基于IL-17A/TNF-a信號(hào)通路的桔梗湯有效部位群干預(yù)COPD模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究＊

張超云，李宏藝，郝鵬飛，高 麗，張仲鳴＊＊

（1.南陽理工學(xué)院/河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南陽473000；2.南陽仲景百信醫(yī)藥科技有限公司 南陽473000）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Diseases，以下簡(jiǎn)稱COPD），主要以氣道不完全可逆性氣流受限為特征，并可伴有氣道高反應(yīng)性，常與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1,2]，臨床病例研究表明，該病具有進(jìn)展迅速、預(yù)后不良、致死率高的特點(diǎn)，因此COPD一直是呼吸系統(tǒng)重點(diǎn)研究的方向之一。國內(nèi)外的研究表明，輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，以下簡(jiǎn)稱Th17）及其特異性細(xì)胞因子在COPD的發(fā)病過程充當(dāng)重要角色，參與介導(dǎo)COPD產(chǎn)生及進(jìn)展過程中多個(gè)環(huán)節(jié)，尤以白細(xì)胞介素17（Interleukin 17，以下簡(jiǎn)稱IL-17A）、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor-α，以下簡(jiǎn)稱TNF-α）、干擾素-α（Interferon-α，以 下 簡(jiǎn) 稱IFN-α）、干 擾 素-β（Interferon-β，以下簡(jiǎn)稱IFN-β）對(duì)于肺臟局部的炎癥、自噬、纖維化等方面發(fā)揮重要作用，由于IL-17A、TNF-α、IFN-α、IFN-β等各類特異性細(xì)胞因子的異常高表達(dá)，加深加重了患者肺部病理變化，推進(jìn)了COPD的發(fā)病進(jìn)程[3-5]。也因此臨床上常以藥物對(duì)該類細(xì)胞因子是否具有調(diào)控能力，作為判斷防治COPD是否有效的標(biāo)準(zhǔn)之一。

桔梗湯為《傷寒論》經(jīng)方，方中主藥桔梗為南陽“八大宛藥”之一，俗稱“桐桔?！保瑸樗幨惩雌贩N，近些年以桔梗為主的方劑依然保持了很高的使用頻率，其與甘草配伍，主治肺癰，根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，肺癰包含了部分COPD，因此現(xiàn)代臨床也將該方用于COPD的預(yù)防與治療，但截至目前，對(duì)于桔梗湯治療COPD的研究均淺嘗輒止，僅僅停留在理論討論層面，尚未有更加深入的探討。有鑒于此，本課題擬以桔梗湯治療COPD為切入點(diǎn)，深入研究桔梗湯治療COPD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及具體作用機(jī)制；而本文則是基于這樣的背景，充分考慮了中藥復(fù)方有效部位的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展，參考了目前其它類似研究的方法[6]，結(jié)合該方臨床功效和應(yīng)用，在前期分離所得桔梗湯總皂苷、桔梗湯總多糖、桔梗湯總黃酮等不同部位基礎(chǔ)上[7]，分別考察上述部位調(diào)控IL-17A、TNF-α、IFN-α、IFN-β等相關(guān)因子的作用，從而篩選桔梗湯防治COPD的有效部位，敲除無效部位，為桔梗湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及微觀配伍機(jī)理研究提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

方中中藥飲片由南陽仲景百信醫(yī)藥科技有限公司提供，并由南陽理工學(xué)院中藥教研室李超博士鑒定，桔梗（Platycodon grandiflorus（Jacq.）A.DC）、甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）兩味藥材均為2015版《中國藥典》收載品種。其中桔梗湯總皂苷、桔梗湯總多糖、桔梗湯總黃酮均為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大鼠40只，清潔級(jí)，雌雄各半，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量180±20 g，許可證號(hào)為SCXK（豫）2017-0001。隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為生理鹽水組、模型組以及桔梗湯總皂苷組、桔梗湯總多糖組、桔梗湯總黃酮組。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

乙醇、石蠟、二甲苯購自陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司；水合氯醛購自武漢博士德生物工程有限公司；精制脂多糖（Lipopolysaccharide，以下簡(jiǎn)稱LPS）購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；IFN-α、IFN-β、IL-17A檢測(cè)試劑盒、TNF-α試劑盒購自南京建成生物工程研究所；帝豪香煙（河南中煙工業(yè)公司許昌卷煙廠，焦油量11 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量11 mg）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

