川明參粗多糖初級(jí)結(jié)構(gòu)解析及其體外抗氧化活性

高 濤，唐華麗，羅振宇，羅黃洋，李 敏

（重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 重慶 404100）

植物多糖作為一類大分子化合物，具有抗腫瘤[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]、降血糖[4]、增強(qiáng)免疫等生物活性[5]。川明參（Chuanminshen violaceum Sheh et Shan）屬傘形科多年生草本植物，主要分布在四川和湖北。作為傳統(tǒng)中藥，川明參具有止咳化痰、滋陰養(yǎng)胃、健脾的功效[6-7]。據(jù)報(bào)道，川明參多糖對(duì)遺傳物質(zhì)損傷也具有一定的修復(fù)作用[8]；能顯著提高超氧化物歧化酶 （Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，F(xiàn)e-SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和硫氧還蛋白（Trx）的mRNA 表達(dá)水平[9]；通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖顯著提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠的免疫活性，以及作為佐劑提高口蹄疫病毒疫苗免疫應(yīng)答[10-11]。硫酸化川明參多糖不僅具有治療自身免疫性疾病和免疫抑制類疾病的潛力，還具有抗鴨腸炎病毒的活性[11-12]。此外，硒化川明參多糖作為佐劑能增強(qiáng)乙肝疫苗的免疫應(yīng)答[13]。

自由基是指含有未配對(duì)電子的基團(tuán)、分子或原子，其包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）、脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）等，它是人體內(nèi)正常代謝的產(chǎn)物。一般情況下，人體內(nèi)的自由基水平處于動(dòng)態(tài)平衡中，平衡一旦被打破，由于其狀態(tài)極不穩(wěn)定，其會(huì)攻擊鄰近分子（碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等）以?shī)Z取電子。過(guò)多的自由基會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失，造成細(xì)胞損傷或死亡[14-16]。

本研究通過(guò)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜連用（UPLC-MS/MS）分析川明參粗多糖的單糖組成；采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）分析其分子質(zhì)量分布；通過(guò)紫外-可見光光譜（UV）、傅里葉紅外光譜（FT-IR）以及核磁共振光譜（NMR）鑒定川明參粗多糖結(jié)構(gòu)；通過(guò)羥自由基清除率、Fe2+螯合能力以及還原力試驗(yàn)研究川明參粗多糖的體外抗氧化能力，為進(jìn)一步開發(fā)川明參多糖提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干制川明參購(gòu)自重慶市萬(wàn)州區(qū)中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎。

葡萄糖（Glc），甘露糖（Man），半乳糖（Gal），核糖（Rib），巖藻糖（Fuc），木糖（Xyl），鼠李糖（Rha），阿拉伯糖（Ara），古洛糖醛酸（Gudo），葡萄糖醛酸（GlcA），甘露糖醛酸（ManA），半乳糖醛酸（GalA），氨基半乳糖（GalN），氨基葡萄糖GlcN），美國(guó)sigma 公司；窄分布聚乙二醇，美國(guó)Polymer Standards Service 公司；牛血清蛋白、Folin 酚試劑，福州飛凈生物科技有限公司；硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、鐵氰化鉀、菲洛嗪，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；苯酚、濃硫酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）等均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-300B 超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2450 紫外-可見光分光光度計(jì)，日本島津公司；FTIR-650 傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技股份有限公司；ALPH1-2/LD-Plus 冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST 公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （I-class UPLC，Xevo TQ-S micro 三重四級(jí)桿質(zhì)譜）、1515 系列高效液相色譜，美國(guó)Waters 公司；Bruker AVance III 400MHz 核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker 公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖提取與純化 稱取一定量川明參粉置于2 000 mL 錐形瓶中，按料液比1∶20 加入蒸餾水溶解。在300 Hz、60 ℃條件下，將溶解液放入超聲清洗儀中超聲提取90 min。超聲完成后用4層紗布過(guò)濾，然后將濾液濃縮至原體積的1/4，向濃縮液中加入無(wú)水乙醇，直至乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置沉淀，過(guò)夜后離心收集沉淀，經(jīng)真空冷凍干燥得到粗多糖粉末。稱取一定量粗多糖粉末配制成10 mg/mL 溶液，采用Sevag 法除去游離蛋白。按體積比3∶1 的比例向川明參粗多糖溶液加入氯仿-甲醇（體積比4∶1）溶液，劇烈震蕩30 min后離心，收集上清液后用分液漏斗收集上層液體。重復(fù)6 次后按上述步驟加入無(wú)水乙醇提取川明參粗多糖并真空干燥得到川明參粗多糖。

