陸生伊薩酵母WJL-G4降解檸檬酸的條件研究

唐 瑩，王金玲，2*，盧志全，蔣 瑩，何紅英，董 丹，晏雨辰，李巧月

（1 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 哈爾濱 150040 2 黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150040 3 黑龍江省賓縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 哈爾濱 150040）

檸檬酸（Citric acid）又名枸櫞酸，學(xué)名2-羥基丙烷-1，2，3-三羧酸，是天然的有機(jī)多元羧酸[1-2]，具有令人愉快的酸味，入口爽快，無后酸味，也是主要的中間代謝產(chǎn)物，參與三羧酸循環(huán)[3-4]。實(shí)際生產(chǎn)中，可作為安全無毒的防腐劑[5]，酸味劑[6-7]，被廣泛用于各種飲料、汽水、葡萄酒、糖果、點(diǎn)心、餅干、罐頭果汁、乳制品等食品的制造中[8]。

在以檸檬酸含量高的果實(shí)為原料生產(chǎn)的果汁、果酒及其它產(chǎn)品中，因檸檬酸含量較高而出現(xiàn)酒味酸澀、酒體粗糙等現(xiàn)象[2，9]。常用的降酸方法有物理、化學(xué)、生物降酸法?？滦袂宓萚10]采用樹脂降酸法處理浸泡型樹莓果酒，得到酒體清澈透明、醇香突顯的果酒，然而物理降酸法不適于去除固定酸[11]。梁敏等[12]將碳酸鈉等加入藍(lán)靛果酒中，發(fā)現(xiàn)酒中酸含量降低，花色苷含量也降低了?；瘜W(xué)降酸法雖簡(jiǎn)單易行，降酸效果明顯，但往往影響果酒的口感、色澤，同時(shí)還會(huì)引入金屬離子，導(dǎo)致酒體不穩(wěn)定，如失光、混濁[13]等。生物降酸為現(xiàn)代降酸研究的發(fā)展方向。目前，關(guān)于降酸菌的研究大都是針對(duì)蘋果酸，如酒球菌屬（Oenococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）等[14-15]，通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic fermentation，MLF）能夠較專一地把蘋果酸轉(zhuǎn)變成乳酸和CO2，從而達(dá)到降酸的目的[16]。文連奎等[17]分別在檸檬酸和蘋果酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上，篩選出1 株可以降解蘋果酸和檸檬酸的酵母菌，鑒定為陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola），其發(fā)酵特性尚未見報(bào)道。陳思睿等[18]篩選降解檸檬酸的優(yōu)良酵母菌種并應(yīng)用于紅樹莓果汁降酸研究中，篩選出具有高效降解檸檬酸作用的非釀酒酵母菌，經(jīng)鑒定、命名為陸生伊薩酵母WJL-G4（Issatchenkia terricola WJL-G4）、陸生伊薩酵母WJL-T2，分別接種于紅樹莓果汁中，果汁pH 值由3.08 分別升至3.36 和3.27，檸檬酸降解率分別達(dá)59.54%和58.55%，該結(jié)論為紅樹莓等檸檬酸含量高的水果提供有利的降解途徑，然而關(guān)于該菌種代謝檸檬酸的途徑尚未展開。

本試驗(yàn)中以實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的陸生伊薩酵母WJL-G4 為試驗(yàn)菌種，探索其最佳降酸培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件及其耐受性，為非釀酒酵母代謝檸檬酸的途徑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 陸生伊薩酵母WJL-G4，由本實(shí)驗(yàn)室于樹莓果園紅樹莓鮮果上篩選獲得，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定命名其為陸生伊薩酵母菌WJL-G4。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為酵母浸粉10 g，硫酸鎂1 g，檸檬酸20 g，溶于1 000 mL 蒸餾水中。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，加入瓊脂25 g，溶于800 mL 蒸餾水中，檸檬酸溶于200 mL 水中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。滅菌后冷卻到50～60 ℃，混合倒平板。

