基于生物信息學(xué)篩選和鑒定結(jié)直腸癌 關(guān)鍵的生物標(biāo)志物

張永玲，范文濤

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，咸陽 712046）

結(jié)直腸癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，致死率在惡性腫瘤中居第三位。根據(jù)2018年全美的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：男性和女性的結(jié)直腸癌發(fā)病率在各類腫瘤發(fā)病率中均居于第三位［1］。該疾病多發(fā)生在中年以上的男性，以40～70歲最為常見。隨著人口老齡化以及生活習(xí)慣等因素的影響，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐步上升趨勢(shì)，且越發(fā)年輕化，但其發(fā)病原因仍然不明?，F(xiàn)代臨床早期診斷主要檢測(cè)癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）或糖類抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）、糖類抗原242（carbohydrate antigen242，CA242）、糖類抗原724（carbohydrate antigen724，CA724），其雖可以診斷結(jié)直腸癌，但敏感度不高。越來越多的研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，基因異常和突變的基因參與結(jié)直腸癌的致癌作用和進(jìn)展，如p53基因、原癌基因K-ras突變、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）、同源異型盒D10（homeoboxD10，HOXD10）基因等。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，通過調(diào)節(jié)不同的下游基因，在多種信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用［2］。原癌基因K-ras是表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路的下游分子，是引發(fā)和治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵基因［3］。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，有近50%的結(jié)直腸癌患者其K-ras基因均發(fā)生突變［4］。TLR4是跨膜傳遞信號(hào)的受體，可以識(shí)別病原病參與相關(guān)的免疫應(yīng)答［5］。根據(jù)部分臨床研究發(fā)現(xiàn)，TLR4位于外顯子區(qū)域的1196C＞T及896A＞G兩個(gè)位點(diǎn)的突變最為明顯，其可以改變氨基酸已被編碼的序列［6］。也有研究表明，TLR4基因的多態(tài)性對(duì)炎性因子的合成過程產(chǎn)生影響，進(jìn)而引發(fā)結(jié)直腸癌［7］。郗昌磊等［8］運(yùn)用蛋白免疫印跡法（Western blot，WB）檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中HOXD10的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的HOXD10可以明顯的降低Notch信號(hào)通路Notch1及下游靶基因Hesde的蛋白的表達(dá)，由此得知過表達(dá)的HOXD10可能通過下調(diào)Notch信號(hào)通路進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的發(fā)生。目前已發(fā)現(xiàn)的可用于診療的分子靶點(diǎn)很多，但仍需不斷尋找有效的靶點(diǎn)。結(jié)直腸癌的早期癥狀不明顯，晚期其發(fā)病率和死亡率在消化系統(tǒng)的惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌。因此，開發(fā)有效的診斷和治療方法至關(guān)重要。在近幾十年里，微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)分析日益廣泛用于各類疾病相關(guān)基因的分析層面，也更好地幫助我們識(shí)別差異表達(dá)基因和功能通路參與結(jié)直腸癌的致癌作用和進(jìn)展。然而，通過分析獨(dú)立的微陣列數(shù)據(jù)很難獲得可靠的結(jié)果。因此，在本研究中，從基因表達(dá)（gene expression omnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數(shù)據(jù)庫下載3個(gè)數(shù)據(jù)集，并通過分析獲得結(jié)直腸癌組織和非腫瘤組織之間的差異基因；然后，通過京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析和蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步幫助我們理解致癌分子機(jī)制。綜上方法所述，472個(gè)差異基因和15個(gè)核心基因通過分析被確定為有可能是結(jié)直腸癌候選的生物標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)庫

GEO是一個(gè)公共功能基因組學(xué)高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)庫，包括芯片和微陣列數(shù)據(jù)［9］。我們從GEO數(shù)據(jù)庫篩選了3個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE21510、GSE32323、GSE15781（均來自于GPL570平臺(tái)）。GSE21510數(shù)據(jù)集包含104個(gè)結(jié)直腸癌組織樣本和44個(gè)癌旁樣本；GSE32323包含22個(gè)結(jié)直腸癌樣本和22個(gè)非腫瘤樣本；GSE15781包含25個(gè)結(jié)直腸癌樣本和17個(gè)非腫瘤樣本。

