基于Cyt b基因的江蘇省湖鱭種群遺傳多樣性和遺傳結構分析

李大命，唐晟凱，劉燕山，谷先坤，殷稼雯，蔣琦辰，張彤晴，潘建林

（江蘇省內陸水域漁業(yè)資源重點實驗室江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017）

0 引言

湖鱭(Coilia nasustaihuensis)是一種常見的小型魚類，一般認為其是刀鱭(Coilia nasus)的淡水定居生態(tài)類型，隸屬于鯡形目、鳀亞科、鱭屬，終生生活在江河和湖泊內，與洄游型刀鱭在生態(tài)習性和形態(tài)上有一定差別[1-2]。湖鱭喜集群，游泳迅速，拓殖能力強，且具有性成熟早、繁殖率高、食性廣等特點[2-3]。近幾十年來湖鱭資源量迅速增長，逐漸成為淡水湖泊魚類群落中的絕對優(yōu)勢種群，同時也是湖泊漁業(yè)重要的捕撈對象[4-6]。目前湖鱭的研究主要集中在生長規(guī)律[7-8]、種群年齡結構[7-8]、食物組成[6,9]等基礎生物學及種群數(shù)量變動等方面[3,10]，而有關湖鱭的遺傳學資料相對缺乏。掌握物種的遺傳多樣性是物種管理保護和開發(fā)利用需要了解的重要內容，也是評價生物遺傳資源的重要依據(jù)。線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)具有相對較高的進化速率、嚴格的母性遺傳以及幾乎不存在重組等特點[11]。細胞色素b(Cytochrome b,Cyt b)基因是一段編碼蛋白質的DNA 序列，其進化速度適中，被廣泛運用于魚類遺傳多樣性和遺傳結構研究[12-14]。

迄今大部分針對魚類的群體遺傳學研究主要集中在經(jīng)濟魚類或者瀕危魚類，而對經(jīng)濟相對偏低的小型魚類的研究常被忽視[15]。一方面，湖鱭作為一種小型經(jīng)濟魚類其天然資源面臨過度開發(fā)利用、種群組成低齡化等問題[3,6]；另一方面，湖鱭占據(jù)優(yōu)勢會導致魚類群落結構向小型化發(fā)展，進而會導致漁產(chǎn)力下降及影響湖泊生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[16-17]。因此，如何科學管理和合理利用湖鱭資源，對于湖泊漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要意義。本研究采集江蘇省長江水系的太湖、滆湖及淮河水系的高郵湖、洪澤湖、白馬湖、駱馬湖共6 個湖鱭群體，以Cyt b 基因為分子標記，研究江蘇省湖鱭群體的遺傳多樣性、遺傳結構及進化歷史，以期了解湖鱭的遺傳資源現(xiàn)狀，進而為湖鱭種質資源的管理及利用提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

于2016—2018年，用刺網(wǎng)采集江蘇省長江流域的太湖、滆湖及淮河流域的高郵湖、洪澤湖、白馬湖、駱馬湖6個湖泊的湖鱭群體共計224尾個體。采樣時間、地點及樣本量見表1。將樣本用無水乙醇中固定，帶回實驗室置于-20℃低溫冰箱保存。

表1 湖鱭樣品信息

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增和序列測定

購置基因組DNA提取試劑盒，按照說明書步驟和要求提取樣品的基因組DNA，所提取的總DNA 溶于TE 溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。使用分光光度計測定DNA濃度，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗檢測DNA 的完整性。