檸檬酸，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸鎂、硫酸銨、尿素、硝酸鉀、硫酸鋅、硫酸鐵、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸錳、亞硫酸氫鈉、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ELx800NB 型酶標(biāo)儀，美國Bio Tek 公司；BS 200S-WEI 電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；722 型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-IPO 凈化工作臺(tái)，南京曉曉儀器設(shè)備有限公司；SHZ-C 水浴恒溫振蕩器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 陸生伊薩酵母種子液的制備

1）種子液制備[19]用接種環(huán)挑取1 環(huán)保藏于4 ℃冰箱中的陸生伊薩酵母菌WJL-G4，劃線于基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)飽滿的菌落，接種于100 mL/250 mL錐形瓶的現(xiàn)配基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，于28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，加入4 粒無菌玻璃珠，震蕩10 min，制得種子液，并測(cè)定活菌數(shù)為2.25×108CFU/mL，放入4 ℃冰箱，待用[20]。

2）培養(yǎng)條件 種子液以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接入，28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)，時(shí)間12 h，裝液量為100 mL/250 mL 錐形瓶。

3）菌種保藏 長(zhǎng)期保存（30 d），試管斜面低溫保藏；短期（3～5 d），定期移接。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線繪制 取種子液以1%（v/v）接種量轉(zhuǎn)接于100 mL/250 mL 錐形瓶液體培養(yǎng)基，于28 ℃，120 r/min 搖床培養(yǎng)。4 h 后每隔1 h 混勻取樣，測(cè)定波長(zhǎng)600 nm 處的吸光值（以“OD600nm”計(jì)），重復(fù)3 次。以取樣時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)，繪制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線[21-22]。

1.3.3 菌種降酸培養(yǎng)基研究 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，首先確定菌種對(duì)檸檬酸的最大耐受范圍，取種子液分別接種于檸檬酸質(zhì)量濃度為20，40，60，80，100，120，140 g/L 的液體培養(yǎng)基中，以O(shè)D600nm為生長(zhǎng)量指標(biāo)判斷菌種最大檸檬酸耐受質(zhì)量濃度；然后取種子液分別接種于檸檬酸質(zhì)量濃度分為1，5，10，15，20，25 g/L 的液體培養(yǎng)基中，以降酸率和生長(zhǎng)量為指標(biāo)篩選最適檸檬酸質(zhì)量濃度；以不加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，選取酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素、硝酸鉀代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源配制培養(yǎng)基，使含氮量為1 g/L，篩選最適氮源；以篩選出的最佳氮源分別添加1，5，10，15，20 g/L 的質(zhì)量濃度篩選最適氮源的質(zhì)量濃度。

以不加無機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，選取硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸鐵、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸錳、硫酸鎂代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽配制培養(yǎng)基，使含鹽量為0.01 mol/L，篩選最適無機(jī)鹽；以最適無機(jī)鹽添加量為添加0.001，0.005，0.01，0.015，0.02 mol//L，篩選出最適無機(jī)鹽的最適添加量。

1.3.4 菌種降酸條件及生長(zhǎng)特性研究 取上述種子液以1%（v/v）接種量，接種于100 mL/250 mL 錐形瓶液體培養(yǎng)基，分別置于25，28，30，33，35 ℃，于120 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，通過測(cè)定降酸率和OD600nm確定最適溫度；取種子液以1%（v/v）接種量，分別接種于裝液量為20，40，60，80，100 mL/250 mL 錐形瓶液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)48 h 后，通過測(cè)定降酸率和OD600nm確定裝液量；取種子液分別按1%，2%，3%，4%，5%（v/v）的接種量接種于100 mL/250 mL 錐形瓶液體培養(yǎng)基，于28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，通過測(cè)定降酸率和OD600nm來確定接種量；取陸生伊薩酵母菌種子液以1%（v/v）接種量，接種于100 mL/250 mL 錐形瓶液體培養(yǎng)基，置于轉(zhuǎn)速分別為80，120，160，200，240 r/min 的震蕩培養(yǎng)箱中，于28 ℃，培養(yǎng)48 h，通過測(cè)定降酸率和OD600nm確定最適轉(zhuǎn)速。