1.2 篩選差異基因

選擇GEO數(shù)據(jù)庫自帶分析工具Analyze with GEO2R進(jìn)行分組，分為癌組織組和正常組織組，點(diǎn)擊TOP250進(jìn)行分析，保存分析數(shù)據(jù)。根據(jù)P＜0.01，｜logFC｜＞1篩選出差異基因。

1.3 繪制韋恩圖

采用韋恩圖制作軟件（venny2.1），將檢索出的差異基因繪制韋恩圖，查找3組共有基因。

1.4 對(duì)共有差異基因進(jìn)行KEGG和GO富集功能分析

DAVID （http://david.ncifcrf.gov）［10］是一個(gè)在線的可視化的生物信息數(shù)據(jù)庫，整合了生物數(shù)據(jù)和分析工具，為用戶提供更加全面的基因和蛋白質(zhì)功能注釋信息，可從中提取生物學(xué)信息。KEGG數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫［11］。基因本體論（gene ontology，GO）是一個(gè)主要的生物信息學(xué)工具，可以注釋基因和分析基因的生物過程［12］。運(yùn)用DAVID在線數(shù)據(jù)庫可以將差異基因的功能和生物分析結(jié)果更好地以可視化的方式呈現(xiàn)。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)蛋白互作分析（篩選核心基因）

PPI網(wǎng)絡(luò)是使用搜索工具（http://string-db.org）來檢索基因相互作用的在線數(shù)據(jù)庫［13］。通過分析功能蛋白之間的相互作用可以為疾病產(chǎn)生的機(jī)制或疾病的發(fā)展提供新的見解。STRING數(shù)據(jù)庫是一個(gè)常用的 PPI數(shù)據(jù)庫，combine score＞0.4被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cytoscape是可視化的分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，為用戶提供了一個(gè)開放的生物信息學(xué)軟件平臺(tái)，內(nèi)含的插件MCODE（molecular complex detection）是一個(gè)應(yīng)用程序集群，其通過基于給定的差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)蛋白互作密集區(qū)域，即核心基因所在區(qū)域［14-15］。選擇的標(biāo)準(zhǔn)如下：MCODE score＞5，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，max depth=100，k-score=2。核心基因的KEGG和GO分析模塊使用DAVID可視化呈現(xiàn)。

1.6 核心基因選擇和功能分析

運(yùn)用Cytoscape中的插件MCODE選擇核心基因。網(wǎng)絡(luò)的基因分析使用cbioportal（http://www.cbioportal.org）在線平臺(tái)［16］。使用Kaplan-Meier曲線（cbioPortal）對(duì)核心基因的總體生存和無病生存進(jìn)行分析。

1.7 核心基因驗(yàn)證

使用數(shù)據(jù)庫Oncomine（http://www.oncomine.com）將正常組織與癌癥組織進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選差異基因

從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選3個(gè)與結(jié)腸癌相關(guān)的數(shù)據(jù)集，通過對(duì)數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)統(tǒng)一處理之后，鑒定出3個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因：GSE21510（148個(gè)樣本）、GSE32323（44個(gè)樣本）、GSE15781（42個(gè)樣本）。其中GSE21510中有4 993個(gè)差異表達(dá)基因，GSE32323中有2 504個(gè)差異表達(dá)基因，GSE15781中有1 096個(gè)差異表達(dá)基因。通過韋恩圖（venny2.1）可見3個(gè)數(shù)據(jù)集包含了472個(gè)重復(fù)基因，其中包括上調(diào)基因212個(gè)，下調(diào)基因260個(gè)（圖1a）。

2.2 對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG和GO富集功能分析

運(yùn)用DAVID在線可視化數(shù)據(jù)庫分析差異基因的功能和富集結(jié)果。利用GO分析，將所有差異基因富集到生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和生物學(xué)功能（molecular functions，MF）3種生物關(guān)系中。分析結(jié)果表明，蛋白在生物學(xué)過程中主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、免疫應(yīng)答、離子傳輸、調(diào)節(jié)細(xì)胞活性、脂質(zhì)的分解過程等（表1）。細(xì)胞學(xué)組分主要集中細(xì)胞外區(qū)域等。生物學(xué)功能主要集中于蛋白結(jié)合、肽酶的活性、細(xì)胞骨架的綁定以及結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，下調(diào)的差異基因主要富集在過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated-receptor，PPAR）信號(hào)通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用以及醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收，而上調(diào)的差異基因主要富集于淀粉和蔗糖代謝TGF-β信號(hào)通路等。

