新方法，將多項評價指標綜合成單一的度量指標，對多指標進行綜合評價，從而確定最佳工藝參數(shù)[8]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RT-12SF型粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；MS104S型分析天平(寧波新芝生物科技股份有限公司)；LD5-2B型離心機(北京京立離心機有限公司)；Milli-Q型超純水儀(美國Milipore公司)。

1.2試藥 紫姜藥材購于廣西楷泰生物科技有限公司(批號201805)，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所陳曦研究員鑒定為姜科植物小花山柰(Kaempferiaparviflora)的干燥根莖。對照品：3′，4′，5，7-四甲氧基黃酮(批號A13O11W127279，質(zhì)量分數(shù)為95%)；3，5，7-三甲氧基黃酮(批號Y06N11W130397，質(zhì)量分數(shù)為98%)；3，5，7，4′-四甲氧基黃酮(批號Y16O11W127642，質(zhì)量分數(shù)為98%)，均購自上海源葉生物科技有限公司。5，7，4′-三甲氧基黃酮對照品(批號C116685430，質(zhì)量分數(shù)為98%)，上海麥克林生化科技有限公司；5，7-二甲氧基黃酮對照品(批號201512，質(zhì)量分數(shù)為95%)，上海一基實業(yè)有限公司；3，5，7，3′，4′-五甲氧基黃酮對照品(批號DL019201，質(zhì)量分數(shù)為98%)，北京盈澤納新化工技術研究院與北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司聯(lián)合研制；乙腈(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；甲酸(色譜純)，北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司?；瘜W結構式見圖1。

圖1 紫姜中6種黃酮類成分的化學結構式

2 方法與結果

2.1HPLC法測定6種黃酮類成分含量

2.1.1色譜條件 Lichrospher RP-18 endcapped色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：0.5 mL·L-1甲酸(A)-0.5 mL·L-1甲酸乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，38%B；10～20 min，38%B～40%B；20～35 min，40%B；35～50 min，40%B～44%B；50～55 min，44%B～38%B；55～60 min，38%B)。流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：350 nm，進樣量：10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 HPLC圖

2.1.2混合對照溶液的制備 精密稱取6種成分的對照品適量，置于10 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為102.00、296.25、213.00、262.50、102.50、86.80 μg·mL-1的混合對照品溶液，混勻后置于4 ℃冰箱中冷藏，備用。

2.1.3供試品溶液的制備 取紫姜干燥藥材，粉碎，過4號篩，精密稱定藥材粉末1 g，置于具塞錐形瓶中，按照液料比加入一定體積分數(shù)的乙醇，超聲提取2次，以3 500 r·min-1離心10 min，合并上清液，上清液即為供試品溶液，4 ℃冷藏保存。取供試品溶液適量，置于2 mL EP管中稀釋一定倍數(shù)，用0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣分析。

2.1.4線性關系考察 精密稱取6種對照品適量，加乙醇制成質(zhì)量濃度分別為200.0、592.5、426.0、523.0、205.0、108.5 μg·mL-1的混合對照品溶液，用乙醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液，按照2.1.1項下色譜條件進行檢測分析，記錄峰面積值。將所得峰面積(y)與各對照品質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸。結果見表1。

表1 甲氧基黃酮類成分的回歸方程及線性范圍

2.1.5精密度實驗 精密吸取2.1.2項下制備的混合對照品溶液，按照2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄各組分峰面積。計算6種成分峰面積RSD值依次為0.69%、0.68%、0.50%、0.71%、0.78%、0.87%，表明儀器精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性實驗 精密稱取同一批供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積。計算6種成分峰面積RSD值分別為0.36%、0.15%、0.27%、0.72%、0.27%、0.13%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7重復性實驗 取紫姜藥材粉末，按照2.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液，并按照2.1.1項下色譜條件依次進樣6次。計算6種成分峰面積RSD值分別為0.35%、0.45%、0.34%、0.44%、0.79%、0.15%，表明該方法重復性良好。

2.1.8回收率實驗 精密稱取含量已知的紫姜粉末6份，每份1 g，按照2.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液，精密加入等量的對照品，按照2.1.1項下色譜條件進樣3次。計算6種成分的平均回收率依次為101.17%、100.98%、107.54%、101.50%、104.81%、101.34%。RSD值分別為0.03%、0.03%、0.00%、0.02%、0.01%、0.01%，表明該方法回收率高，結果準確、可靠。