1.3.5 菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在1.3.4節(jié)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取溫度、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速4 個(gè)因素和相應(yīng)的三個(gè)水平，采用 L9（34）正交表安排試驗(yàn)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以降酸率和OD600nm為考察指標(biāo)，對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，進(jìn)一步優(yōu)化降酸條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.6 菌種耐受性研究 取上述種子液以1%（v/v）接種量分別接于不同質(zhì)量濃度的SO2和不同酒精體積分?jǐn)?shù)的液體培養(yǎng)基中，于上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)，取菌懸液，測(cè)定OD600nm，確定該菌種對(duì)SO2和酒精的耐受量。

1.4 指標(biāo)測(cè)定方法

1）生長(zhǎng)量 采用分光光度法，測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm 處的吸光值，以“OD600nm”計(jì)。

2）總酸[23]參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》中NaOH 滴定法（以檸檬酸計(jì)，單位g/L）。

式中，ρ0——降解前檸檬酸的質(zhì)量濃度，g/L；ρ1——降解后檸檬酸的質(zhì)量濃度，g/L。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示，數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 軟件進(jìn)行分析處理并作圖。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，陸生伊薩酵母與一般酵母菌生長(zhǎng)曲線基本一致，經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期，這與姚博等[24]研究的漿水中酵母菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果一致。該菌種較黨輝等[25]研究的饅頭中酵母菌Y-1、Y-2 和AQ 遲緩期略長(zhǎng)，這說明該菌種在以檸檬酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中，適應(yīng)新環(huán)境而合成必需的酶、輔酶及中間代謝產(chǎn)物的時(shí)間較長(zhǎng)。8～18 h 為該菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌種的細(xì)胞生長(zhǎng)速率最大，酶系活躍，代謝旺盛，且抗不良環(huán)境的能力最強(qiáng)；20 h 后，菌種生長(zhǎng)速率下降，進(jìn)入穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，受培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的限制，菌種發(fā)酵34 h，進(jìn)入衰亡期。

圖1 陸生伊薩酵母WJL-G4 的生長(zhǎng)曲線圖Fig.1 Growth curve of Issatchenkia terricola WJL-G4

2.2 降酸培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 檸檬酸對(duì)菌種降酸率及生長(zhǎng)量的影響 進(jìn)行最適檸檬酸質(zhì)量濃度篩選時(shí)，首先對(duì)該菌種能耐受最大檸檬酸質(zhì)量濃度進(jìn)行確定，結(jié)果如圖2a所示。不同檸檬酸質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的pH值見表2，不同檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)菌種降酸率及生長(zhǎng)量的影響如圖2b所示。

由圖2a 可知，當(dāng)檸檬酸質(zhì)量濃度≤60 g/L時(shí)，菌種的生長(zhǎng)基本不受抑制。當(dāng)檸檬酸質(zhì)量濃度≥80 g/L 時(shí)，菌種生長(zhǎng)量呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），這可能是由于檸檬酸質(zhì)量濃度過高，導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓過高，不利于酵母生長(zhǎng)[26]。由表2可知，該菌中耐受最大pH 值為2.41，當(dāng)菌種生長(zhǎng)環(huán)境的pH＜2.41，則會(huì)影響菌種的生長(zhǎng)。因此，菌種耐受檸檬酸的最大質(zhì)量濃度為60 g/L，對(duì)應(yīng)的pH值為2.41。

表2 不同檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的pH 值Table 2 pH value corresponding to different citric acid mass concentrations

