蛋氨酸和半胱氨酸對絲尾鳠生長性能、蛋氨酸代謝和蛋白質(zhì)代謝的影響

張新黨，李光彬，王秋梅，孫 彥，黃 漢，蘇林海，李必為，鄧君明

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

0 引言

蛋氨酸(Met)又名甲硫氨酸，屬中性氨基酸，與生物體內(nèi)各種含硫化合物的代謝有重要關(guān)系，是許多養(yǎng)殖魚類的第一限制性氨基酸[1]，在魚類生長發(fā)育過程中具有重要的生理生化功能。研究表明，在魚類配合飼料中添加適量的Met不僅可以有效地提高其飼料利用率、生長速率以及其免疫能力，還能降低其養(yǎng)殖成本[2-4]。Met 在動物體內(nèi)大部分直接參與蛋白質(zhì)的合成，當(dāng)飼料中半胱氨酸(Cys)的量不足以滿足動物合成蛋白所需時，Met 便會轉(zhuǎn)化為合成蛋白質(zhì)所需的Cys[5]。但由于胱硫醚合成酶的不可逆反應(yīng)阻止了Cys重新轉(zhuǎn)化為高半胱氨酸與絲氨酸，因此Cys 又不能完全滿足動物對于Met的需求量[6]。因此，飼料中Cys的含量也會影響魚類對Met的需求量。

絲尾鳠(Hemibagrus wyckioides)隸屬于鲇形目、鲿科、鳠屬，又名長胡子魚，原產(chǎn)于老撾、越南、泰國等東南亞各國河流水域，在中國則主要分布在云南省境內(nèi)瀾滄江下游支流[7-8]。近年來，隨著絲尾鳠人工繁殖和育苗技術(shù)的突破以及多種養(yǎng)殖規(guī)模的推廣，極大地推動了絲尾鳠養(yǎng)殖業(yè)的興起，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，現(xiàn)已在云南文山、河口、景洪等地進(jìn)行推廣養(yǎng)殖，養(yǎng)殖面積大于667 hm2，而且取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[9-10]。然而，迄今有關(guān)絲尾鳠營養(yǎng)生理魚營養(yǎng)需求方面的研究還比較少，目前也僅有絲尾鳠蛋白質(zhì)需求的研究報道[11]。本課題組前期的兩批試驗結(jié)果表明：于基礎(chǔ)飼料（Met 含量0.5%）中添加不同水平Met(0、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%)對絲尾鳠生長性能和大部分生理生化指標(biāo)沒有顯著影響。然而，傳統(tǒng)水產(chǎn)動物營養(yǎng)學(xué)認(rèn)為Met 是魚類的必需氨基酸(EAA)，Met 缺乏會顯著降低魚類的生長性能。同時，本課題組前期以純化原料配制4種飼料（對照組、蛋氨酸缺乏組、半胱氨酸缺乏組、蛋氨酸+半胱氨酸缺乏組）飼喂絲尾鳠幼魚，但絲尾鳠幼魚對于這四種飼料并無攝食現(xiàn)象。本試驗采用低完整蛋白高晶體氨基酸基礎(chǔ)飼料（對照組）中分別扣除Met、Cys、Met+Cys 的形式，配制四組等氮等能飼料[Con、-Met、-Cys、-(Met+Cys)]飼喂絲尾鳠，分析其生長性能和生理生化指標(biāo)，證實Met 是否為絲尾鳠的EAA，并研究絲尾鳠對Met的代謝特點和利用能力。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

本試驗采用低蛋白高晶體氨基酸基礎(chǔ)飼料(Con)中分別扣除Met、Cys、Met+Cys 的形式，以魚粉、豆粕和晶體氨基酸作為飼料蛋白源，魚油、豆油和大豆卵磷脂作為脂肪源，飼料原料中的晶體氨基酸用谷氨酸和天冬氨酸進(jìn)行等氮調(diào)節(jié)，除Met和Cys水平不同外，其余的EAA和非必需氨基酸(NEAA)按照絲尾鳠幼魚全魚氨基酸組成模式，用6 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)飼料pH 至中性，配制4 種等氮等能飼料，分別為Con、(-Met)、(-Cys)、-(Met+Cys)，以確定Met 是否為絲尾鳠EAA。試驗飼料組成及營養(yǎng)成分和飼料氨基酸組成見表1和表2。

