CCT3在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及其對Hela細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

蔡明博,金玉茜，徐蘇龍,朱鵬飛,郭瑞霞

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院盆底重建科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科 鄭州 450052

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在很多發(fā)展中國家,即使給予標(biāo)準(zhǔn)治療，宮頸癌患者的5 a生存率仍不足50%[1]。因此探索宮頸癌發(fā)病機(jī)制，尋找宮頸癌治療新靶點(diǎn)，具有重要意義。伴侶蛋白攜帶t復(fù)合多肽1-亞基3(chaperonin containing tailless complex polypeptide 1-subunit 3,CCT3)定位于人1號染色體上[2]。CCT3作為伴侶蛋白復(fù)合體的一個(gè)重要亞基，在肝癌[3]、乳腺癌[4]、甲狀腺癌[5]、胃癌[6]等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。本研究檢測了CCT3在宮頸鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)，同時(shí)觀察了抑制宮頸癌Hela細(xì)胞中CCT3表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，為宮頸癌靶向CCT3治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 宮頸組織標(biāo)本獲取收集2020年1～8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科手術(shù)切除的宮頸鱗癌及癌旁正常組織標(biāo)本共10對，患者年齡為35～65歲，臨床分期為ⅠB期7例、ⅡA1期3例，術(shù)前均未接受任何治療，標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。研究獲得該院倫理委員會批準(zhǔn)。組織標(biāo)本獲取后立即放入液氮中，然后轉(zhuǎn)于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Hela細(xì)胞培養(yǎng)及分組Hela細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，常規(guī)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，2.5 g/L胰蛋白酶及0.2 g/L EDTA消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至融合度達(dá)到50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為空白對照組(正常培養(yǎng))、陰性對照組(NC組，轉(zhuǎn)染陰性對照shRNA)和干擾組(轉(zhuǎn)染CCT3特異性shRNA)。CCT3 shRNA慢病毒及相應(yīng)陰性對照慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建，CCT3 shRNA序列為5’-CAAGTCCATGATCGAAATT-3’。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h熒光均達(dá)80%以上時(shí)，收集細(xì)胞檢測干擾效果，并進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3 宮頸組織及Hela細(xì)胞中CCT3 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測取冷凍宮頸組織在液氮中經(jīng)組織研磨管研磨。收集3組Hela細(xì)胞。使用MiniBEST Universal RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)提取組織及細(xì)胞中的總RNA，檢測樣品RNA的純度。使用HiFiScript cDNA合成試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。選用GAPDH作為內(nèi)參。qPCR擴(kuò)增參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明進(jìn)行，引物由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。CCT3上游引物5’-AAGTCCATGATCGAAATTAGCCG-3’，下游引物5’-TGCTCAGCTACAGACAGCATT-3’，產(chǎn)物大小101 bp；GAPDH上游引物5’-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3’，下游引物5’-GGCTGTTGTCATACT TCTCATGG -3’，產(chǎn)物大小197 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算CCT3 mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 宮頸組織及Hela細(xì)胞中CCT3蛋白表達(dá)的Western blot檢測取小塊宮頸組織標(biāo)本，眼科剪剪碎，加入液氮研磨后用于提取組織總蛋白;收集3組Hela細(xì)胞用PBS清洗后用于提取細(xì)胞總蛋白。樣品中加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上靜置30 min，每10 min吹打一次， 4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液，BCA法測蛋白濃度，按每孔50 μg蛋白質(zhì)上樣。CCT3一抗為兔抗人多克隆抗體(英國Abcam公司),稀釋度為1∶1 000；內(nèi)參GAPDH一抗為兔抗人單克隆抗體(美國CST公司)，稀釋度為1∶1 000；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，稀釋度為1∶5 000。在暗室中，采用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒(美國Thermo Scientific公司)進(jìn)行發(fā)光，暗室曝光。條帶采用Image J進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 3組Hela細(xì)胞增殖活性的MTT法檢測3組細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔細(xì)胞量約2 000個(gè)。各板細(xì)胞分別在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)0、1、2、3、4、5 d后于每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔中的液體。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀上于 570 nm波長處測量各孔的吸光度值，用Graphpad Prism 8.0繪制細(xì)胞增殖曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 3組Hela細(xì)胞克隆形成能力的檢測將3組細(xì)胞鋪于6孔板中，每孔約1 500個(gè)細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)14 d，每3 d換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)。每孔加入1 mL 40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗細(xì)胞，每孔加入1 mL結(jié)晶紫染液，染色約15 min，PBS洗滌數(shù)次，晾干，相機(jī)拍照。顯微鏡下觀察、記錄細(xì)胞克隆形成數(shù)(將≥50個(gè)細(xì)胞的聚集作為1個(gè)細(xì)胞克隆)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 3組Hela細(xì)胞遷移能力的檢測取3組細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞過夜貼壁，用無菌20 μL槍頭垂直于細(xì)胞板，劃直線，使用無菌PBS輕柔洗滌3次，洗去不貼壁的細(xì)胞，更換新鮮無血清培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察，拍照記錄劃痕部位初始狀態(tài)。將細(xì)胞繼續(xù)放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后取出，40倍顯微鏡下觀察并拍照。分別對3組不同時(shí)間劃痕內(nèi)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 NC組和干擾組細(xì)胞小鼠成瘤能力的檢測10只6周齡雌性NOD-SCID小鼠由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成2組，每組5只，分別于小鼠前肢腋窩皮下注射NC組和干擾組Hela細(xì)胞懸液，100 μL/只(約106個(gè)細(xì)胞)，出針后用無菌棉簽按壓出針處約5 s，以防液體溢出。小鼠繼續(xù)在SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，每3 d用游標(biāo)卡尺測量瘤體的長徑和短徑一次，20 d后處死小鼠，剝離皮下瘤體，稱取質(zhì)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。宮頸鱗癌和癌旁正常組織中CCT3相對表達(dá)量的比較采用配對資料的t檢驗(yàn)；2組小鼠移植瘤質(zhì)量的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；3組Hela細(xì)胞CCT3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量、遷移細(xì)胞數(shù)、克隆形成數(shù)的比較均采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌和癌旁正常組織中CCT3 mRNA和蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見表1。CCT3 mRNA和蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平均明顯高于癌旁正常組織。