饒炎炎等[27]測(cè)得樹莓中檸檬酸含量為17.21 g/L；張晶琳等[28]測(cè)得春香和檸檬2 個(gè)品種的柑橘有機(jī)酸含量為7 g/L 左右，可見不同果實(shí)檸檬酸含量不同。為了得到菌種降解檸檬酸的最佳質(zhì)量濃度，進(jìn)一步進(jìn)行檸檬酸質(zhì)量濃度的篩選。由圖2b可知，檸檬酸質(zhì)量濃度在1～25 g/L 范圍內(nèi)，菌種降酸率隨質(zhì)量濃度的增加先增加后趨于平穩(wěn)。文連奎等[17]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)試驗(yàn)培養(yǎng)基總酸質(zhì)量濃度大于12 g/L 時(shí)，試驗(yàn)菌種對(duì)L-蘋果酸的降解能力變化不大，但對(duì)檸檬酸的降解能力明顯減小，這可能是因?yàn)楫?dāng)酸質(zhì)量濃度大于12 g/L 時(shí)，會(huì)影響菌種代謝產(chǎn)生的降酸酶的作用。本研究中，檸檬酸質(zhì)量濃度在10 g/L 時(shí)，降酸率最高為92.9%，OD600nm為1.269，且此時(shí)菌種降酸率與5 g/L 時(shí)無顯著性差異（P＞0.05），其生長(zhǎng)量除了與1 g/L 時(shí)呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），與其它均無顯著性差異（P＞0.05）。鑒于目的是降低檸檬酸含量，故選取檸檬酸質(zhì)量濃度10 g/L 作為最佳碳源添加量。

圖2 檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)陸生伊薩酵母WJL-G4 生長(zhǎng)量及降酸率的影響Fig.2 Effects of citric acid mass concentrations on deacidification and growth of Issatchenkia terricola WJL-G4

2.2.2 氮源種類及添加量對(duì)降酸率及生長(zhǎng)量的影響 氮源的作用是為微生物細(xì)胞提供氮元素及能量，不同氮源對(duì)微生物有不同的生理學(xué)效應(yīng)[29]。氮也是組成核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，為微生物提供合成細(xì)胞物質(zhì)代謝產(chǎn)物的原料[30]。不同氮源及添加量對(duì)菌種降酸率及菌種生長(zhǎng)量的影響如圖3所示。

由圖3可知，相同含氮量條件下，不同種類的氮源對(duì)菌種降酸率及生長(zhǎng)量影響不同。從圖3a 可知，與無機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源更適合菌種生長(zhǎng)并有利于檸檬酸降解，這與文連奎等[17]的試驗(yàn)結(jié)果一致。添加酵母浸粉時(shí)，菌種降酸率和生長(zhǎng)量最大。圖3b 表明，酵母浸粉的添加量為5 g/L 時(shí)，菌種降酸率為63.08%，與其它添加量呈顯著性差異（P＜0.05），且此時(shí)菌種生長(zhǎng)量OD600nm最大。故選酵母浸粉為降酸最佳氮源，其最適添加量為5 g/L。

圖3 不同氮源種類及添加量對(duì)陸生伊薩酵母WJL-G4 降酸率及生長(zhǎng)量的影響Fig.3 Effects of different nitrogen source types and addition amount on deacidification rate and growth of Issatchenkia terricola WJL-G4

2.2.3 無機(jī)鹽種類及添加量對(duì)降酸率及生長(zhǎng)量的影響 無機(jī)鹽在微生物生長(zhǎng)過程中起著十分重要的作用，如構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)、調(diào)節(jié)滲透壓等。不同種類的無機(jī)鹽及添加量對(duì)菌種降酸率及生長(zhǎng)量的影響如圖4。

由圖4a 可知，相同濃度下，供試的無機(jī)鹽因種類不同，菌種降酸率也不同。其中，添加硫酸鎂時(shí)菌種降酸率為65.56%，大于其它供試無機(jī)鹽，然而此時(shí)菌種生長(zhǎng)量卻不是最大，可能是因?yàn)榫N降酸率與生長(zhǎng)量不是呈正相關(guān)關(guān)系，還需進(jìn)一步研究。由圖4b 可知，當(dāng)硫酸鎂的添加量為0.005 mol/L 時(shí)，菌種降酸率均最大，但與0.001，0.01 mol/L 時(shí)的降酸率和生長(zhǎng)量均無顯著性差異（P＞0.05）。考慮到節(jié)約成本，選擇最佳無機(jī)鹽硫酸鎂的添加量為0.001 mol/L。