表1 試驗飼料配方和營養(yǎng)組成（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

續(xù)表1

表2 試驗飼料氨基酸組成 %

配制飼料前，所有原料必需經(jīng)過粉碎機（SFSP 系列，昆明華明糧油飼料設(shè)備廠生產(chǎn)）粉碎，且全部過60目篩。將所有粉碎好的飼料原料按表1飼料配方混合均勻，然后再加入魚油、豆油和大豆卵磷脂（先溶于魚油和豆油中），手工將油脂微小顆粒搓散，再加入30%左右蒸餾水使粉狀飼料形成硬團(tuán)，最好于顆粒飼料機（KS-180，江蘇晶谷米機有限公司生產(chǎn)）中將飼料擠壓成直徑1.0 mm的條狀，并在40℃鼓風(fēng)烘箱中干燥12 h，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗用絲尾鳠(Hemibagrus wyckioides)幼魚為當(dāng)年人工培育的同一批苗種，由云南省西雙版納州水產(chǎn)技術(shù)推廣站提供。試驗于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)實驗室中進(jìn)行。試驗前，試驗幼魚暫養(yǎng)2周適應(yīng)環(huán)境，每天飼喂2次。養(yǎng)殖用水為曝氣自來水，采用循環(huán)流水系統(tǒng)，循環(huán)系統(tǒng)采用機械和生物介質(zhì)過濾。

試驗開始前禁食24 h，選擇大小均勻（初始體重約2.70 g）、體格健壯的絲尾鳠魚苗480尾，隨機分配于12個玻璃缸（4個試驗處理組，每組3個重復(fù)），每缸(0.5 m× 0.5 m × 1.0 m)40 尾魚。每天早晚投餌2 次(07:00,17:00)，達(dá)飽食水平，早上投喂結(jié)束后30 min，吸出殘餌及糞便。試驗共進(jìn)行8 周，整個養(yǎng)殖試驗期間均采用24 h 連續(xù)充氧，自然光照，水溫始終保持在27～29℃。

1.3 樣品收集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，禁食24 h，于每缸隨機取6尾魚作為全魚樣品，分析測定魚體常規(guī)組成。此外，每缸隨機選取3 尾魚，解剖后將完整的肝臟樣品置于-80℃下保存；每缸隨機選取3 尾魚，解剖后將腸取出，剝?nèi)ブ?，去除其?nèi)容物后裝魚密封袋中，放于-80℃保存。

1.4 分析測試

試驗持續(xù)養(yǎng)殖8周，結(jié)束前一天停止投喂，統(tǒng)計每個玻璃缸魚體總重和數(shù)量，記錄每個玻璃缸投喂飼料的總用量，計算平均代謝體重、攝食率、體增重、日增重系數(shù)以及飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率。各生長指標(biāo)的計算分別見公式(1)～(6)。

魚體和飼料常規(guī)成分分析參照AOAC法。其中：水分測定用恒溫烘箱在105℃下烘至恒重；粗蛋白質(zhì)含量的測定采用全自動凱氏定氮儀（JK9830，濟(jì)南精密科學(xué)儀器儀表有限公司測定）；粗脂肪的測定采用索氏提取法（以石油醚為溶劑）測定；粗灰分的測定為箱式電阻爐（SX-410，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）550℃灼燒法(16 h)。總能的測定采用氧彈式能量儀（ZDHW-6，鶴壁市華泰儀器儀表有限公司）測定。飼料中氨基酸的組成分析采用Venusil AA氨基酸分析方法（酸水解法），用高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）測定。

肝臟、腸道的生化指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，按照使用說明進(jìn)行操作。其中，肝臟和腸道中胰蛋白酶采用紫外比色法，淀粉酶(AMS)采用碘-淀粉比色法，脂肪酶(LPS)、二糖酶采用比色法。肝臟堿性磷酸酶(ALP)連續(xù)監(jiān)測法，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)采用賴氏法，谷胱甘肽還原酶(GR)采用紫外比色法，超氧化物歧化酶(SOD)采用黃嘌呤氧化酶法，溶菌酶(LZM)采用比濁法，谷氨酸脫氫酶(GDH)、腺苷單磷酸脫氨酶(AMPD)、蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)、蛋氨酸合成酶(MS)、甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)和胱硫醚β合酶(CBS)均采用雙抗體夾心法，丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAC)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、過氧化氫酶(CAT)均采用可見光法。組織中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮蘭法測定。

1.5 統(tǒng)計分析

所有試驗結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SEM)。所有百分率數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計前均先經(jīng)Arcsine轉(zhuǎn)換。采用單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)處理組之間存在顯著性差異(P<0.05)時，用Duncan's 檢驗進(jìn)行多重比較分析。所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 生長性能

