梅毒螺旋體抗體樣本經(jīng)酶聯(lián)免疫法檢驗(yàn)假陽性結(jié)果的相關(guān)影響因素分析

牛琰，廖衛(wèi)，梁鑫，南黎，王華

梅毒是臨床多見性傳播疾病，由梅毒螺旋體(treponema pallidum，TP)感染引起，具有較強(qiáng)傳染性，且傳播途徑具有多樣性，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢，其增長速度位于8種法定報(bào)告性病之首[1]。臨床應(yīng)選擇高敏感性、高特異性的實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)協(xié)助診治過程，血清TP抗體是診斷梅毒的重要依據(jù)[2]。目前臨床檢測TP抗體的血清學(xué)方案主要采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，對IgM、IgG抗體均有較高檢測能力，且檢測效能較好，臨床應(yīng)用廣泛[3]。但試驗(yàn)過程中由于多種因素影響會導(dǎo)致假陽性的發(fā)生，從而引發(fā)誤診與醫(yī)療糾紛，臨床應(yīng)對假陽性產(chǎn)生的相關(guān)影響因素進(jìn)行分析，并采取針對性干預(yù)措施，提高診斷準(zhǔn)確性，減少梅毒在人群中的傳播[4]。本資料選取我院輸血前、術(shù)前檢查患者1 365例，旨在探討TP抗體樣本經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性結(jié)果的相關(guān)影響因素。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選取2017年9月—2020年9月我院輸血前、術(shù)前檢查患者1 365例，其中男691例，女674例；年齡24～87(59.89±13.27)歲；BMI 18.3～25.7(22.71±1.29)kg/m2；合并癥：糖尿病98例、惡性腫瘤87例、紅斑狼瘡26例、肺結(jié)核43例、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎68例；其他75例?；颊呋蚣覍倬炇鹬橥鈺?。排除精神或意識障礙無法配合檢查。

1.2 方法 (1)采集空腹靜脈血，待標(biāo)本凝固后，以4 000 r/min的速度離心15 min，離心半徑為10 cm，分離得到血清，采用ELISA法測定TP抗體水平，試劑盒購自上?？迫A生物工程股份有限公司；若檢測結(jié)果為陽性，則進(jìn)行明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)，試劑盒購自珠海麗珠試劑股份有限公司，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。(2)TP抗體真假陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：ELISA法檢測結(jié)果為陽性且TPPA檢測結(jié)果同時(shí)為陽性則判定為真陽性；ELISA法檢測結(jié)果為陽性，但TPPA檢測結(jié)果為陰性，且2周內(nèi)復(fù)查結(jié)果仍為陰性則判定為假陽性。(3)采集TP抗體真陽性、假陽性患者一般資料與ELISA法檢測相關(guān)因素，包括性別、年齡、BMI、合并癥、檢測溫度、標(biāo)本因素(溶血、細(xì)菌污染、保存、處理、操作、封膜板)、儀器因素(拖帶陽性、酶標(biāo)儀)等。

1.3 觀察指標(biāo) (1)統(tǒng)計(jì)TP抗體假陽性結(jié)果。(2)分析TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性的單因素。(3)分析TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性的Logistic多因素回歸。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以n，%表示，行χ2檢驗(yàn)，多因素分析行Logistic回歸分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP抗體假陽性結(jié)果 1 365例輸血前、術(shù)前檢查患者中經(jīng)ELISA檢查TP抗體陽性率為6.01%(82/1365)，其中TPPA檢查陽性率(真陽性率)為71.95%(59/82)，假陽性率為28.05%(23/82)。

2.2 TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性的單因素分析 TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)真陽性與假陽性患者性別、BMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；二者年齡、合并癥、檢測溫度、標(biāo)本異常、儀器異常、螺旋體共生情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性的單因素分析

2.3 TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性的多因素Logistic回歸分析 經(jīng)多因素Logistic回歸分析，年齡>60歲、有合并癥、標(biāo)本異常、儀器異常、螺旋體共生均為TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性的危險(xiǎn)因素，檢測溫度18～25 ℃為其保護(hù)因素(P<0.05)。見表2。

表2 TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性的多因素Logistic回歸分析

3 討論

TP早期主要侵犯皮膚黏膜，晚期會累及中樞神經(jīng)與心血管系統(tǒng)，具有較強(qiáng)破壞性，能通過胎盤、性、輸血感染等多種方式傳播，會嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量。臨床多采用ELISA法測定TP抗體陽性情況，具有靈敏度高、結(jié)果客觀的優(yōu)勢，已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用[5-6]。但不斷有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，TP抗體血清學(xué)ELISA法檢測時(shí)極易出現(xiàn)假陽性。臨床應(yīng)積極采取措施明確假陽性原因，為臨床研究提供依據(jù)。

