平菇品種“科大雜優(yōu)”的母種脫毒技術(shù)初探*

張玉萍，王 芳，史興海

（1.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太原 030031）

“科大雜優(yōu)”是廣溫型平菇（Pleurotus ostreatus）菌株，是華北地區(qū)的主栽品種之一。子實(shí)體扇形或半球形，幼時(shí)深灰色，栽培菌株原基灰黑色；子實(shí)體叢生邊緣稍向下卷，后漸灰白色，較平展；菌肉白色，肥厚；菌褶較深且延生，菌柄側(cè)生，污白色[1]。因其較耐高溫，廣受山西菇農(nóng)青睞，然而2019年山西柳林、晉中、靜樂等地在不同栽培時(shí)間段、不同栽培設(shè)施內(nèi)出現(xiàn)了病毒感染，使其品種形成了不同程度的畸形菇。為提高該菌株菇體的產(chǎn)量和質(zhì)量，將植物的脫毒技術(shù)應(yīng)用于食用菌生產(chǎn)，可有效抑制病害的發(fā)生。植物脫毒，是將植物莖尖組織進(jìn)行分離，將分離組織置于特定培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得脫離原體病毒、病菌的新生種苗。在脫毒過程中，采取一系列的高溫、低溫刺激、營養(yǎng)貧乏等技術(shù)手段，迫使菌株適應(yīng)惡劣的條件，能夠提高菌株抗性[2]，從而達(dá)到提高產(chǎn)量和質(zhì)量的目的。

王鋒尖等[3]采用菌絲尖端脫毒法對(duì)白色金針菇（Flammulina velutipes） 菌株脫毒復(fù)壯，經(jīng)3次～5次脫毒復(fù)壯后，菌絲體的生長速度、生長量顯著高于對(duì)照組和1次脫毒；栽培試驗(yàn)表明脫毒菌株與對(duì)照菌株相比，發(fā)菌期與生產(chǎn)周期均有所縮短，差異不顯著，但生物轉(zhuǎn)化率提高了9.92%，差異極顯著。陳發(fā)川等[4]從秀珍菇（Pleurotus geesteranus） 污染菌包中分離得到的3個(gè)秀珍菇菌株為出發(fā)菌株，采用挑取尖端菌絲進(jìn)行菌株復(fù)壯，結(jié)果表明可以縮短出菇周期并提高出菇產(chǎn)量。吳小平等[5]對(duì)香菇（Lentinus edodes）采用菌絲尖端挑取法對(duì)3株帶毒香菇進(jìn)行脫毒，獲得1株不含ds RNA條帶的無毒菌株和一些含1條11 kb的ds RNA條帶脫毒不徹底菌株。對(duì)脫毒不徹底菌株、無毒菌株以及帶毒菌株進(jìn)行了生物學(xué)特性、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶和多酚氧化酶活性的測定，結(jié)果顯示在pH為8時(shí)脫毒菌株的生長速度比帶毒菌株快，這三類菌株的子實(shí)體產(chǎn)量無顯著差異，但脫毒菌株子實(shí)體肥厚且抗污染能力強(qiáng)。付月月[6]采用化學(xué)藥劑進(jìn)行常溫菌絲尖端處理、低溫菌絲尖端處理和高溫菌絲尖端處理的方式對(duì)牛肝菌（Boletus spp.）中的病毒菌株進(jìn)行了脫毒處理，其中高溫菌絲尖端脫除處理可有效脫除牛肝菌中的病毒。

通過采用常溫尖端，常溫?cái)鄻蚝透邷丶舛?種方法對(duì)該平菇菌株進(jìn)行脫毒復(fù)壯試驗(yàn)，以期對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐起到指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

采集山西省靜樂縣豐潤鎮(zhèn)徐家溝栽培平菇子實(shí)體。子實(shí)體為深灰色，菌蓋花邊且呈上卷狀，菌褶紋理紊亂，菌柄粗，產(chǎn)量及其商品價(jià)值均下降。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的平菇病毒主要有3種，即OMSV、OMIVⅠ、OMIVⅡ，病毒顆粒直徑分別為27 nm、34 nm、34 nm，OMSV的基因組為單鏈RNA，OMIVⅠ、OMIVⅡ的基因組為雙鏈RNA，其中OMSV和OMIVⅠ經(jīng)常共同感染寄主?；煊腥N病毒或者單個(gè)病毒引起的子實(shí)體畸形癥狀較為復(fù)雜，并未有明顯區(qū)別[7]。所采集的供試平菇菌株混有3種病毒或單個(gè)病毒。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

子實(shí)體分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，加水1 000 mL，pH為7。脫毒培養(yǎng)基以及活化母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蛋白胨2 g，加水1 000 mL，pH為7。原種培養(yǎng)料：棉籽皮85.9%、麩皮10%、糖1%、磷肥1%、石膏2%、尿素0.1%。出菇袋配方：玉米芯84%、麩皮10%、石膏1%、石灰3%、磷肥2%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織分離母種