使用通用引物L14724和H15915擴增Cyt b序列，引 物 序 列 為 L14724：5’- GACTTGAAAAACCACCGTTG- 3’，H15915：5’- CTCCGATCTCCGG ATTACAAGAC-3’[18]。PCR反應總體系為50μL，包括2×TaqMaster Mix(TaKaRa)25μL、上下游引物各1.0 μL(0.01 mmol/L)、DNA模板1.0μL，超純水補足體積。將反應液充分混勻，10000 r/min冷凍離心30 s，將反應管放入PCR 儀。PCR 反應程序為：94℃變性4 min；94℃變性40 s，53℃退火50 s，72℃延伸60 s，共35 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。用膠回收純化試劑盒將目標擴增回收純化，送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用DNAstar 軟件和Clustal X 2.0 軟件對測序結果進行序列編輯、校對和排序。使用Mega7.0 軟件統(tǒng)計堿基組成，計算群體間的遺傳距離。以大銀魚（Protosalanx hyalocranius，GenBank 登 錄 號：NC_024109.1）和鳳鱭（Coilia mystus，GenBank 登錄號：MH465026.1）為外類群，采用鄰接法(Neighborjoining,NJ)構建單倍型分子系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平應用自引導估計，重復次數(shù)為1000次。使用DNA SP 5.0 軟件計算群體的單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)。利用Arlequin 3.5軟件進行分子方差分析，估算遺傳變異在種群間和種群內的分布，計算種群間的遺傳分化指數(shù)及其P值，并采用中性檢驗以及核苷酸不配對分布來檢測種群歷史動態(tài)。使用Network 軟件構建單倍型網(wǎng)絡關系圖，檢測各個單倍型間的進化關系。

2 結果

2.1 Cyt b序列變異及種群遺傳多樣性

本研究獲得224尾樣本的Cyt b基因全序列，長度為1141 bp。224條序列共檢出62個變異位點，其中單一位點35個，簡約位點27個，沒有插入/缺失位點。堿基組成分析顯示，堿基A、T、G和C的平均含量分別為27.8%、30.6%、14.5%和27.1%，A+T 的含量(58.4%)明顯高于G+C的含量(41.6%)，表現(xiàn)出明顯的A T偏好和反G偏倚特點。

224 尾個體共定義57 種單倍型(H1～H57)，其中H49 是6 個種群的共享單倍型，也是占比最高的單倍型（表2）。滆湖、太湖、高郵湖、白馬湖、洪澤湖及駱馬湖群體分別擁有16種、17種、13種、13種、13種和8種單倍型，且每個種群都擁有數(shù)量不等的獨享單倍型。6個湖鱭種群的平均單倍型和核苷酸多樣性分別為0.783±0.028和0.00260±0.00019，其中滆湖種群的遺傳多樣性最高，駱馬湖種群的遺傳多樣性最低（表2）。

表2 基于Cyt b基因的湖鱭群體遺傳多樣性參數(shù)

2.2 種群遺傳結構分析

6個群體間的遺傳距離顯示（表3），滆湖與高郵湖群體間的遺傳距離最大，為0.00419，洪澤湖和駱馬湖群體間的遺傳距離最小，為0.00178。長江水系太湖和滆湖群體間的遺傳距離為0.00418，淮河水系4個湖鱭群體間的遺傳距離為0.00178～0.00240。

表3 湖鱭群體間的遺傳距離（對角線下方）和分化系數(shù)（對角線上方）

對湖鱭群體間的遺傳變異進行分子方差分析(AMOVA)（表4），結果表明，8.55%的變異發(fā)生在群體間，91.45%的變異發(fā)生群體內，說明分子變異主要來源于群體內個體間，群體間的Fst值統(tǒng)計檢驗具有極顯著性差異（表4）。將6 個種群分為長流水系組群（滆湖、太湖種群）和淮河水系組群（高郵湖、白馬湖、洪澤湖和駱馬湖種群），進行分子方差分析，結果表明，長江水系組群和淮河水系組群的組間分子變異占總變異的百分比為1.08%，組內群體間分子變異占7.95%，群體內分子變異占90.97%，兩組群的分子變異主要來自群體內，兩組間的Fct值統(tǒng)計檢驗無顯著性差異，組內群體間的Fsc值和群體內的Fst值統(tǒng)計檢驗有極顯著性差異（表4）。