自制煙熏箱（自制，亞克力玻璃）；752-分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma 2mk型）；顯微鏡（日本OLYMPUS）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司DNM-9802型）；電泳儀（美國Bio-rad公司）；FSH-2型可調(diào)高速勻漿器（金壇市恒豐儀器廠）；WKY型微量移液器（德國艾本德）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 COPD大鼠模型制作

參照宋一平[8]等經(jīng)典的大鼠COPD模型構(gòu)建方法，除了生理鹽水組之外，模型組、桔?？傇碥战M、甘草總皂苷組及甘草總黃酮組大鼠均采用相同模型構(gòu)建方法復(fù)制COPD大鼠模型，造模時(shí)間總計(jì)為42天。大鼠放入密閉煙熏箱（自制）內(nèi)，每天對(duì)大鼠進(jìn)行煙熏3次，每次20支香煙，每次煙熏時(shí)間各30 min，每次間隔6 h。第1天、第15天在大鼠氣管內(nèi)分別注入200 μL脂多糖（LPS，1 μg·μL-1），輕輕晃動(dòng)，使注入的藥物有效地分布于大鼠支氣管粘膜的內(nèi)表面，生理鹽水組大鼠氣管內(nèi)注入200 μL生理鹽水。

2.2 給藥方法

從造模的第15天開始，桔梗湯總皂苷組、桔梗湯總多糖組、桔梗湯總黃酮組大鼠分別按照375 mg/kg/d、725 mg/kg/d、165 mg/kg/d灌胃（相當(dāng)于成人10倍原方常用劑量，成人體重按60 kg計(jì)算），模型組和生理鹽水組每天給予同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)28天。

2.3 血清制備方法

給藥結(jié)束后，各組大鼠以10%水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈下端采血，每只大鼠取血約5 mL，靜置2 h后離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存待測(cè)。

2.4 大鼠一般情況觀察

造模及用藥期間每日觀察大鼠的呼吸情況，咳嗽、氣喘、活動(dòng)狀況、毛發(fā)光澤等，記錄體重變化等情況。數(shù)據(jù)使用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2.5 COPD大鼠肺組織病理學(xué)觀察

取氣管與右側(cè)下葉肺組織，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片（厚度3 um）。采用二甲苯脫蠟，然后進(jìn)行蘇木素染色，用流動(dòng)的清水沖洗，經(jīng)鹽酸酒精分化，最后用蒸餾水沖洗，最后分別用100%、95%、80%、75%、50%的乙醇逐層脫水，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，烘干，光學(xué)顯微鏡下病理觀察[7]。并對(duì)染色病理切片的支氣管壁厚度進(jìn)行檢測(cè)，在每張病理切片上隨機(jī)選擇氣管橫切直徑在200~300 um范圍內(nèi)氣管5支，測(cè)定各組大鼠氣管壁厚度。數(shù)據(jù)使用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2.6 ELISA法測(cè)定COPD大鼠血清中IL-17A、TNFa、IFN-a、IFN-β含量

參照酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，以下簡(jiǎn)稱ELISA）[9]，取出大鼠血清冷凍樣本，室溫解凍。每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或待測(cè)樣品100 μL，37℃恒溫箱中溫育2 h，吸水紙拍干；每孔分別加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL，再次37℃恒溫箱中溫育1h，洗板液洗板3次，并吸水紙拍干；然后每孔加入底物工作液100 μL，置37℃恒溫箱中閉光顯色反應(yīng)30 min；最后每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)。在450 nm讀取吸光值（A），然后繪制出A450 nm對(duì)細(xì)胞因子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品A450 nm值，按照此步驟分別測(cè)定大鼠血清中IL-17A、TNF-a、IFN-a、IFN-β濃度。以上數(shù)據(jù)均使用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，并利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 桔梗不同部位對(duì)COPD大鼠一般情況及體重影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

生理鹽水組大鼠毛發(fā)柔順光滑有色澤，活動(dòng)能力較強(qiáng)，無咳嗽、氣喘等癥狀，進(jìn)食進(jìn)水正常，體重增長明顯；COPD模型組大鼠毛發(fā)暗淡沒有光澤，前期躁動(dòng)不安，后期精神萎靡，個(gè)別大鼠四肢癱軟，有明顯的咳嗽、氣喘、打噴嚏等癥狀，呼吸急促，伴隨腹肌抽搐，進(jìn)食減少，進(jìn)水增加，體重增長緩慢。桔梗湯不同部位組干預(yù)之后，總皂苷組和總黃酮組癥狀發(fā)展趨勢(shì)向好，總多糖組無顯著改善，以總皂苷組改善最明顯，主要表現(xiàn)為咳嗽、氣喘等癥狀改善，打噴嚏次數(shù)減少，呼吸明顯平穩(wěn)，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)柔順且漸有光澤，體重有一定增加等。