由表3可知，養(yǎng)殖試驗期間，各飼料處理組絲尾鳠成活率為98.33%～99.17%，不同飼料處理組間成活率無顯著性差異。-Cys 絲尾鳠增重率、日增重系數(shù)、攝食率和蛋白質(zhì)效率均顯著高于其他飼料處理組；反之，Con和-Cys飼料系數(shù)顯著低于-Met和-(Met+Cys)。

表3 不同飼料處理對絲尾鳠生長性能的影響

2.2 消化酶活性

由表4 可知，Con 和-Met 絲尾鳠胃蛋白酶活性顯著高于-Cys；-Met 和-(Met+Cys)肝臟脂肪酶活性顯著低于Con；-Cys肝臟二糖酶活性則顯著高于Con，而與其他飼料處理組無顯著性差異。不同飼料處理組間腸道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、二糖酶的活性以及肝臟胰蛋白酶、淀粉酶的活性均無顯著性差異。

表4 不同飼料處理對絲尾鳠消化酶活性的影響

2.3 蛋白質(zhì)代謝

由表5 可知，Con 絲尾鳠肝臟AMPD 顯著低于-(Met+Cys)；而-(Met+Cys)肝臟ALT 活性則顯著高于其他飼料處理組；不同處理組間肝臟GDH 和AST 活性則沒有顯著性差異。-Met 肝臟MAT 活性顯著高于Con 和-Cys；類似地，-Met 肝臟CBS 顯著高于-Cys 和-(Met+Cys)；-(Met+Cys)肝臟BHMT 活性顯著高于Con 和-Cys，與-Met 無顯著性差異；而Con 組MS 顯著高于-Cys，與其他飼料處理組無顯著性差異。

表5 不同飼料處理對絲尾鳠肝臟蛋氨酸和蛋白質(zhì)代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.4 抗氧化功能

由表6 可知，Con 絲尾鳠肝臟SOD 活性顯著低于-(Met+Cys)；-Met肝臟POD活性和T-AOC活性顯著高于-Cys 和-(Met+Cys)；類似地，-Met 肝臟CAT 和GR活性均顯著高于其他飼料處理組；Con 和-(Met+Cys)肝臟GSH-Px 活性顯著高于-Met 和-Cys；-Cys 肝臟AKP 活性顯著高于-(Met+Cys)和Con；而Con 組MDA含量則顯著低于其他飼料處理組。不同飼料處理組LZM活性沒有顯著性差異。

表6 不同飼料處理對絲尾鳠肝臟抗氧化能力的影響

2.5 魚體組成

由表7 可知，-Met 和-(Met+Cys)魚體水分顯著高于Con 和-Cys，相反地，-Met 和-(Met+Cys)魚體粗蛋白、粗脂肪和粗灰分則顯著低于Con和-Cys。

表7 不同飼料處理對絲尾鳠魚體組成的影響

3 討論

3.1 不同飼料處理對絲尾鳠生長性能的影響

研究表明，當(dāng)飼料中Met含量不足時，會降低飼料轉(zhuǎn)化率和魚體增重率[13]，造成魚類生長速度減緩或停滯、腎臟腫大等負(fù)面影響，最終導(dǎo)致其肝壞死或纖維化[14]。而Cys 作為一種NEAA，可由Met 轉(zhuǎn)化而成，進(jìn)而參與組成蛋白質(zhì)，因此魚類需要足夠的Met 以及Cys 來滿足蛋白質(zhì)合成及其他一些生理活動的需要。本試驗中，扣除Met和Met+半胱氨酸組絲尾鳠的飼料轉(zhuǎn)化率和魚體增重率均顯著低于其他飼料處理組，其原因可能是飼料中Met含量的不足造成其氨基酸不平衡，進(jìn)而對其飼料利用率和生長造成影響[15]。研究表明，飼料中Met 含量不足時，顯著降低了大菱鲆[16](Scophthalmus maximus)、瓦氏黃顙魚[17](Pelteobagrus vachelli)、吉富羅非魚[18](Oreochromis niloticus)等的生長性能和飼料利用率；類似地，周賢君等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低含量Met不僅降低了異育銀鯽的生長性能和特定生長率，還使其蛋白沉積率顯著下降。以上結(jié)果均表明飼料中Met 的缺乏會嚴(yán)重抑制魚類的生長，而補充適量的Met 則明顯改善其生長性能，同時Met 還明顯影響了尖齒胡鯰[20](Clarias gariepinus)、斑點叉尾鮰[21](Ietalurus Punetaus)和印度囊鰓鯰[22](Heteropneustes fossilis)的生長狀態(tài)。本課題組前期兩批試驗結(jié)果顯示添加不同水平Met并未對絲尾鳠的生長造成顯著性差異，這是由于前期試驗飼料中本底Met 的含量均為0.5%，而本課題組后期試驗也表明絲尾鳠幼魚的最適Met 需要量為0.5%左右，因此本底中的Met 含量已能滿足絲尾鳠幼魚的生長需求，因此造成添加不同水平Met 并未對其生長以及生理生化指標(biāo)造成顯著性差異。而本試驗中，當(dāng)扣除Met和Cys時，飼料本底中所含Met為0.2%左右，造成絲尾鳠幼魚的生長性能和飼料利用率顯著下降，可說明Met 是絲尾鳠幼魚的EAA。