表4 湖鱭種群間遺傳差異的分子方差分析

進一步分析兩兩種群間的遺傳分化（表3），結果顯示，滆湖群體與其他5個群體間的Fst均大于0.15，且差異極顯著(P<0.01)，表明滆湖群體與其他群體間存在極顯著遺傳差異。除滆湖群體外，其他5 個群體間的Fst均小于0.05，且差異不顯著(P>0.05)，表明5個群體間沒有顯著的遺傳分化。

2.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

以鳳鱭和大銀魚為外類群，基于鄰接法構建湖鱭Cyt b基因單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結果顯示，所有的湖鱭單倍型聚為一支，各種群的單倍型混雜分布，沒有形成與地理分布相對應的遺傳結構，只有滆湖種群的部分單倍型(H19～H25)形成了置信度較高的進化分支。利用Network軟件構建了湖鱭單倍型的進化網(wǎng)絡關系（圖2），結果顯示，單倍型H49 是6 個群體的共享單倍型，位于網(wǎng)絡進化圖中心，數(shù)量也最多，推測可能為湖鱭的祖先單倍型。各種群的單倍型并沒有按地理位置形成獨立的分支，而是以主單倍型為中心的形成星形放射狀結構。滆湖群體的部分特有單倍型(H19～H25)與祖先單倍型相距較遠，形成了相對獨立的進化分支。單倍型網(wǎng)絡結構圖進一步支持了分子系統(tǒng)發(fā)生樹。

圖1 基于Cyt b序列構建的湖鱭單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 湖鱭的Cyt b基因單倍型進化網(wǎng)絡圖

2.4 種群歷史動態(tài)分析

對湖鱭群體進行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗分析，結果顯示，滆湖群體的Tajima’sD和Fu’sFs中性檢測值為負值，但統(tǒng)計檢驗均不顯著；其他5個群體的中性檢測值為負值，且統(tǒng)計檢驗有顯著或極顯差異（表5）。歧點分布圖分析顯示，滆湖群體的歧點分布圖呈多峰型，其他5個群體的歧點分布圖呈單峰型（圖3）。由此可以推測，除滆湖群體外，其他5個群體進化過程中經(jīng)歷過種群擴張。將6個群體作為一個整體進行分析，結果顯示，歧點分布圖呈單峰型（圖3），中性檢測值為負值且有極顯著性差異（表5），表明湖鱭群體在歷史上經(jīng)歷了顯著的種群擴張。

圖3 湖鱭種群Cyt b基因序列的歧點分布圖

表5 基于Cyt b基因的湖鱭群體中性檢驗及種群擴張時間估算

根據(jù)種群的擴張參數(shù)τ來估算群體的擴張時間，線粒體DNA的蛋白質編碼基因變異速率為2%每百萬年[19]。經(jīng)計算，太湖、白馬湖和駱馬湖種群的擴張發(fā)生在約0.11 百萬年前，高郵湖種群的擴張發(fā)生在約0.12百萬年前，洪澤湖種群的擴張發(fā)生在約0.13 百萬年前。整個湖鱭種群的擴張發(fā)生在約0.23百萬年前（表4）。

3 討論

3.1 湖鱭種群遺傳多樣性分析

在線粒體的眾多基因中，Cyt b 基因進化速度適中，轉換或顛換比例較大，被廣泛應用于魚類系統(tǒng)發(fā)育及遺傳多樣性研究。本研究對6 個湖鱭群體的Cyt b基因進行PCR擴增和測序，分析群體間序列組成及變異。結果顯示，所有序列共發(fā)現(xiàn)62 個變異位點，變異率為5.43%。湖鱭群體的Cyt b 序列堿基組成基本一致，其中AT的含量(58.4%)明顯高于GC含量(41.6%)，而堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的AT偏好性。