2.2甲氧基黃酮類成分超聲提取工藝單因素考察 為了優(yōu)化紫姜中6種主要甲氧基黃酮類成分超聲提取工藝，分別對乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間進行單因素考察，按照2.1.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項下色譜條件進樣分析。

2.2.1乙醇體積分數(shù)考察 固定液料比為25∶1，超聲時間為50 min，設置乙醇體積分數(shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。以各成分的含量對乙醇體積分數(shù)作圖，見圖3A。隨著乙醇體積分數(shù)的增大，各成分含量趨勢基本一致，乙醇體積分數(shù)在20%～50%時，各成分含量呈上升趨勢，乙醇體積分數(shù)在50%～90%時，各成分含量趨平。故選取乙醇體積分數(shù)為40%～60%進行優(yōu)化考察。

2.2.2液料比考察 固定超聲時間為50 min，乙醇體積分數(shù)為50%，設置液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，各成分的含量對液料比作圖，見圖3B。由圖3B可知，隨著液料比的增大，各成分含量趨勢基本一致。當液料比在5∶1～10∶1時，各成分含量呈上升趨勢，當液料比在10∶1～40∶1時，各成分含量幾乎未變。故選取液料比在5∶1～15∶1范圍內(nèi)進行優(yōu)化考察。

2.2.3超聲時間考察 固定液料比為10∶1、乙醇體積分數(shù)為50%，設置超聲時間分別為20、30、40、50、60、70、80、90 min，各成分的藥材百分含量對超聲時間作圖，見圖3C。由圖3C可知，當超聲時間在20～30 min時，只有3種成分含量有明顯的增加，當超聲時間在30～90 min時，只有1種成分在70 min時含量有明顯的增加，其他化合物的含量幾乎不變。出于實際生產(chǎn)考慮，選擇超聲時間在30 min較為合適，故選取超聲20～40 min進行優(yōu)化考察。

圖3 不同因素對提取效果的影響

2.3響應面法優(yōu)化紫姜中甲氧基黃酮類成分 參考有關中藥中總黃酮的提取工藝[9-14]，結合單因素考察結果，設定各因素最佳取值范圍，采用響應面法結合信息熵理論對該工藝進一步優(yōu)化。

2.3.1響應面實驗設計 根據(jù)響應面組合實驗原理，以乙醇體積分數(shù)(A)、液料比(B)和超聲時間(C)為考察因素，以6種甲氧基黃酮類成分在的含量計算所得綜合評分(M)為評價指標，采用三因素三水平響應面法進行優(yōu)化實驗設計，因素與水平見表2，方案與結果見表3。由于提取次數(shù)不是連續(xù)變量因素[14]，故將其設置為2次。

表2 響應面實驗因素與水平

2.3.2M值的計算 以紫姜中6種主要的甲氧基黃酮類成分的含量為指標，采用信息熵法[15]，計算各指標的權重系數(shù)和M值，建立原始評價指標矩陣(Xij)mn，對表中數(shù)據(jù)進行處理，建立概率矩陣(Pij)mn，將原始評價矩陣轉為“概率矩陣”。

計算每項指標的信息熵，得到評價指標的信息熵Hi={0.999 8、0.997 3、0.998 2、0.998 3、0.997 9、0.998 0}；計算第i項指標的權重系數(shù)Wi={0.019 0、0.257 1、0.171 4、0.161 9、0.200 0、0.190 5}；計算M值。

(Mi為6種成分含量，Mimax為各成分的最高含量，Wi為各成分權重系數(shù))。結果見表3。由表3可知M值在0.670～0.987之間。

2.3.3模型擬合與方差分析 通過Design-Expert 10.0.7軟件分析實驗結果，以M作為響應值，得到乙醇體積分數(shù)(A)、液料比(B)和超聲時間(C)的二項式回歸擬合方程。

M=0.96+0.06A+0.089B-0.012C-0.016AB-9.325×10-3AC-8.45×10-3BC-0.013A2-0.1B2-0.019C2

方差分析結果見表4。由表4可知，模型F值為62.19，整體模型的顯著水平為P<0.000 1，表示此回歸模型極顯著，說明各指標和M值的關系可以運用此模型來函數(shù)化；失擬項F=6.85，P=0.047 0<0.05，可用該方程代替真實實驗進行分析，同時從軟件分析數(shù)值可以得到模型的R2為0.987 6，Radj2為0.971 8，說明回歸方程的擬合度良好；差異系數(shù)為1.79，實驗精確度良好，以上數(shù)據(jù)表明，該模型可以很好地被用來預測紫姜中主要黃酮類成分的提取工藝的優(yōu)化。因素A、B、B2以及C2對M值的影響極為顯著(P<0.000 1)，而因素C、A2以及交互項AB、AC、BC對M值影響無顯著差異(P>0.05)。