3.2 不同飼料處理對絲尾鳠消化酶活性的影響

魚類的生長依賴于對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，魚類消化道中的消化酶活性則是衡量其消化吸收能力的重要指標(biāo)。而消化器官則包括腸道和肝胰臟，其中，肝胰臟是消化酶的主要分泌器官，腸道則是營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收場所[23]。也有研究表明，采食量可在一定程度上反映魚類腸道對其營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力[24]。本試驗中，扣除Met 組的肝臟脂肪酶顯著下降，同時，相對于扣除Cys，扣除Met 也明顯降低了絲尾鳠幼魚肝臟二糖酶活性，這與本試驗中絲尾鳠的采食量趨勢相一致。唐炳榮[23]等在對草魚(Ctenopharyngodon idellus)的研究中發(fā)現(xiàn)，缺乏Met 會顯著降低生長中期草魚肝臟和腸道中的胰蛋白酶和脂肪酶活性；類似地，彭艷等[25]對建鯉(Cyprinus carpiovar Jian)的研究中也得出Met 對其腸道胰蛋白酶、脂肪酶均有顯著性影響。腸道消化酶活性的高低可代表水生動物消化能力的強弱，各種水生動物的消化酶活性是不同的，魚類的健康狀況也會對消化酶有一定的影響。因此，本試驗扣除Met 時，不利于絲尾鳠幼魚對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而導(dǎo)致其消化酶活性降低以及生長性能和飼料利用率的下降。

3.3 不同飼料處理對絲尾鳠蛋白質(zhì)代謝的影響

Met 在肝臟中的代謝主要由3 個代謝途徑的蛋氨酸-高半胱氨酸循環(huán)組成[26-27]，分別為轉(zhuǎn)甲基作用、再甲基作用和轉(zhuǎn)巰基作用（見圖1）。其中轉(zhuǎn)甲基作用和再甲基作用構(gòu)成了動物體內(nèi)大多數(shù)的Met 循環(huán)，而轉(zhuǎn)巰基作用則僅分布于部分器官中，包括肝臟、腸道和胰腺[28]。首先，Met 在MAT 的催化下生成S-腺苷蛋氨酸(SAM)，SAM 不僅是重要的甲基供體，還在體內(nèi)參與多胺合成，轉(zhuǎn)甲基后生成腺苷高半胱氨酸，后者再進(jìn)一步進(jìn)行水解成為高半胱氨酸(Hcy)。然后Hcy 作為一種重要的的中間代謝產(chǎn)物，既可以通過MS 催化生成Met，也可以通過BHMT 催化的酶促反應(yīng)進(jìn)行再甲基化生成Met，或者Hcy 在CBS 的作用下發(fā)生不可逆反應(yīng)生成胱硫醚[29]。由此可知，Met 在動物體內(nèi)的代謝是一個復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)體系，其中MAT、BHMT和MS主要與甲基化合成Met及其甲基供體的循環(huán)利用有關(guān)，而CBS則主要與Met 轉(zhuǎn)巰基降解及其他含硫生物活性物質(zhì)的合成有關(guān)。本試驗結(jié)果表明，扣除Met 后均顯著影響了絲尾鳠幼魚肝臟中MAT、CBS、BHMT 和MS 的活性。由于Hcy 是MAT、BHMT、MS和CBS酶促反應(yīng)的共同底物，所以Met 代謝的重點調(diào)控點是在甲基化和轉(zhuǎn)巰基途徑之間的分配。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)扣除絲尾鳠幼魚飼料中的Met時，其肝臟中MAT、CBS和BHMT的活性相對于其他飼料處理組均有上升的趨勢，說明絲尾鳠幼魚對飼料中極低Met 的利用主要是通過同時提高Hcy的甲基化和轉(zhuǎn)巰基的反應(yīng)來實現(xiàn)[30]。