單倍型多樣度(h)和核苷酸多樣度(π)是衡量物種或種群線粒體DNA變異程度的2個重要指標，其值越大，表明群體的遺傳多樣性就越高[20]。本研究通過Cyt b 基因對江蘇省6 個湖泊湖鱭群體進行遺傳多樣性分析，結果顯示，6個群體的單倍型多樣性為0.717±0.060～0.875 ± 0.044，核 苷 酸 多 樣 性 為0.00180 ±0.00034～0.00425±0.00033，6個群體總體單倍型和核苷酸多樣性分別為0.783±0.028 和0.00260±0.00019。Grant 和Bowen 以單倍型多樣性0.5 為臨界值、核苷酸多樣性0.005 為臨界值將單倍型多樣性和核苷酸多樣性之間的關系分為4種類型：低h(<0.5)和低π(<0.005)；高h和低π；低h和高π；高h和高π?？梢钥闯?，湖鱭種群的遺傳多樣性屬于第二種類型，具有較高的單倍型多樣性，表明湖鱭種群具有較豐富的遺傳多樣性，這可能與湖鱭的棲息生境及種群大小有密切關系。湖鱭性成熟早、繁殖率高、食性廣、游泳迅速、適應能力強，具有廣闊的生存空間，形成了種群數(shù)量龐大的群體，奠定了湖鱭具有豐富遺傳多樣性的基礎。Ma 等[21]報了國內其他湖泊湖鱭群體的遺傳多樣性，如巢湖、洞庭湖、鄱陽湖等群體也都顯示了較豐富的遺傳多樣性。種群遺傳多樣性形成與進化歷史密切相關，種群具有高h和低π可能受到瓶頸效應的影響[20]。一般來說，種群受遭遇瓶頸效應后數(shù)量迅速增加，導致種群單倍型多樣性迅速升高，由于核苷酸多樣性的積累時間遠大于單倍型多樣性，因此核苷酸多樣性仍處于較低水平。一般用Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗推測種群的歷史動態(tài)，當中性檢驗結果為負值，并且在統(tǒng)計學上有顯著性差異，可能預示著種群經(jīng)歷過一個擴張的歷史[22-23]。本研究結果顯示，湖鱭群體的Tajima’sD和Fu’sFs中性檢測結果均為負值，統(tǒng)計檢驗均有顯著或極顯著差異，這說明湖鱭種群進化過程中偏離了中性選擇，經(jīng)歷了種群擴張，進而形成了高h和低π的遺傳多樣性模式。

3.2 湖鱭種群遺傳結構分析

遺傳分化指數(shù)Fst是反映群體遺傳組成的重要參數(shù)，F(xiàn)st值越大則表示遺傳分化程度越大。Freeland等[24]提出，以Fst值0.05、0.15和0.25為臨界值指示遺傳分化程度。本研究中，未分組的AMOVA結果顯示，湖鱭總的Fst值為0.08553，且具有極顯著差異，表明種群間有顯著遺傳分化。而分組的AMOVA 結果顯示，組間的Fct為0.01084(P>0.05)，表明組間無顯著遺傳差異，組內種群間的Fsc值為0.08035，種群內的Fst值為0.09032，且都具有極顯著差異，表明湖鱭組內種群間及種群內均有顯著遺傳分化。兩兩群體間的Fst統(tǒng)計結果表明，滆湖群體與其他群體間的Fst值均大于0.15，且統(tǒng)計檢驗具有極顯著性差異。除滆湖群體外，其他5 個群體間Fst值為-0.01588～0.01533，且統(tǒng)計檢驗沒有顯著性差異?？梢缘贸?，滆湖群體與其他群體間具有顯著遺傳分化，而其他群體間無遺傳分化。同時，Cyt b 基因單倍型的分子系統(tǒng)進化樹顯示，6 個群體的單倍型沒有聚成各自的分支，單倍型間的聚類關系沒有與群體地理位置形成對應關系，僅有滆湖的部分單倍型形成了獨立的進化分支，系統(tǒng)進化樹支持群體間的遺傳關系。

