飼料中淀粉含量測(cè)定方法的對(duì)比研究

王建偉

（甘肅省畜牧技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730030）

淀粉以顆粒物的形式存在于谷物、塊莖中，是由D-葡萄糖組成的一種多糖，在飼料營(yíng)養(yǎng)分析中需要經(jīng)常測(cè)定。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中找到操作簡(jiǎn)便快捷、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的方法十分必要。當(dāng)前，國(guó)際上最準(zhǔn)確的淀粉測(cè)定方法由瑞典人J.Holm提出，待測(cè)定樣品先后經(jīng)過(guò)熱穩(wěn)定性α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶處理，然后用分光光度計(jì)比色測(cè)定。該方法具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是以上3種酶制劑批次不同，質(zhì)量規(guī)格差異較大，且價(jià)格昂貴，測(cè)定成本較高，在常規(guī)飼料營(yíng)養(yǎng)分析中不適用。AOAC淀粉酶分解法，即利用耐高溫α-淀粉酶，用乙酸緩沖液進(jìn)行處理，再進(jìn)行酸水解比色，是一種常用的淀粉測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn)，常用于實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)定，但待測(cè)樣品中纖維素含量較高時(shí)，該方法測(cè)定結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步考證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 α-淀粉酶（Sigma，A-3403，F(xiàn)rom Bacillus licheniformis）；淀粉葡萄糖苷酶（Sigma，A-3042，F(xiàn)rom Aspergillus niger）；葡萄糖氧化酶（Sigma，G-6641，F(xiàn)rom Aspergillus niger）；過(guò)氧化物酶（Sigma，P-8125，F(xiàn)rom Horseradish）；二甲基亞砜（分析純）。

1.1.2 器械 植物粉碎機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、渦旋器、酸度計(jì)（JKY/PH112/M315900）、分光光度計(jì)（CN61M/SP-752）、一次性吸管、容量瓶、燒杯、鋁箔紙、磁力攪拌器。

1.2 試驗(yàn)方法

全價(jià)料、青貯玉米、全絨棉籽、豆粕、麥草、苜蓿、全混合日糧等7種常見(jiàn)飼料的原料經(jīng)風(fēng)干并用高速粉碎機(jī)粉碎、過(guò)篩（1 mm）后作為試樣備用。

1.2.1 HW方法 淀粉在淀粉葡萄糖苷酶催化下，最終水解為葡萄糖，再在有氧條件下經(jīng)葡萄糖氧化酶催化，β-D-葡萄糖氧化，生成D-葡萄糖酸，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，計(jì)算飼料中淀粉的含量。

1.2.1.1 操作步驟。第一步，準(zhǔn)確稱取190～200 mg試樣于50 ml燒杯。第二步，在燒杯中加入5 ml水，置于磁力攪拌器上攪拌混勻，再加入15 ml水進(jìn)行攪拌。第三步，加入0.1 mlα-淀粉酶，置于磁力攪拌器上混勻。第四步，用鋁箔密封燒杯，在強(qiáng)制通風(fēng)烘箱中烘1 h，92℃，烘后冷卻0.5 h。第五步，將玻璃棉放在漏斗中，將樣品過(guò)濾入100 ml容量瓶，用水沖洗燒杯和漏斗，將樣品全數(shù)洗入容量瓶中，稀釋到刻度，蓋好瓶塞，反復(fù)倒轉(zhuǎn)混勻。第六步，用1 ml移液管將樣品移入50 ml容量瓶中，加入0.1 M醋酸緩沖液（pH 4.5）和淀粉葡萄糖苷酶，振蕩搖勻。第七步，用鋁箔密封容量瓶，放入強(qiáng)制通風(fēng)烘箱中烘0.5 h，60℃，每10 min振蕩容量瓶以混勻。第八步，冷卻0.5 h，然后加水稀釋至刻度，蓋好瓶塞，反復(fù)倒轉(zhuǎn)混勻。第九步，各取1 ml樣品溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 g/ml）用移液管移入16×150 mm的試管中；取2管樣品，用移液管加入5 ml葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化氫酶提取物，混勻、靜置，同時(shí)用保鮮膜蓋好，避免污染。第十步，35℃水浴45 min，暗處冷卻10 min。讀取505 nm處的吸光值。將分光光度計(jì)歸0，計(jì)算每個(gè)樣品的平均吸光光度值。

1.2.1.2 計(jì)算公式?？偟矸?麥芽糖=(A×S+I)×V×DF×1/1 000 000×W×DM×162/180。式中，A為反應(yīng)試劑的吸光度減去空白的吸光度，S為斜率，I為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距轉(zhuǎn)換為葡萄糖模型的吸光值，V為樣品溶液最后體積，DF為稀釋倍數(shù)。