各組大鼠體重變化如表1所示，模型組與生理鹽水組比較有顯著性差異（P<0.05），桔梗湯總皂苷組與總黃酮組和模型組比較均有顯著性差異（P<0.05），桔梗湯總多糖組與模型組比較無顯著性差異。此指標(biāo)可初步排除桔梗湯總多糖組。

表1 不同組別大鼠體重變化（n=8,x±s，t檢驗(yàn)）

3.2 桔梗湯不同部位對(duì)COPD大鼠肺組織病理學(xué)改變及氣管壁厚度影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠肺組織HE染色之后，顯微鏡下觀察結(jié)果如下：生理鹽水組大鼠支氣管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，支氣管壁光滑，形態(tài)清晰，無異常分泌物，黏膜無充血水腫；模型組大鼠支氣管柱狀上皮細(xì)胞倒伏并有部分脫落，杯狀細(xì)胞增多，大量炎性細(xì)胞分泌，黏膜充血水腫，支氣管平滑肌增厚，肺泡擴(kuò)張；桔梗湯總皂苷組和總黃酮組與模型組比較，支氣管壁及支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤均有所減少，已無明顯的上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增生亦明顯減少，肺泡擴(kuò)張不明顯；桔梗湯總多糖組與模型組比較無明顯變化（圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織病理切片（HE染色，200×）

各組大鼠氣管壁厚度變化如表2所示，模型組與生理鹽水組比較有顯著性差異（P<0.05），表明COPD模型建立成功；經(jīng)過4周給藥后，桔梗湯總皂苷組、總黃酮組與模型組比較均有顯著性差異（P<0.05），表明桔梗湯總皂苷、總黃酮可顯著降低COPD模型大鼠的氣管壁厚度，而經(jīng)桔梗湯總多糖治療后的COPD大鼠氣管壁厚度與模型組比較無顯著性差異，表明桔梗湯總多糖不能改善COPD模型大鼠的氣管壁厚度。

表2 不同組別大鼠氣管壁厚度（n=8,x±s，t檢驗(yàn)）

3.3 桔梗湯不同部位對(duì)COPD大鼠血清IL-17A含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠血清IL-17A含量如表3所示，模型組與生理鹽水組比較有顯著性差異（P<0.05），表明COPD模型大鼠血清中IL-17A含量異常增高；經(jīng)給藥治療后，桔梗湯總皂苷組、總黃酮組和模型組比較均呈顯著下降的趨勢(shì)（P<0.05），表明桔梗湯總皂苷與總黃酮可干預(yù)COPD大鼠血清中IL-17A含量；而桔梗湯總多糖組與模型組比較無顯著性差異，即桔梗湯總多糖不能改善COPD大鼠血清中IL-17A異常增高的癥狀。

表3 不同組別大鼠血清中IL-17A含量（n=8,x±s，t檢驗(yàn)）

3.4 桔梗湯不同部位對(duì)COPD大鼠血清TNF-a水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠血清TNF-a水平如表4所示，模型組與生理鹽水組相比顯著升高（P<0.05），桔梗湯總皂苷組、總黃酮組和模型組比顯著下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），桔梗湯總多糖組與模型組比較無顯著性差異，即桔梗湯總多糖不能降低COPD大鼠異常升高的TNF-a水平。

表4 不同組別大鼠血清中TNF-a水平（n=8,x±s，t檢驗(yàn)）

3.5 桔梗湯不同部位對(duì)COPD大鼠血清IFN-α水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠血清IFN-α水平如表5所示，模型組與生理鹽水組比較有顯著性差異（P<0.05），桔梗湯總皂苷組、總黃酮組和模型組比較均有顯著性差異（P<0.05），桔梗湯總多糖組與模型組比較無顯著性差異。

3.6 桔梗湯不同部位對(duì)COPD大鼠血清IFN-β水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組大鼠血清水平如表5所示，模型組與生理鹽水組比較有顯著性差異（P<0.05），桔梗湯總皂苷組、總黃酮組和模型組比較均有顯著性差異（P<0.05），桔梗湯總多糖組與模型組比較無顯著性差異。