表1 差異基因KEGG和GO富集功能分析Tab. 1 KEGG and GO enrichment function analysis of differential gene

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)蛋白互作分析（篩選核心基因）

使用STRING數(shù)據(jù)庫、Cytoscape在線分析軟件對(duì)差異基因和核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行構(gòu)建（圖1b、1c）。運(yùn)用Cytoscape中的插件MCODE，根據(jù)score排序，選擇出得分最明顯的區(qū)域圖1 c，即核心基因。通過DAVID對(duì)核心基因的功能進(jìn)行分析。GO分析結(jié)果顯示，核心基因在生物學(xué)過程中主要參與蛋白耦合受體蛋白信號(hào)通路和細(xì)胞表面受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，生物學(xué)功能主要集中于趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞和生長(zhǎng)因子活動(dòng)（表2）。KEGG主要富集在趨化因子信號(hào)通路以及受體的互動(dòng)。

表2 核心基因KEGG和GO富集功能分析Tab. 2 Enrichment function analysis of core genes KEGG and GO

圖1 差異基因的韋恩圖、PPI網(wǎng)絡(luò)和核心基因Fig. 1 Venn diagram, PPI network and core gene diagram of differential genes（a）在mRNA表達(dá)譜集GSE21510、GSE32323和GSE15781中選擇倍數(shù)變化＞2且P＜0.01的基因。3個(gè)數(shù)據(jù)集顯示472個(gè)基因的重疊，即472個(gè)差異基因；（b）使用Cytoscape構(gòu)建差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)；（c）從獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出最重要的模塊，即核心基因。 (a) Select genes with fold change＞2 and P value＜0.01 in the mRNA expression profile sets GSE21510, GSE32323 and GSE15781. The 3 data sets show an overlap of 472 genes, that is, 472 differential genes; (b) Use Cytoscape to construct a PPI network of differential genes; (c) Screen out the most important module, the core gene, from the obtained PPI network.

2.4 核心基因選擇和功能分析

總共15個(gè)基因被確定為核心基因。這些核心基因的名稱、縮寫和功能如表3所示。使用cbioPortal在線平臺(tái)對(duì)核心的基因構(gòu)建共表達(dá)基因蛋白網(wǎng)絡(luò)（圖2a）。使用Kaplan- Meier曲線對(duì)核心基因的總體生存進(jìn)行分析（圖2 b），發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者含有CXCL2、AGT基因，其生存率相比無病生存率較差。

圖2 核心基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)和生存曲線分析Fig. 2 Analysis of interaction network and survival curve of core genes（a）使用cbioPortal分析核心基因及其共表達(dá)基因。黑色粗體輪廓的節(jié)點(diǎn)代表核心基因，黑色細(xì)體輪廓的節(jié)點(diǎn)代表共表達(dá)基因；（b）使用cbioPortal在線平臺(tái)對(duì)核心基因進(jìn)行總體存活和無病存活分析。 (a) Use cbioPortal to analyze Hub genes and their co-expressed genes. The nodes with black bold outlines represent core genes, the nodes with the black body outline represent co-expressed genes; (b) Use the cbioPortal online platform to analyze the overall survival and disease-free survival of core genes.