圖1 蛋氨酸部分代謝途徑

研究表明，在動物代謝過程中很多氨基酸都是轉(zhuǎn)化為谷氨酸來參與體內(nèi)代謝的。因此，GDH是反應(yīng)蛋白質(zhì)分解代謝和NEAA合成的一種關(guān)鍵酶，它的活性高低在一定程度上反應(yīng)了魚類體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝的情況。在動物體蛋白質(zhì)代謝過程中轉(zhuǎn)氨酶起著非常重要的作用，是機體中間代謝的關(guān)鍵酶反應(yīng)。而轉(zhuǎn)氨酶的種類有很多，其中以ALT和AST活性最強。本試驗結(jié)果顯示，相對于其他飼料處理組，扣除Met后絲尾鳠幼魚肝臟中ALT和AST活性明顯升高，這些結(jié)果均表明了肝臟中氨基酸代謝的不平衡狀況[17]。類似地，AMPD 也是反映肝臟損傷程度的敏感指標(biāo)，絲尾鳠幼魚肝臟中的AMPD活性表現(xiàn)出與ALT、AST相同的變化趨勢，進(jìn)一步說明Met 的缺乏會影響絲尾鳠幼魚的氨基酸代謝。

3.4 不同飼料處理對絲尾鳠抗氧化功能的影響

已有研究表明，動物代謝過程中會產(chǎn)生一定量自由基，生物體內(nèi)的自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡中，而自由基含量過高則會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞[31]，抗氧化功能的強弱主要通過其抗氧化體系的抗氧化酶反映，T-AOC、POD、SOD、GSH-Px 與CAT是抗氧化體系內(nèi)主要的抗氧化酶。T-AOC 是魚類抗氧化能的總體表現(xiàn)，其活性大小在一定程度上反應(yīng)了機體抗氧化能力的強弱，POD 可與SOD、CAT 相互協(xié)調(diào)配合，清除體內(nèi)過剩的自由基[32]。類似地，GR 也可清除生物體內(nèi)活性氧，還能催化氧化型谷胱甘肽與還原型谷胱甘肽兩者間的相互轉(zhuǎn)化，是產(chǎn)生谷胱甘肽(GSH)的關(guān)鍵酶，而GSH-Px則是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，主要是催化GSH參與過氧化反應(yīng)，清除在細(xì)胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物，在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷過程中起著關(guān)鍵作用[33]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量直接反映了脂質(zhì)過氧化的速率和強度，間接反映了機體清除自由基的能力。本試驗結(jié)果表明，當(dāng)絲尾鳠幼魚飼料中扣除Met后，其抗氧化功能呈現(xiàn)出整體下降的趨勢，所以Met的缺乏會造成絲尾鳠幼魚抗氧化功能的下降。

3.5 不同飼料處理對絲尾鳠魚體組成的影響

本試驗結(jié)果顯示，當(dāng)扣除Met后，魚體水分含量顯著升高；相反地，扣除Met 后魚體粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的含量則顯著降低。研究表明，飼料中Met 不足時會使中華鱉[34]的粗脂肪含量下降，曾雯娉等[35]對凡納濱蝦的研究也發(fā)現(xiàn)其肌肉中的粗脂肪含量隨Met含量的升高呈先升后降的趨勢，這與本試驗結(jié)果相類似。但Simmons等[36]在北極嘉魚(Salvelinus alpinus)上的研究表明，隨著飼料Met含量的升高，其灰分沉積呈相反的趨勢，這與本試驗結(jié)果不同。其原因可能是由于實驗魚的種類飼料的組成不同造成的。Cai 等[37]對斑點叉尾鮰的研究也表明，當(dāng)飼料中Met含量較低時，會顯著降低其魚體粗蛋白含量，這與本試驗結(jié)果相似。類似地，Goff 等[38]對紅擬石首魚(Sciaenops ocellatus)、陳乃松等[39]對大口黑鱸(Micropterus salmoides)等的研究結(jié)果同樣顯示，在Met含量不足時會明顯降低魚體粗蛋白含量。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是由于飼料中Met 不足時，使飼料中氨基酸的組成不平衡，進(jìn)而導(dǎo)致魚類機體的蛋白質(zhì)合成功能下降，表現(xiàn)為魚體粗蛋白含量的降低。

4 結(jié)論

蛋氨酸缺乏時顯著降低了絲尾鳠幼魚的生長性能，并對絲尾鳠幼魚的消化酶活性、蛋白質(zhì)代謝和抗氧化功能造成明顯的負(fù)面影響。因此，蛋氨酸是絲尾鳠幼魚的必需氨基酸。