基于此，本資料對1 365例輸血前、術(shù)前檢查患者進(jìn)行血清學(xué)檢測，結(jié)果中假陽性發(fā)生率為28.05%，并進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示年齡>60歲、有合并癥、標(biāo)本異常、儀器異常、螺旋體共生均為TP抗體經(jīng)ELISA檢驗(yàn)假陽性的危險(xiǎn)因素，檢測溫度18～25 ℃為其保護(hù)因素。其中年齡>60歲是TP抗體ELISA法檢測發(fā)生假陽性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，老年患者生理功能衰退，會導(dǎo)致免疫功能異常，從而產(chǎn)生特異性或非特異性TP抗體的交叉抗原、清蛋白抗體或異常蛋白質(zhì)，干擾檢測結(jié)果，導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生[8]。而梅毒患者伴有惡性腫瘤、肺結(jié)核、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等合并癥會導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生自身抗體、甲胎蛋白、類風(fēng)濕因子等，在ELISA檢測過程中具有一定吸附作用，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性[9]。同時(shí)，本資料選取受試者年齡跨度較大，體內(nèi)會共生多種螺旋體，導(dǎo)致血液樣本中多種螺旋體共存，如口腔螺旋體、皮膚螺旋體、腸道螺旋體等，會誘發(fā)抗原群或形成交叉反應(yīng)抗體，是TP抗體假陽性的另一個重要原因。另外，ELISA法檢測技術(shù)問題值得詳細(xì)分析，其中標(biāo)本異常是不容忽視的重要問題，標(biāo)本溶血會導(dǎo)致活性酶與底物非特異性結(jié)合，且會吸附血紅蛋白，洗滌時(shí)不易洗去，從而催化底物顯色，提高吸光度值，增加假陽性率[10]；而細(xì)菌污染時(shí)其內(nèi)源性辣根過氧化物酶會產(chǎn)生非特異性干擾，標(biāo)本保存、處理、操作不當(dāng)會導(dǎo)致抗體效價(jià)降低，標(biāo)本失效；而無封膜板會引起水分蒸發(fā)，濃度升高，均會引發(fā)假陽性的出現(xiàn)。儀器異常是引發(fā)假陽性的另一個操作原因，其中拖帶陽性污染會導(dǎo)致其后的1孔或多孔連續(xù)出現(xiàn)假陽性；酶標(biāo)儀反應(yīng)板底部污染或有氣泡時(shí)，會引發(fā)假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。檢測溫度18～25 ℃為TP抗體樣本發(fā)生假陽性的保護(hù)因素，ELISA方法檢測需在適宜溫度下進(jìn)行反應(yīng)，此溫度下反應(yīng)最快速、最準(zhǔn)確，能減少假陽性事件的發(fā)生[11]。

根據(jù)上述TP抗體樣本ELISA檢測假陽性的影響因素分析，可針對性制定措施進(jìn)行預(yù)防干預(yù)：(1)對于年齡>60歲、有合并癥患者需進(jìn)行多次重復(fù)檢驗(yàn)，并對基礎(chǔ)疾病、合并癥等進(jìn)行篩查，對此類患者進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測與評估。(2)操作過程中應(yīng)提高技術(shù)人員技術(shù)，在完全無菌情況下進(jìn)行操作，避免標(biāo)本溶血、細(xì)菌污染等情況發(fā)生，并注意操作、保存事項(xiàng)，如標(biāo)本5 d內(nèi)可以置于4 ℃下保存，但超過7 d的標(biāo)本需低溫冷凍保存，且應(yīng)避免反復(fù)凍融或者直接分裝凍存；并嚴(yán)格按照操作規(guī)章制度進(jìn)行，延長洗滌時(shí)間、增多洗滌次數(shù)，并及時(shí)進(jìn)行封膜板[12]。(3)加樣后對加樣針進(jìn)行反復(fù)清洗，嚴(yán)格避免拖帶陽性的發(fā)生，并注意正確使用酶標(biāo)儀。(4)從冷凍環(huán)境取出標(biāo)本后置于室溫下平衡30 min左右，且操作時(shí)溫度盡量控制在18～25 ℃左右。

綜上所述，TP抗體樣本ELISA檢測極易產(chǎn)生假陽性，年齡>60歲、有合并癥、標(biāo)本或儀器異常、螺旋體共生均為其危險(xiǎn)因素，溫度適宜為其保護(hù)因素，臨床可據(jù)此制定針對性干預(yù)措施，減少誤診情況的發(fā)生。