圖4 無機(jī)鹽種類及硫酸鎂濃度對(duì)菌種降酸率及生長(zhǎng)量的影響Fig.4 Effects of inorganic salt types and the amount of magnesium sulfate on deacidification rate and growth of Issatchenkia terricola WJL-G4

2.3 菌種降酸率及生長(zhǎng)量的單因素試驗(yàn)

溫度是影響菌種生長(zhǎng)的主要因素之一，同時(shí)也是影響菌種功能性的主要因素[31]。根據(jù)圖5a 可知，溫度為25 ℃和35 ℃時(shí)，菌種的降酸率較低，且生長(zhǎng)量小。溫度為28 ℃時(shí)，菌種降酸率最大，為60.59%，且與30 ℃時(shí)無顯著性差異（P＞0.05）。實(shí)際應(yīng)用中，考慮到減少能耗，選擇28 ℃為最佳降酸溫度。

由圖5b 可知，轉(zhuǎn)速為80 r/min 時(shí)，菌種的降酸率、生長(zhǎng)量與其它轉(zhuǎn)速條件相比呈現(xiàn)顯著性降低（P＜0.05）。當(dāng)轉(zhuǎn)速為240 r/min 時(shí)，菌種降酸率、生長(zhǎng)量均達(dá)最高，但降酸率與200 r/min 時(shí)相比無顯著性差異（P＞0.05）。鑒于實(shí)際生產(chǎn)中轉(zhuǎn)速高會(huì)出現(xiàn)菌液濺出等不良現(xiàn)象，且考慮到減少能耗，故最佳轉(zhuǎn)速選為200 r/min。

由圖5c 可知，隨著接種量增加，菌種降酸率、生長(zhǎng)量呈先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。接種量在3%，4%，5%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，菌種降酸率無顯著性差異（P＞0.05）；接種量在2%時(shí)，菌種降酸率、生長(zhǎng)量與1%相比無顯著性差異（P＞0.05），但較體積分?jǐn)?shù)3%，呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。因此，接種量選為1%（體積分?jǐn)?shù)）。

由圖5d 可知，當(dāng)裝液量≥60 mL 時(shí)，菌種的降酸率及生長(zhǎng)量均有所下降，并都具有顯著性差異（P＜0.05）。裝液量在20 mL 和40 mL 時(shí)，菌種的降酸率及生長(zhǎng)量較高，且均無顯著性（P＞0.05）。這與王懇[32]的試驗(yàn)結(jié)論一致，當(dāng)裝液量大于50 mL，試驗(yàn)菌種降酸能力有所下降?？紤]到經(jīng)濟(jì)因素，故選取40 mL 為降酸最佳裝液量。

圖5 不同條件對(duì)陸生伊薩酵母WJL-G4 降酸率及生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different conditions on deacidification rate and growth of Issatchenkia terricola WJL-G4

2.4 降酸率與生長(zhǎng)量的正交優(yōu)化試驗(yàn)

陸生伊薩酵母菌降解檸檬酸條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4和5。

表3 陸生伊薩酵母WJL-G4 降酸率和OD600nm 試驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Analysis of results of deacidification rate and OD600nm test of Issatchenkia terricola WJL-G4

表4 陸生伊薩酵母WJL-G4 降酸率試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Analysis of variance of test results of deacidification rate of Issatchenkia terricola WJL-G4

表5 陸生伊薩酵母WJL-G4 OD600nm正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 5 Analysis of variance of test OD600nm of Issatchenkia terricola WJL-G4