表1 宮頸鱗癌和癌旁正常組織中CCT3表達(dá)水平的比較

2.2 3組Hela細(xì)胞中CCT3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量的比較與空白對照組和NC組相比，干擾組中CCT3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均降低(圖1和表2)。

圖1 3組Hela細(xì)胞中CCT3蛋白的表達(dá)

表2 3組Hela細(xì)胞CCT3 mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較

2.3 3組Hela細(xì)胞增殖活性的比較3組細(xì)胞增殖曲線見圖2。

圖2 3組Hela細(xì)胞增殖曲線

2.4 3組Hela細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)、克隆形成數(shù)的比較結(jié)果見表3。干擾組遷移細(xì)胞數(shù)、克隆形成數(shù)較空白對照組和NC組減少。

表3 3組Hela細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)和克隆形成數(shù)的比較

2.5 NC組和干擾組細(xì)胞小鼠成瘤能力的比較結(jié)果見表4。干擾組移植瘤的質(zhì)量低于NC組。

表4 NC組和干擾組細(xì)胞小鼠成瘤能力的比較 g

3 討論

宮頸癌的發(fā)病率和病死率均居女性惡性腫瘤前列，其發(fā)病機(jī)制、早期診斷、預(yù)后評估是研究的重點(diǎn)，難治性的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移性宮頸癌預(yù)后往往較差[7]。CCT3作為CCT復(fù)合體的一個(gè)重要亞基，可協(xié)助多種蛋白的折疊及重折疊過程，包括與細(xì)胞生長和分裂有關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白[8]、與腫瘤及細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白[9-10]等。CCT3在多種腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)[11-13]。有研究[3]表明CCT3在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，抑制肝癌細(xì)胞中CCT3的表達(dá)可降低細(xì)胞增殖活性；敲低甲狀腺癌細(xì)胞中CCT3的表達(dá)后，細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，凋亡增加[5]。本研究結(jié)果提示：CCT3 mRNA和蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織明顯升高；下調(diào)Hela細(xì)胞中CCT3表達(dá)后，細(xì)胞增殖活性和克隆形成能力明顯降低，細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤能力明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：CCT3在體內(nèi)外均可通過調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖影響腫瘤發(fā)生、進(jìn)展。

CCT復(fù)合體的活性與細(xì)胞骨架的完整性密切相關(guān)，新合成的肌動(dòng)蛋白和微管蛋白單體必須依賴CCT復(fù)合體方可形成其活性的天然構(gòu)象，CCT表達(dá)異常影響細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[8,14]。在肝癌[15]、肺癌[16]、乳腺癌[4]等惡性腫瘤中，CCT復(fù)合體不同亞單元的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究中，下調(diào)Hela細(xì)胞中CCT3表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力明顯降低。

綜上所述，CCT3在宮頸鱗癌組織中高表達(dá)，下調(diào)Hela細(xì)胞中CCT3表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖和遷移能力。CCT3可能成為宮頸癌早期診斷、治療及預(yù)后評價(jià)的新靶點(diǎn)。