表5 不同組別大鼠血清中IFN-a水平（n=8，x±s，t檢驗(yàn)）

表6 不同組別大鼠血清中IFN-β水平（n=8，x±s，t檢驗(yàn)）

4 討論

COPD病因病機(jī)比較復(fù)雜，臨床治療周期較長，預(yù)后不夠理想，已然成為世界范圍內(nèi)致殘率和死亡率較高的主要疾病之一，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)社會(huì)負(fù)擔(dān)[10]。近年來研究表明，COPD的病機(jī)是遺傳因素-環(huán)境因素經(jīng)過一系列復(fù)雜的相互作用而形成的結(jié)果，這些致病因素會(huì)引起氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥，氣道炎癥是造成COPD氣道重塑的主要原因。當(dāng)肺部暴露在各種氧化應(yīng)激因子下，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺部聚集，其中Th17細(xì)胞是此過程中的強(qiáng)大推手，主要由它分泌產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子可有效介導(dǎo)氣道炎癥、細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞平衡等，從而有力推進(jìn)COPD的產(chǎn)生及進(jìn)展[11]。

國內(nèi)外諸多研究表明，Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子是IL-17，而IL-17作為誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)子，主要可通過促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞釋放前炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而放大局部炎癥反應(yīng)，如：IL-17與相應(yīng)受體結(jié)合后，可通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子kB（Nuclear factor kB，NF-kB）途徑發(fā)揮其促炎、募集中性粒細(xì)胞、激發(fā)自身免疫等生物學(xué)作用[12]；還可通過死亡結(jié)構(gòu)域蛋白通路（TNF receptor associated death domain，TRADD）參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13,14]。此外，IL-17引發(fā)的促炎反應(yīng)中，可進(jìn)一步催化TNF-a、IFN-a、IFN-β的分泌，而這些炎癥誘導(dǎo)因子又可作為其他受體蛋白/細(xì)胞的炎癥啟動(dòng)信號(hào)，從而開啟炎癥-損傷-炎癥的惡性循環(huán)，最終推動(dòng)COPD不斷進(jìn)展[15,16]（圖2）。綜上，遏制異?；钴S的Th17細(xì)胞，控制其分泌的細(xì)胞因子IL-17，是預(yù)防治療COPD的重要抓手，而TNF-a、IFN-a、IFN-β等相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，又可作為評(píng)判COPD是否有效的重要指標(biāo)[17,18]。

圖2 IL-17信號(hào)通路示意圖

在本文中，COPD模型組大鼠肺部結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著病變，主要表現(xiàn)為氣道粘膜炎癥因子浸潤、氣管壁重塑、黏膜充血水腫及肺泡壁變薄等情況，另外COPD大鼠血清中IL-17A、TNF-α、IFN-α和IFN-β的表達(dá)顯著高于生理鹽水組（P<0.05），對(duì)于這些病理性改變，桔梗湯總皂苷及桔梗湯總黃酮均可顯著改善，使COPD大鼠的支氣管壁光滑，形態(tài)清晰，無異常分泌物，黏膜無充血水腫，并顯著降低大鼠血清中IL-17A、TNF-α、IFN-α和IFN-β的表達(dá)；桔梗湯總多糖在上述方面的作用并不顯著（圖3），因此桔梗湯中防治COPD的有效部位群可能是桔梗湯總皂苷和桔梗湯總黃酮。

圖3 各組大鼠血清中IL-17A、TNF-a、IFN-a、IFN-β的含量

綜上，本論文首次將桔梗湯分成桔梗湯總皂苷、桔梗湯總多糖和桔梗湯總黃酮等不同部位，基于IL-17A/TNF-a信號(hào)通路，通過觀察體重變化、肺組織病理切片、IL-17A表達(dá)、TNF-a表達(dá)、IFN-α表達(dá)和IFN-β表達(dá)等相關(guān)指標(biāo)，分別考察不同部位對(duì)COPD大鼠模型的治療作用。結(jié)果表明：桔梗湯總皂苷組和桔梗湯總黃酮組均可以不同程度的抑制炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子、改善肺部病理變化，恢復(fù)其正常功能，而桔梗湯總多糖組無明顯作用，故可以初步排除桔梗湯總多糖組。本研究為桔梗湯的二次開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)，為桔梗湯的微觀配伍提供理論支持，為相關(guān)課題的開展奠定了初步基礎(chǔ)。而桔梗湯總皂苷和桔梗湯總黃酮是如何發(fā)揮此藥效，兩者之間是否存在有交互作用，這些科學(xué)問題還有待我們的進(jìn)一步研究探討。