由表3和4可知，對(duì)于因素B，菌種生長(zhǎng)量在B1和B2水平間無顯著性差異，而在B3水平間顯著降低（P＜0.05），其降酸率在3 個(gè)水平間無顯著性差異（P＞0.05），鑒于降酸率是本試驗(yàn)的第一考察指標(biāo)，且考慮經(jīng)濟(jì)因素，因此以B3為最佳。對(duì)于因素A，菌種降酸率在A2與A1和A3水平間呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），其生長(zhǎng)量在3 個(gè)水平下差異不顯著，因此，選取A2為最佳水平。對(duì)于因素C和D，菌種降酸率和生長(zhǎng)量均無顯著性差異（P＞0.05），考慮到經(jīng)濟(jì)因素，在實(shí)踐中為了節(jié)約能耗，故選取C1和D1為最佳。綜合比較得出：陸生伊薩酵母菌WJL-G4 降解檸檬酸的最佳條件為B3A2C1D1，即溫度28 ℃、裝液量40 mL/250 mL、接種量為1%（v/v）、轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.5 時(shí)間對(duì)菌種降酸率及生長(zhǎng)量的影響

根據(jù)2.4 節(jié)的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，測(cè)定不同時(shí)間該菌種的降酸效果及生長(zhǎng)量，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，降酸率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，在48 h 時(shí)，菌種降酸率為97.26%，與2.4 節(jié)中試驗(yàn)號(hào)為6 的試驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05），這也驗(yàn)證了2.4 節(jié)的菌種降酸條件優(yōu)化結(jié)果。當(dāng)時(shí)間≥24 h，菌種生長(zhǎng)量無顯著性增加（P＞0.05）。當(dāng)時(shí)間為48 h，菌種降酸率為97.26%，與36 h 時(shí)相比具有顯著性差異（P＜0.05），而與60 h時(shí)相比無顯著性差異（P＞0.05）。饒炎炎等[27]測(cè)定紅樹莓果酒0～300 d 發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化，結(jié)果顯示，主要有機(jī)酸檸檬酸的含量變化范圍是17.21～11.40 g/L。水果中的主要有機(jī)酸含量為0.2%～0.3%[33]。根據(jù)GB 15037-2006 《葡萄酒》中的規(guī)定，甜葡萄酒、加香型葡萄酒的總酸含量要求在5.0～8.0 g/L（以酒石酸計(jì)）范圍。通過計(jì)算得知，當(dāng)菌種降酸時(shí)間為12 h，樹莓發(fā)酵過程中的總酸含量已經(jīng)達(dá)到要求，且考慮到經(jīng)濟(jì)、效率因素，故最佳降酸時(shí)間選為12 h，降酸率為91.82%。

圖6 時(shí)間對(duì)菌種降酸及生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of culture time on acid reduction and growth of Issatchenkia terricola

2.6 耐受性試驗(yàn)結(jié)果

由圖7a 可知，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度≤8 mg/L 時(shí)，菌體生長(zhǎng)基本不受抑制；SO2質(zhì)量濃度＞10 mg/L時(shí)，菌種生長(zhǎng)量急劇下降。Chang 等[34]的研究表明，SO2通過干擾蛋白質(zhì)的運(yùn)輸，并與輔酶和維生素結(jié)合，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。在果酒發(fā)酵前，SO2的通入量一般在60～100 mg/L 范圍，就可以抑制其它菌的生長(zhǎng)[32]。因此，菌種可耐受8 mg/L SO2，降酸過程中應(yīng)先接入本降酸菌進(jìn)行降酸，以免由于菌種不能耐受SO2而影響降酸效果，也可在實(shí)際應(yīng)用中，通過控制SO2通入量從而控制降酸程度。

由圖7b 可知，菌種的生長(zhǎng)量在酒精體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，呈現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05）。因此，該降酸菌能耐受的最高酒精體積分?jǐn)?shù)為5%。這與文連奎等[17]的試驗(yàn)結(jié)果一致，該降酸菌不能耐受較高酒精度。因此，在實(shí)際降酸應(yīng)用中，可以利用酒精發(fā)酵控制降酸程度。