表3 核心基因功能Tab. 3 Core gene functions

2.5 核心基因的驗(yàn)證

利用數(shù)據(jù)庫Oncomine將基因AGT與CXCL2在正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)與結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果用箱式圖顯示（圖3）。選取Oncomine數(shù)據(jù)庫中3個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGT與CXCL2在結(jié)直腸癌組織確實(shí)呈高表達(dá)。

圖3 AGT和CXCL2在正常結(jié)直腸組織與結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)Fig. 3 The expression of AGT and CXCL2 in normal colorectal tissues and colorectal cancer tissue

圖4 AGT和CXCL2在Oncomine 3個(gè)數(shù)據(jù)集中的驗(yàn)證結(jié)果Fig. 4 The verification results of AGT and CXCL2 in Oncomine’s three data sets（a）AGT；（b）CXCL2。1.大腸癌與正常Graudens結(jié)腸的比較；2.直腸癌與正常Skrzypczak結(jié)直腸的比較；3. 結(jié)腸癌與正常Skrzypczak結(jié)腸直腸比較。Oncomine數(shù)據(jù)集結(jié)果顯示AGT、CXCL2在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)。(a) AGT; (b) CXCL2. 1. Colorectal carcinoma vs. normal graudens colon; 2. Colorectal carcinoma vs. normal skrzypczak colorectal; 3. Colon carcinoma vs. normal skrzypczak colorectal. The results of the Oncomine dataset showed that AGT and CXCL2 were significantly over-expression in colorectal cancer tissues.

3 討論

結(jié)直腸癌已經(jīng)成為中國三大癌癥之一，絕大多數(shù)的結(jié)直腸癌來源于腺瘤，其發(fā)病率正以螺旋速度遞增，但其病因仍然模糊不清。結(jié)直腸癌并非不可防治，是最易自我篩查的疾病，但其潛伏期較長(zhǎng)，早期診斷率較小。

近幾年有關(guān)結(jié)直腸癌分子機(jī)制的研究還是甚少。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫，選擇3個(gè)數(shù)據(jù)集，篩選出差異基因和核心基因，并對(duì)其蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、分子功能以及生存曲線通過cytoscape、cbioportal等生物信息工具進(jìn)行分析，最終根據(jù)分析結(jié)果確定了AGT、CXCL2基因?qū)Y(jié)直腸癌具有促進(jìn)作用。就目前，在我們所能查閱到的文獻(xiàn)中，只有1篇文獻(xiàn)研究了AGT與結(jié)直腸癌的相關(guān)性：AGT不僅可以調(diào)節(jié)血壓和穩(wěn)定體液平衡，而且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移；AGT M235T多態(tài)性與中國人結(jié)直腸癌的分化程度密切相關(guān)［17］。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果有所出入，分析原因如下：1）樣本量有限，所以有必要擴(kuò)大樣本量；2）我們?cè)贕EO數(shù)據(jù)庫中所選取的數(shù)據(jù)集中的樣本主要來自于日本和挪威，不能排除這種差異是由種族的差異而引起的，所以需要在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上增加多種族的樣本來源，來獲得更加準(zhǔn)確的分析結(jié)果；3）我們的研究是一個(gè)描述性的研究，還有待功能驗(yàn)證。CXCL2是一種趨化因子，與CXCR2受體結(jié)合參與細(xì)胞的增殖和凋亡、腫瘤的形成及其發(fā)展，以及干細(xì)胞的分化、中性粒細(xì)胞的聚集、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。宋宏偉等［18］運(yùn)用免疫組化染色分析結(jié)直腸癌及癌旁組織中CXCL2蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL2表達(dá)可能通過某種特殊的途徑影響結(jié)直腸組織，從而致癌，但其具體途徑還有待研究。鄭敏［19］運(yùn)用免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織及血清中的CXCL2蛋白表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織。當(dāng)根據(jù)解剖部位分為結(jié)腸、直腸時(shí)，CXCL2在結(jié)腸的高表達(dá)比在直腸更加明顯［20］。CXCL2聯(lián)合檢測(cè)CEA、CA199能夠有效的診斷結(jié)腸癌［21］。

本研究旨在識(shí)別可能參與結(jié)直腸癌的致癌或進(jìn)展的差異基因。通過對(duì)472個(gè)差異基因和15個(gè)核心基因的識(shí)別，發(fā)現(xiàn)促癌因子AGT、CXCL2可能被視為對(duì)結(jié)直腸癌診斷的生物標(biāo)志物，為后續(xù)的研究提供分子靶標(biāo)。然而，未來還需要進(jìn)一步的研究來闡明這些基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物功能及其激活途徑。