紅霉素對(duì)聚甲基丙烯酸甲酯磨損顆粒刺激下MC3T3-E1細(xì)胞成骨作用的影響

劉子歌，張 晨，宋國(guó)瑞，王 強(qiáng)，郭高鵬，陳德勝

人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)是全關(guān)節(jié)置換術(shù)的主要并發(fā)癥之一，其主要是由于體內(nèi)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞對(duì)磨損顆粒的生物學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的。限制假體周圍骨溶解的方法大多專注于抑制假體周圍炎癥和破骨細(xì)胞形成。最新的研究表明成骨細(xì)胞在這個(gè)過程中也發(fā)揮了重要的作用[1-3]。骨祖細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞都可以分化為成骨細(xì)胞，它們與假體周圍磨損顆粒的相互作用對(duì)于人工假體的初始骨整合和假體周圍骨的長(zhǎng)期形成都是十分重要的。有研究表明，磨損顆粒還可以通過破壞骨祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨潛能來促進(jìn)骨溶解[4]。由于骨重建依賴于成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收之間的平衡，抑制成骨細(xì)胞的產(chǎn)生可以使平衡向加速溶骨的方向傾斜。紅霉素是一種十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，用于治療感染性疾病已有50多年的歷史，具有良好的抗炎作用。Kudoh等[5]在1998年就證明了紅霉素可以用于彌漫性全細(xì)支氣管炎的抗炎治療。還有研究表明，紅霉素通過抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮抗炎作用[6]。本課題組的前期研究顯示NF-κB在磨損顆粒誘導(dǎo)的炎性骨溶解中有重要作用，鑒此認(rèn)為紅霉素是治療人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體無菌性松動(dòng)的潛在候選藥物[7]。本研究旨在探討紅霉素對(duì)聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)磨損顆粒刺激下MC3T3-E1細(xì)胞成骨作用的影響及其潛在的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 MC3T3-E1細(xì)胞，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷與修復(fù)研究中心贈(zèng)送。PMMA磨損顆粒，由日本島根大學(xué)附屬醫(yī)院矯形外科贈(zèng)送，直徑均<10 μm，按本課題組的前期方法進(jìn)行處理并檢測(cè)內(nèi)毒素，確保能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[8]。α-MEM培養(yǎng)基、DMSO、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gbico公司。紅霉素購(gòu)自美國(guó)MCE公司，純度>99.00%。β-甘油磷酸鈉(sodium β-glycerophosphate)、L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)購(gòu)自美國(guó)Apexbio公司。鱟內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司。乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara生物公司。

1.2成骨細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法 取MC3T3-E1細(xì)胞解凍復(fù)蘇，離心棄上層凍存液，以含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，培養(yǎng)基成分為含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基+10 mM β-甘油磷酸鈉+50 μg/ml L-抗壞血酸。在添加PMMA磨損顆粒(1 mg/ml)之前，采用不同濃度(0.0 μg/ml、0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml)的紅霉素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理2 h；以未經(jīng)PMMA和紅霉素處理的MC3T3-E1細(xì)胞作為空白對(duì)照組。每個(gè)處理組做3個(gè)復(fù)孔，每3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.3MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性檢測(cè)方法 應(yīng)用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的乳酸脫氫酶進(jìn)行檢測(cè)，以反映細(xì)胞增殖活性。收集經(jīng)PMMA磨損顆粒(1 mg/ml)與不同濃度紅霉素干預(yù)組處理72 h后的上清培養(yǎng)液，各組取100 μl培養(yǎng)基至96孔板中，與100 μl的工作溶液混合，避光室溫孵育30 min。采用E2500全波長(zhǎng)自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm的吸光度值。細(xì)胞增殖活性(%)=(干預(yù)組吸光度-空白對(duì)照組吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-空白對(duì)照組吸光度)×100%。

1.4MC3T3-E1細(xì)胞成骨活性檢測(cè)方法 應(yīng)用堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的堿性磷酸酶進(jìn)行檢測(cè)，以反映細(xì)胞成骨活性。按照分組處理細(xì)胞，MC3T3-E1細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，以4 ℃磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)輕輕沖洗2遍，RIPA裂解細(xì)胞，離心，收集細(xì)胞裂解蛋白產(chǎn)物。嚴(yán)格按照試劑盒說明書配置標(biāo)準(zhǔn)樣品，設(shè)置空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，在37 ℃生物孵育箱中孵育30 min。每孔加入100 μl終止液，使用E2500全波長(zhǎng)自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔405 nm的吸光度值。

1.5實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)方法 按照分組處理細(xì)胞，MC3T3-E1細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR，測(cè)定目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，所用引物由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見表1。以2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1各處理組MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性比較 與空白對(duì)照組比較，其他處理組MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置紅霉素和PMMA顆粒濃度條件對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性沒有造成影響。見圖1。

圖1 各處理組MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性圖

2.2各處理組MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶濃度比較 與空白對(duì)照組相比，經(jīng)PMMA處理組的細(xì)胞堿性磷酸酶濃度均顯著降低(P<0.05)。而加入濃度為0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml紅霉素進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞堿性磷酸酶濃度升高，呈劑量依賴性，且PMMA+1.0 μg/ml紅霉素組、PMMA+5.0 μg/ml紅霉素組、PMMA+10.0 μg/ml紅霉素組的細(xì)胞堿性磷酸酶濃度均顯著高于PMMA組(P<0.05)。見圖2。