圖7 SO2 和酒精對(duì)陸生伊薩酵母WJL-G4 生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of SO2 and alcohol concentration on the growth of lssatcheakia terricnla WJL-G4

3 結(jié)果與討論

水果中的主要有機(jī)酸為檸檬酸、蘋果酸、酒石酸和抗壞血酸，總含量約為0.2%～3.0%[33]。Yu 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，甜橙中的主要有機(jī)酸為檸檬酸。Kim等[36]試驗(yàn)結(jié)果顯示，獼猴桃中檸檬酸含量占總酸含量的60%～80%。生物降酸由于對(duì)原料的成分、色澤、風(fēng)味和穩(wěn)定性影響較小，而使得篩選具有降酸能力的酵母菌成為研究熱點(diǎn)。Lucio 等[37]通過同時(shí)接種植物乳桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵，可以控制葡萄酒的酸度。楊華[38]將從130 株菌株中篩選降酸效果最好的菌株BY-9 接種至紅豆越橘果酒中，使其總酸度降低12.26%。郝愛玲等[2]為獲得降解檸檬酸并可應(yīng)用于酸含量較高的獼猴桃國酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株，篩選降解檸檬酸的酵母，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株M130 能夠?qū)J猴桃中的檸檬酸由13.12 g/L降至10.74 g/L，且發(fā)酵結(jié)束后，酒體澄清、透明、香氣濃郁，然而未見其對(duì)降酸的機(jī)理的深一步探究。目前，專門針對(duì)檸檬酸降解的菌種研究較少，且降酸率很難達(dá)到90%及以上，制約了檸檬酸型果實(shí)生產(chǎn)加工的發(fā)展，也進(jìn)一步限制菌種代謝檸檬酸途徑的研究。本試驗(yàn)中使用的具有降酸功能的菌株屬于非釀酒酵母，與釀酒酵母相比，其在形態(tài)特征、生理生化特性、遺傳及代謝等方面存在著較大的差異，尤其是許多非釀酒酵母具有獨(dú)特的生化代謝特征，顯示出良好的工業(yè)應(yīng)用前景[39]，其代謝有機(jī)酸途徑及機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在以檸檬酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，通過碳源、氮源和無機(jī)鹽最佳降酸量的選擇以及最適降酸條件的優(yōu)化，使得陸生伊薩酵母菌WJL-G4的降酸率可達(dá)90%。

本試驗(yàn)中，為了提高陸生伊薩酵母菌WJLG4 降解檸檬酸的程度，對(duì)該菌株最佳降酸培養(yǎng)基配方及條件進(jìn)行篩選。其中，培養(yǎng)條件的優(yōu)化是提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平的重要因素[40]。試驗(yàn)結(jié)果表明，該降酸菌最佳培養(yǎng)基配方為檸檬酸質(zhì)量濃度10 g/L，最佳氮源為酵母浸粉，其添加量為5 g/L，最適無機(jī)鹽為硫酸鎂，其添加濃度為0.001 mol/L。陸生伊薩酵母菌降解檸檬酸的最佳條件優(yōu)化方案為溫度28 ℃、裝液量40 mL/250 mL 錐形瓶、接種量1%（體積分?jǐn)?shù)）、轉(zhuǎn)速160 r/min，時(shí)間12 h，此時(shí)降酸率達(dá)91.82%、OD600nm為1.55，且菌種耐受SO2的最大質(zhì)量濃度及酒精體積分?jǐn)?shù)分別為8 mg/L 和5%。

4 結(jié)論

陸生伊薩酵母菌WJL-G4 具有降解檸檬酸的功能，且在最佳降酸條件下降酸率可達(dá)90%，其降酸效率較優(yōu)化前顯著提高，本研究為非釀酒酵母代謝檸檬酸的途徑提供理論基礎(chǔ)，也豐富了檸檬酸型水果及其加工品降酸工藝的研究?jī)?nèi)容。