1.3.2 川明參粗多糖結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.2.1 單糖組成測(cè)定 采用PMP 柱前衍生UPLC-MS/MS 法測(cè)定單糖組成[17-19]。稱取10 mg 多糖樣品置于20 mL 安瓿瓶中，加入5 mL 三氟乙酸（2 mol/L）溶液，N2封管，100 ℃條件下水解2 h。水解完成后取1 mL 水解液加入1 mL 甲醇于70 ℃條件下用N2吹干，重復(fù)2 次以去除三氟乙酸。加入1 mL NaOH（0.3 mol/L）溶解殘?jiān)７謩e取400 μL 的樣品水解液與單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL 具塞試管中，加入400 μL 的PMP 甲醇溶液，漩渦混勻，于70 ℃下反應(yīng)2 h，反應(yīng)完成后去除放置至室溫，再加入400 μL HCl（0.3 mol/L）調(diào)節(jié)pH 值至6～7，加水1 200 μL，再加入等體積的氯仿萃取，渦旋混勻，靜置后收集水相，重復(fù)2 次。將水相用0.45 μm 水系濾膜過(guò)濾后供UPLC-MS/MS 分析。

HPLC 條 件 為Agilent EC-C18 色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；流量0.4 mL/min；流動(dòng)相A：20 mmol/L 乙酸銨緩沖液 （pH=7）；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫模式：時(shí)間梯度為0 min-1 min-7 min-11 min-13 min-14.5 min-14.6 min-17 min，流動(dòng)相B 的體積分?jǐn)?shù)梯度為14%-14%-18.5%-20%-60%-60%-14%-14%。

質(zhì)譜條件為ESI+模式；噴霧電壓2.0 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500℃；脫溶劑氣體N2，流速為1 000 mL/h；質(zhì)譜掃描范圍：170～800 m/z。

1.3.2.2 分子質(zhì)量測(cè)定 分子質(zhì)量測(cè)定采用HPGPC 法。取樣品5 mg 加入5 mL 試管中，加入超純水配置的0.1 mol/L 硝酸鈉溶液，超聲溶解后過(guò)0.22 μm 水系濾膜上HPLC 分析。以分子質(zhì)量分別為330 000，176 000，82 500，44 000，25 300，20 600，12 600，7 130，4 290，1 400，633，430 的窄分布聚乙二醇為對(duì)照。

色譜條件為ULTRAHYDROGEL 120 PKGD，ULTRAHYDROGEL 250 PKGD，ULTRAHYDROGEL 500 PKGD 色譜柱；Waters 2414 RID 檢 測(cè)器，流動(dòng)相：0.1 mol/L 硝酸鈉；流量1 mL/min。

1.3.2.3 β 消去反應(yīng) 稱取0.1 g 干燥的川明參粗多糖，溶于100 mL NaOH 溶液（0.2 mol/L）中，于45 ℃水浴3 h，在波長(zhǎng)200～500 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。以蒸餾水代替NaOH 溶液作為空白對(duì)照。

1.3.2.4 傅里葉紅外光譜（FT-IR） 稱取1～2 mg干燥后的川明參粗多糖粉末，置于瑪瑙研缽中，加入150～200 mg 干燥后的KBr 晶體，研磨均勻后壓片，在4 000～400 cm-1范圍測(cè)定其紅外光譜。

1.3.2.5 核磁共振光譜（NMR） 稱取適量川明參粗多糖樣品溶解于99.9% D2O 中，并使用Bruker 400 MHz 核磁共振波譜儀測(cè)定樣品的1H-NMR 和13C-NMR。

1.3.3 體外抗氧化試驗(yàn)