與空白對(duì)照組比較，#P<0.05；與PMMA組比較，*P<0.05圖2 各處理組MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶濃度比較圖

2.3各處理組MC3T3-E1細(xì)胞成骨基因表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組相比，PMMA組Runx2、Osterix、OCN的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而p65表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。經(jīng)0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml紅霉素處理后，MC3T3-E1細(xì)胞p65表達(dá)水平較PMMA組顯著降低(P<0.05)。經(jīng)1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml紅霉素處理后，MC3T3-E1細(xì)胞Runx2、OCN表達(dá)水平較PMMA組顯著上升(P<0.05)，而0.2 μg/ml紅霉素處理后MC3T3-E1細(xì)胞Runx2、OCN表達(dá)水平與PMMA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)5.0 μg/ml和10.0 μg/ml紅霉素處理后，MC3T3-E1細(xì)胞Osterix表達(dá)水平較PMMA組顯著上升(P<0.05)，而0.2 μg/ml、1.0 μg/ml紅霉素處理后MC3T3-E1細(xì)胞Osterix表達(dá)水平與PMMA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。紅霉素干預(yù)對(duì)Runx2、Osterix、OCN和p65表達(dá)水平的恢復(fù)均呈劑量依賴性。見表2。

表2 各處理組MC3T3-E1細(xì)胞成骨基因表達(dá)水平比較

3 討論

3.1人體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換是由破骨細(xì)胞性骨吸收和成骨細(xì)胞性骨形成之間的微妙平衡決定的。雖然激活的巨噬細(xì)胞和活化的破骨細(xì)胞是假體周圍骨溶解中骨破壞的主要因素，但磨損顆粒對(duì)成骨細(xì)胞的影響也會(huì)顯著降低假體界面處的骨形成。有研究表明，磨損顆粒還會(huì)影響骨祖細(xì)胞的增殖、成熟和分化，通過減少骨形成促進(jìn)骨溶解過程[9]。許多類型的人工關(guān)節(jié)假體磨損顆粒會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞的活性、增殖能力和功能產(chǎn)生影響，如鈦顆粒、超高分子量聚乙烯、陶瓷顆粒和PMMA磨損顆粒等[10-11]。本研究結(jié)果提示，紅霉素干預(yù)處理后可顯著降低PMMA磨損顆粒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞骨生成的抑制作用。

3.2Chiu等[12]報(bào)道PMMA磨損顆粒可抑制MC3T3-E1細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，且呈劑量依賴性。本研究結(jié)果也顯示，1 mg/ml的PMMA磨損顆粒即可對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶的濃度產(chǎn)生明顯的抑制作用，而紅霉素干預(yù)可減輕PMMA磨損顆粒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶造成的影響。OCN是成骨細(xì)胞終末分化的標(biāo)志物[13]。本研究結(jié)果提示紅霉素對(duì)PMMA磨損顆粒誘導(dǎo)的OCN基因表達(dá)下調(diào)有一定的緩解作用。另外，成骨細(xì)胞分化還受到轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的調(diào)控[14-15]。Runx2可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，如堿性磷酸酶和OCN。在成熟的成骨細(xì)胞中，Osterix位于Runx2的下游。本研究發(fā)現(xiàn)紅霉素干預(yù)可改善PMMA磨損顆粒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞造成的Runx2和Osterix表達(dá)下調(diào)。然而PMMA磨損顆粒對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制尚不十分清楚。

3.3目前，已有許多研究證實(shí)了NF-κB信號(hào)通路對(duì)破骨細(xì)胞形成的作用，但其對(duì)成骨細(xì)胞和骨形成的作用仍不明確[16-19]。本研究結(jié)果顯示，PMMA磨損顆粒干預(yù)可顯著增加MC3T3-E1細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路中p65的表達(dá)。PMMA磨損顆粒誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路活化的機(jī)制可能是多因素的。本研究發(fā)現(xiàn)，0.2 μg/ml的紅霉素即可改善PMMA磨損顆粒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的刺激作用，降低p65的表達(dá)水平。因此推測(cè)紅霉素是通過抑制NF-κB信號(hào)通路而緩解PMMA磨損顆粒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞Runx2和Osterix的下調(diào)作用，從而部分恢復(fù)堿性磷酸酶濃度。NF-κB信號(hào)通路激活與慢性炎癥、自身疾病以及癌癥密切相關(guān)[20]。筆者認(rèn)為紅霉素的抗炎作用可以在一定程度上減少炎癥細(xì)胞因子對(duì)成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞前體的抑制作用，這部分是通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活來實(shí)現(xiàn)的。但是需要更多的實(shí)驗(yàn)證明成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞前體中NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與Runx2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的相互作用。

綜上所述，紅霉素干預(yù)可減輕PMMA磨損顆粒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞分化的抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。但是對(duì)于其他類型的磨損顆粒，紅霉素是否依然能夠展現(xiàn)出相似的作用仍有待進(jìn)一步研究。紅霉素可能是改善骨水泥相關(guān)假體的骨溶解和無菌性松動(dòng)的一種潛在治療藥物。