2.3.4兩兩因素交互作用分析 利用Design-Expert 10.0.7軟件對表3中數(shù)據(jù)進行擬合，得到兩兩因素的交互作用對M值影響的響應面圖與等高線圖，結果見圖4。利用響應面圖可以對影響M值的任意2個因素的交互效應進行分析與評價，曲面陡峭呈鐘罩形即表示交互作用顯著，曲面平滑則相反，等高線圖的形狀可反映交互效應的強弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，圓形則相反。

圖4 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖和等高線圖

由圖4可知，固定乙醇體積分數(shù)，隨著液料比的增加，M值呈先升后降的趨勢，在乙醇體積分數(shù)為55%～60%、液料比為11∶1～15∶1時，M值最高。固定液料比，M值隨著乙醇體積分數(shù)增加呈增高趨勢，而提取時間對M值的影響并不明顯，當乙醇體積分數(shù)為55%～60%、提取時間為20～25 min時，M值最高。由相應的等高線圖可知，乙醇體積分數(shù)所呈現(xiàn)的等高線分布較為密集，說明乙醇體積分數(shù)對M值的影響較提取時間大，根據(jù)等高線的橢圓規(guī)則來判斷乙醇體積分數(shù)和提取時間有較為顯著的交互作用，當乙醇體積分數(shù)不變時，提取時間的增加對M值大小的影響并不明顯，可能原因是部分甲氧基黃酮類化合物在超聲過程中結構受到了破壞或發(fā)生轉變，故提取時間不宜過長。固定提取時間，隨著液料比的增加，M值呈先升后降的趨勢，在液料比為11∶1～15∶1、提取時間為20～25 min時，M值最高。通過模擬分析優(yōu)化工藝為：乙醇體積分數(shù)為60%，液料比為11.93∶1，提取2次，每次23.41 min，預測M值為1.024，考慮到生產(chǎn)實際操作，最終將其確定為乙醇體積分數(shù)為60%，液料比為12∶1，提取2次，每次25 min。

2.3.5優(yōu)化工藝驗證 精密稱取3份藥材，每份1.0 g，按照2.3.4項下優(yōu)化工藝提取，其驗證結果M值為0.994，RSD值為0.34%，在此條件下，6種成分的提取率分別為0.09%、0.71%、2.89%、1.22%、0.40%、0.49%，總提取率為5.80%，驗證實驗M值與模型預測值高度接近，表明模型準確可信，可用此方法提取紫姜中6種甲氧基黃酮類成分。

3 討論

黃酮類化合物是一大類天然有機產(chǎn)物，廣泛存在于植物中，是許多中草藥的有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎鎮(zhèn)痛、抗衰老[16]等多種生物活性，是國內(nèi)外醫(yī)藥領域研究的熱點[17]。甲氧基黃酮類化合物是紫姜的主要成分[18-19]，脂溶性較好，易吸收，含有多個甲氧基獨特結構，在抗癌活性的篩選過程中較其他黃酮顯現(xiàn)出更強的抗癌活性[20]。為了更好地開發(fā)利用紫姜資源，有必要對紫姜中甲氧基黃酮進行更加深入、系統(tǒng)地研究。

文中運用響應面法結合信息熵理論對紫姜中的主要成分進行提取工藝的優(yōu)化。響應面法通過擬合二次多項數(shù)學方程構建響應曲面，用較少的實驗次數(shù)對其交互作用進行全面的分析[21]，通過對乙醇體積分數(shù)、液料比和超聲時間的多元回歸及二項擬合建立M值與各因素的回歸方程，計算紫姜中各指標的含量變化規(guī)律。但對于多變量的研究，單純的運用響應面法并不能精確地構造用于確定性分析的近似多項式。因此，本實驗聯(lián)合運用信息熵理論，分析各因素的交互作用，更加客觀、清楚地反映出各成分在不同提取條件下的變化規(guī)律，篩選出優(yōu)化工藝，提高了實驗的嚴謹性和科學性，實驗結果進一步表明篩選出的優(yōu)化工藝能有效提高紫姜中甲氧基黃酮類成分的提取率，為紫姜的進一步研究開發(fā)提供參考。