1.3.3.1 總還原力測(cè)定 取1.3 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別加入pH=6.6 的磷酸鹽緩沖液1.3 mL，1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL，混合均勻后于50 ℃條件下水浴25 min，快速冷卻后加入10%的三氯乙酸溶液1.3 mL，充分混合后于6 000 r/min條件下離心10 min。取上清液1.3 mL，加入1.3 mL蒸餾水和0.1%的三氯化鐵溶液0.3 mL，搖勻后反應(yīng)10 min，于波長(zhǎng)700 nm 處測(cè)定吸光度。每組平行測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.3.2 羥自由基清除率的測(cè)定 取2.2 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，加入9 mmol/L 硫酸亞鐵溶液2.2 mL，9 mmol/L 水楊酸2.2 mL 和8.8 mmol/L過(guò)氧化氫溶液2.2 mL，充分搖勻后置于37 ℃條件下水浴25 min，冷卻后于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定其吸光度。每組平行測(cè)定3 次，取平均值。羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中，A0——去離子水代替樣品溶液反應(yīng)后的吸光值；A1——去離子水代替過(guò)氧化氫溶液反應(yīng)后的吸光值；A2——樣品溶液反應(yīng)后的吸光值。

1.3.3.3 Fe2+螯合能力測(cè)定 取1.0 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液溶液，加入蒸餾水3.0 mL 和2.0 mmol/L 氯化亞鐵溶液0.1 mL，充分混合后加入5.0 mmol/L，菲洛嗪溶液0.2 mL，充分反應(yīng)10 min后于波長(zhǎng)562 nm 處測(cè)定溶液吸光度值。每組平行測(cè)定3 次，取平均值。Fe2+螯合能力計(jì)算公式如下：

式中，A0——去離子水代替樣品溶液反應(yīng)后的吸光值；A1——去離子水代替氯化亞鐵溶液反應(yīng)后的吸光值；A2——樣品溶液反應(yīng)后的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單糖組成及分子質(zhì)量分析

利用PMP 柱前衍生UPLC-MS/MS 法測(cè)定川明參多糖的單糖組成。標(biāo)準(zhǔn)單糖與樣品的色譜圖如圖1所示，在m/z=525 條件下定量測(cè)定古洛糖醛酸（GulA）、葡萄糖醛酸（GlcA）、甘露糖醛酸（ManA）和半乳糖醛酸（GalA）；在m/z=511 條件下定量測(cè)定葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）和半乳糖（Gal）；在m/z=510 條件下定量測(cè)定氨基半乳糖（GalN）和氨基葡萄糖（GlcN）；在m/z=495 條件下定量測(cè)定鼠李糖（Rha）和巖藻糖（Fuc）；在m/z=481 條件下定量測(cè)定核糖（Rib）、木糖（Xyl）和阿拉伯糖（Ara）。采用峰面積歸一法計(jì)算川明參粗多糖的單糖組成，結(jié)果表明，川明參粗多糖主要由鼠李糖（1.24%）、半乳糖醛酸（1.81%）、核糖（3.47%）、半乳糖（8.42%）、甘露糖（17.67%）、阿拉伯糖/木糖（27.83%）和葡萄糖（39.55%）組成。此外，川明參粗多糖的HPGPC 色譜圖如圖2所示，其結(jié)果表明，川明參粗多糖是一種分子質(zhì)量11.7 ku 的多分枝狀多糖。

圖1 PMP 柱前衍生UPLC-MS/MS 色譜圖Fig.1 UPLC-MS /MS chromatogram derived before PMP column

圖2 川明參粗多糖的HPGPC 色譜圖Fig.2 HPGPC chromatogram of crude polysaccharides from C.violaceum

2.2 川明參粗多糖中糖肽鍵的連接方式

β 消去反應(yīng)是測(cè)定糖蛋白中糖肽鍵連接方式的傳統(tǒng)方法。-O-型糖苷鍵與糖鏈連接的蘇氨酸與絲氨酸在低堿條件下會(huì)水解生成α-氨基丙烯酸與α-氨基丁烯酸，可引起波長(zhǎng)240 nm 處的吸光度值升高[20-22]。如圖3所示，在NaOH 處理后，川明參粗多糖的紫外光譜在波長(zhǎng)240 nm 處有明顯上升，表明川明參多糖為-O-型糖肽鍵連接的蛋白聚糖。