1.2.2 AOAC方法 樣品中的淀粉利用耐高溫α-淀粉酶水解為麥芽糖。利用高純度的淀粉葡萄糖苷酶通過(guò)調(diào)節(jié)溫度和pH值使寡聚糖定量的水解為葡萄糖。葡萄糖的含量取決于高純度的葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化氫酶試劑。如果產(chǎn)物包括支鏈淀粉或抗性淀粉，則在測(cè)定前用二甲基亞砜處理，再用淀粉酶處理[1,2]。

1.2.2.1 試驗(yàn)步驟。第一步，稱取試樣0.18～0.2 g置于20 ml試管中。第二步，加入0.4 ml濃度為80%的乙醇稀釋液，振蕩混勻，使試樣充分溶解于乙醇中，再加入6.0 ml耐高溫α-淀粉酶，充分振蕩，使其混勻。第三步，馬上置于沸水中水浴6 min，期間每隔2 min晃動(dòng)1次，使其受熱均勻。第四步，將試管放置于50℃水浴鍋中5 min，同時(shí)加入0.2 mol/L乙酸緩沖液8 ml和淀粉葡萄糖液0.2 ml，振蕩混勻，在50℃水浴鍋中靜置30 min。第五步，加純水5.6 ml，然后轉(zhuǎn)移至20 ml離心管，將離心機(jī)調(diào)至3 000 rpm，離心10 min。取上清液1 ml，用10 ml容量瓶加水定容。第六步，各取1 ml樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液移入試管。隨機(jī)抽取2管樣品，用移液管將3.0 ml葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化氫酶混合物分別加入樣品管中，混勻，靜置于50℃水浴鍋中20 min。第七步，用標(biāo)準(zhǔn)液將分光光度計(jì)歸0，取出試管后放置在避光處冷卻10 min。用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，讀取505 nm處的吸光值。然后計(jì)算每個(gè)樣品的平均吸光光度值。

1.2.2.2 計(jì)算公式?？偟矸?麥芽糖=A×F×1 000×1/1 000×100/W×162/180=A×F/W×90。式中，A為反應(yīng)試劑的吸光度減去空白的吸光度，F(xiàn)為稀釋倍數(shù)，W為樣品重量，162/180為淀粉中游離葡萄糖轉(zhuǎn)換為葡萄糖苷的系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用配對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS8.2 MEANS過(guò)程統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)2種淀粉測(cè)定方法結(jié)果的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 2種方法測(cè)定淀粉含量的結(jié)果

2種方法測(cè)定淀粉含量的結(jié)果見(jiàn)表1，其中全價(jià)料、青貯玉米、全絨棉籽和豆粕這4種飼料的2種測(cè)定結(jié)果相近，麥草、苜蓿和全混合日糧的2種測(cè)定結(jié)果相差較大。

2.2 2種方法測(cè)定結(jié)果比較

本試驗(yàn)采用配對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS8.2 MEANS過(guò)程統(tǒng)計(jì)分析，表2結(jié)果表明P=0.33，即HW法和AOAC法的測(cè)定結(jié)果差異不顯著。

表1 飼料中淀粉含量的測(cè)定結(jié)果

表2 HW法和AOAC法的比較

3 討論

HW法和AOAC法均采用淀粉酶分析法，淀粉酶分析法中的酶具有高度專一性，對(duì)高分子糖類物質(zhì)和纖維素?zé)o催化分解作用，因此檢測(cè)飼料淀粉含量準(zhǔn)確可靠。但由于淀粉酶分析法中所用的主要酶制劑價(jià)格昂貴、規(guī)格不同，所以我國(guó)一般不用于飼料中淀粉含量的測(cè)定，大多用于食品中淀粉含量的測(cè)定。

淀粉分子和其他多糖分子一樣，易受溫度和酶活性的影響。若酶的活性不夠，則糖苷鍵只輕度水解，即變稀。因此，淀粉酶分析法測(cè)定飼料淀粉含量時(shí)，要嚴(yán)格把控酶的用量及水解時(shí)間和溫度，且由于同種飼料的不同部分淀粉含量差異較大，采用淀粉酶分析法時(shí)應(yīng)對(duì)同一種飼料樣品充分混勻并進(jìn)行平行測(cè)定，使試驗(yàn)數(shù)據(jù)更具代表性[3,4]。

HW法和AOAC法的測(cè)定結(jié)果差異并不顯著，說(shuō)明HW法和AOAC法對(duì)飼料淀粉含量的測(cè)定差異不大。在試驗(yàn)中HW法相比于AOAC法前處理時(shí)間長(zhǎng)，而且測(cè)定步驟多，繁瑣的步驟更容易造成測(cè)定誤差。AOAC法處理淀粉葡萄糖苷酶和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液使用了相同的溫度，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)室資源，且前處理時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便，更適用于飼料淀粉的批量檢測(cè)。