太湖和滆湖位于長江以南同屬長江流域；高郵湖、白馬湖、洪澤湖和駱馬湖位于長江以北均屬淮河流域。滆湖與太湖群體間有極顯著的遺傳分化，而太湖群體與淮河流域的4 個群體間沒有顯著遺傳差異，表明湖鱭群體的遺傳結構與群體所處水系及地理位置的遠近沒有相關性。而Ma 等[21]對中國4 個水系的10 個湖鱭種群的遺傳多樣性和遺傳結果進行分析，發(fā)現(xiàn)地理距離是導致的種群遺傳分化的主要因素。通常情況下，同一水系內群體間有廣泛的基因交流，群體間不會出現(xiàn)遺傳分化或遺傳分化較?。坏乩砭嚯x越大，基因交流的概率會隨之減小，更容易出現(xiàn)遺傳分化[25-27]。但地理距離與遺傳關系不相關的現(xiàn)象在魚類中也有較多報道[28-29]。湖鱭種群的遺傳結構可能與種群的棲息環(huán)境、水利工程及種群歷史動態(tài)等因素有關。首先，6 個湖泊的生態(tài)環(huán)境及水文有較大差異，不利于魚類之間的基因交流。其次，由于興建了大量的水利工程，直接阻礙了湖泊及水系間魚類的基因交流。滆湖與其他湖泊沒有直接的水道連接或連接水道受阻，而其他湖泊通過京杭大運河連通，促進了湖泊間魚類種群的擴散和基因交流[30]。最后，在種群進化過程中，滆湖種群較為穩(wěn)定，沒有發(fā)生顯著的種群擴張，而其他湖泊種群均經(jīng)歷了顯著的種群擴張過程，種群擴張過程促進了種群間的基因擴散，有利于消除種群間的遺傳差異。

3.3 湖鱭種質資源管理和利用建議

目前，湖鱭已成為江蘇省淡水湖泊魚類群落中的優(yōu)勢種群，也是漁業(yè)生產(chǎn)中的重要捕撈對象。同時也面臨資源過度開發(fā)利用、種群組成趨于低齡化等問題。本研究結果顯示，江蘇省6 個湖鱭種群遺傳多樣性較為豐富，均具有高單倍型多態(tài)性和低核苷酸多態(tài)性的特征。滆湖種群的遺傳多樣性最豐富，擁有的私有單倍型最多，且與其他種群之間具有顯著的遺傳分化，應將滆湖群體單獨作為一個進化顯著單元進行管理和利用，其他5 個群體作為一個整體進行管理和利用。一方面，需要嚴格控制湖泊漁業(yè)資源的捕撈強度，禁止對湖鱭資源過度開發(fā)利用，可通過增大漁具網(wǎng)目尺寸和提高開捕年齡來改善湖鱭種群年齡組成。另一方面，可通過適量增殖放流肉食性的翹嘴鲌、鱖等魚類，控制湖鱭種群數(shù)量，優(yōu)化湖泊魚類群落結構，促進湖泊漁業(yè)資源可持續(xù)健康發(fā)展。

4 結論

總之，江蘇省6 個湖泊湖鱭群體的遺傳多樣性比較豐富，且呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低和低核苷酸多樣性的特點，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.717 ± 0.060～0.875 ± 0.044 和0.00180 ± 0.00034～0.00425±0.00033，在進化過程中，滆湖群體較為穩(wěn)定，沒有發(fā)生顯著的種群擴張，而其他群體則經(jīng)歷了明顯的種群擴張過程，這也是導致滆湖群體與其他群體產(chǎn)生遺傳分化的因素之一。滆湖群體與其他群體間的Fst值均大于0.15，且統(tǒng)計檢驗具有極顯著性差異(P<0.01)，滆湖群體與其他群體間具有極顯著的遺傳分化，因此應將滆湖群體與其他群體作為不同的進化顯著單元進行管理和利用。