圖3 樣品的全掃描紫外光譜圖Fig.3 Full scan ultraviolet spectrum of sample

2.3 官能團(tuán)分析

川明參粗多糖紅外光譜如圖4所示，3 410 cm-1處較寬的吸收峰由分子間和分子內(nèi)O-H 和N-H 的伸縮振動(dòng)引起的；2 930 cm-1處的吸收峰為多糖的C-H 伸縮振動(dòng)峰，此為多糖的特征吸收峰；1 640 cm-1處的吸收峰為一級(jí)氨基和二級(jí)氨基的N-H 的邊角振動(dòng)或羰基-C=O 的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)；1 415 cm-1處的吸收峰為多糖的C-O 和蛋白質(zhì)的C-N 伸縮振動(dòng)；1 000～1 200 cm-1范圍內(nèi)的3個(gè)吸收峰表明川明參粗多糖主要由吡喃糖構(gòu)成；920 cm-1和850 cm-1處的吸收峰表明川明參粗多糖既含有α-吡喃糖苷鍵，又有β-吡喃糖苷鍵。

圖4 樣品的傅里葉紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum of sample

2.4 糖殘基及連接情況分析

一般而言，在異頭氫質(zhì)子區(qū)（δ=4.3～5.9）范圍內(nèi)有幾個(gè)信號(hào)，表明有幾種糖殘基。此外，α 構(gòu)型的糖殘基的異頭氫質(zhì)子信號(hào)大于δ=5.0，β 構(gòu)型的糖殘基的氫質(zhì)子信號(hào)小于δ=5.0[23]。川明參粗多糖的核磁共振氫譜如圖5a所示，在異頭質(zhì)子區(qū)共出現(xiàn)8 個(gè)信號(hào)，分別為δ=5.32，5.31，5.26，5.13，5.06，5.00，4.88，4.56，此結(jié)果表明川明參粗多糖中含有8 種糖殘基，并同時(shí)存在α 和β 構(gòu)型。糖殘基的H2～H6位信號(hào)出現(xiàn)于δ=3.0～4.2 范圍內(nèi)，其重合嚴(yán)重，難以歸屬。此外，在δ=3.2～3.5 范圍內(nèi)存在較弱的信號(hào)，表明存在較少的-OCH3；此外，在δ=1.0～1.3 范圍內(nèi)存在較明顯的-CH3信號(hào)，根據(jù)川明參粗多糖的單糖組成結(jié)果，將其歸屬為甲基戊糖中的鼠李糖信號(hào)[24]。

通常而言，異頭碳質(zhì)子信號(hào)位于δ=90～112之間，而大多數(shù)α 構(gòu)型糖殘基的異頭碳質(zhì)子信號(hào)處于δ=90～102，β 構(gòu)型糖殘基的異頭碳質(zhì)子信號(hào)位于δ=102～112 之間[24]。川明參粗多糖的核磁共振碳譜如圖5b所示，在δ=90～112 之間存在δ=107.27，104.32，103.61，99.63，99.59，98.55，95.72，92.0 8 種異頭碳信號(hào)，表明川明參粗多糖中存在8 種單糖殘基。此外，由于呋喃糖的C3或C5的質(zhì)子信號(hào)大于δ=80，結(jié)合單糖組成與端基碳質(zhì)子信號(hào)δ=107.27，圖5b 中δ=81.36 可歸屬為α-Araf信號(hào)。此外，δ=15～20 范圍內(nèi)的信號(hào)也表明了鼠李糖的存在；δ=75～77 范圍內(nèi)的3 個(gè)信號(hào)為六碳糖的C2～C5或五碳糖的C2～C4被取代后的信號(hào)；δ=70～75 范圍內(nèi)的信號(hào)為C2～C5范圍內(nèi)未被取代的信號(hào)；δ=68～70 范圍內(nèi)的信號(hào)為六碳糖的C6或五碳糖的C5被取代信號(hào)；而δ=55-65 范圍內(nèi)的信號(hào)為未被取代的六碳糖的C6或五碳糖的C5信號(hào)。根據(jù)文獻(xiàn)與單糖組成，可將異頭質(zhì)子信號(hào)δ=4.56/95.72 和δ=5.13/92.09 依次歸屬為→4-β-Xylp和→4-α-Xylp[25-26]；δ=5.00/107.27 歸屬為α-1，5-Araf[27]；δ=5.06/104.32 歸屬為α-1，2-Rhap或α-1，2，4-Rhap[28]；δ=4.88/103.61 歸屬為β-1，4，6-Galp[29]。根據(jù)參考文獻(xiàn)、單糖組成以及C 譜中較明顯信號(hào)，將δ=5.32/99.636 和δ=5.31/99.59 歸屬于α-1，4-Glc，α-1，6-Glc 或α-1，4，6-Glc[29-30]；δ=5.26/98.55 應(yīng)歸屬為α-1，2-Man[31-32]。綜上所述，川明參粗多糖中主要為α-1，4-糖苷鍵。此外，還含有一定量的α-1，2-糖苷鍵、α-1，6-糖苷鍵和α-1，5-糖苷鍵以及極少量的β-1，4-糖苷鍵和β-1，6-糖苷鍵。

圖5 樣品的核磁共振光譜Fig.5 NMR spectra of samples

2.5 川明參粗多糖的體外抗氧化活性

羥自由基是一類化學(xué)性質(zhì)非?；钴S的自由基，易與碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[33]。川明參粗多糖羥自由基清除率如圖6a所示，在低質(zhì)量濃度（0～1 g/mL）范圍，川明參粗多糖的羥自由基清除率與質(zhì)量濃度存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；當(dāng)質(zhì)量濃度大于1 g/mL 后，羥自由基清除率無(wú)明顯增加。雖然川明參粗多糖的羥自由基清除率顯著低于VC，但質(zhì)量濃度在1 g/mL 時(shí)，其羥自由基清除率為（60.17±1.96）%，表明其具有較好的羥自由基清除能力。

金屬離子可通過(guò)向化合物轉(zhuǎn)移單個(gè)電子從而引發(fā)自由基的形成，所以，F(xiàn)e2+螯合能力與抗氧化活性密切相關(guān)[34]。如圖6b所示，川明參粗多糖的Fe2+螯合能力在低質(zhì)量濃度（0～1 g/mL）范圍具有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度大于1 g/mL時(shí)，其Fe2+螯合能力無(wú)明顯增加，此時(shí)的Fe2+螯合能力為（63.2±1.39）%，表明其具有較好的抑制自由基形成的能力。

川明參粗多糖的總還原力如圖6c所示，其在低質(zhì)量濃度（0～0.6 g/mL）范圍內(nèi)有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.6 g/mL 時(shí)，其吸光度值無(wú)明顯增加。結(jié)果表明，川明參粗多糖具有一定的還原力，但其還原力低于VC。

圖6 樣品的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of antioxidant test of the samples

3 結(jié)論

通過(guò)PMP 柱前衍生結(jié)合UPLC-MS/MS 分析得到，川明參粗多糖主要由由鼠李糖（1.24%）、半乳糖醛酸（1.81%）、核糖（3.47%）、半乳糖（8.42%）、甘露糖（17.67%）、阿拉伯糖/木糖（27.83%）和葡萄糖（39.55%）組成；通過(guò)HPGPC 分析得到，川明參粗多糖為分子質(zhì)量為11.7 ku 的多分枝狀多糖；通過(guò)β 消去反應(yīng)得到，川明參粗多糖中具有-O-連接的蛋白聚糖；紅外光譜分析表明，川明參粗多糖中α-吡喃糖苷鍵與β-吡喃糖苷鍵同時(shí)存在；最后通過(guò)NMR 分析得到，川明參粗多糖中主要為α-1，4-糖苷鍵；此外，還含有一定量的α-1，2-糖苷鍵、α-1，6-糖苷鍵和α-1，5-糖苷鍵以及極少量的β-1，4-糖苷鍵和β-1，6-糖苷鍵?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，雖然川明參粗多糖的羥自由基清除率、亞鐵離子熬和能力和總還原力與對(duì)照品還存在一定差距，但在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其羥自由基清除率，亞鐵離子熬和能力和總還原力都存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)川明參粗多糖質(zhì)量濃度較高時(shí)，其表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。本研究為進(jìn)一步開發(fā)川明參多糖提供一定的依據(jù)。