按無菌操作技術(shù)將平菇子實(shí)體撕開，在菌蓋與菌柄交界處，用滅菌小鑷子取綠豆大菌肉，接入PDA斜面培養(yǎng)基中（18 mm×180 mm），以原始分離菌株為對(duì)照組，22℃～25℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 脫毒復(fù)壯處理

1） 常溫尖端法

挑取組織分離好的母種約2 mm2菌絲塊接入18 mm×180 mm試管斜面中，放入恒溫培養(yǎng)箱22℃～25℃培養(yǎng)，當(dāng)菌絲萌發(fā)至2 cm時(shí)，用接種工具切取菌絲尖端2 mm菌絲轉(zhuǎn)接至試管斜面中，此為1次脫毒。如此循環(huán)，經(jīng)1次～5次連續(xù)脫毒所得菌株分別標(biāo)記為處理C1、處理C2、處理C3、處理C4、處理C5。

2） 常溫?cái)鄻蚍?/p>

斜面PDA培養(yǎng)基凝固后于無菌條件下，用接種耙將培養(yǎng)基斜面最前端較薄處培養(yǎng)基斷開約1 cm，把待接母種轉(zhuǎn)接至試管中間培養(yǎng)基上，22℃～25℃恒溫培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長到斷開處時(shí)，則會(huì)繼續(xù)伸長，穿越斷開處，長至前端分離小塊培養(yǎng)基上，待菌絲在前端培養(yǎng)基生長1 cm后，用接種工具切取菌絲尖端2 mm菌絲轉(zhuǎn)接至試管斜面后端培養(yǎng)基中，此為1次脫毒，如此循環(huán)，經(jīng)1次～5次連續(xù)脫毒所得菌株分別記為處理D1、處理D2、處理D3、處理D4、處理D5。

3） 高溫尖端法

挑取組織分離好的母種約2 mm2菌絲塊接入18 mm×180 mm試管斜面中，培養(yǎng)箱溫度調(diào)至32℃～34℃。當(dāng)菌絲萌發(fā)至2 cm時(shí)，用接種工具切取菌絲尖端2 mm的菌絲轉(zhuǎn)接至試管斜面中，此為1次脫毒。如此循環(huán)，經(jīng)1次～5次連續(xù)脫毒所得到的菌株分別記為處理G1、處理G2、處理G3、處理G4、處理G5。

各菌株母種長好后放入4℃冰箱冷藏，備用。

1.2.3 母種菌絲生長速度測定

活化對(duì)照組和各脫毒菌株，挑取活化后各菌株2 mm2組織塊置于30 mm×200 mm平底試管斜面底部，22℃～25℃避光培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)至試管壁時(shí)開始畫線，生長5 d后再畫線，測量菌絲長度，計(jì)算菌絲日平均生長速度（cm·d-1）。每個(gè)處理5次重復(fù)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 原種菌絲生長速度測定

試驗(yàn)設(shè)計(jì)既考慮了試驗(yàn)梯度又兼顧工作量，將對(duì)照組母種和處理C1、處理C3、處理C5、處理D1、處理D3、處理D5、處理G1、處理G3、處理G5菌株母種制作原種，采用1.1.2原種培養(yǎng)基，常規(guī)方法拌料，料水比約為1.0∶1.5，用石灰調(diào)節(jié)pH為7，拌料均勻后裝入500 mL玻璃罐頭瓶原種瓶內(nèi)，要求邊裝料、邊壓緊，并把料面整平壓實(shí)，在中央用錐形木棒扎一洞穴，用清水洗凈瓶口，后用一層聚丙烯塑料薄膜包扎。于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌后將原種瓶移至接種室內(nèi)，待溫度降至25℃下即可接種，接種后于22℃～25℃培養(yǎng)，待菌絲生長至瓶肩，開始劃線，直至瓶底再劃線，測量菌絲長度，計(jì)算菌絲日平均生長量（cm·d-1）。每組10個(gè)重復(fù)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 產(chǎn)量測定

將1.2.4原種直接接入22 cm×48 cm聚乙烯栽培袋中，每個(gè)處理30個(gè)重復(fù)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。因試驗(yàn)屬于同一品種不同菌株，采用以時(shí)間段產(chǎn)量為測產(chǎn)依據(jù)，開始時(shí)間為2020年8月23日，截止時(shí)間為2020年10月24日。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0，Excel對(duì)測定的各菌株相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 母種菌絲生長速度比較

2.1.1 各菌株在不同處理方法下母種菌絲生長速度的比較

各不同處理方法的平菇菌株母種菌絲生長速度比較見表1。

表1 各菌株母種菌絲生長速度比較結(jié)果Tab.1 Comparison results of growth rate of each strains

由表1可知，常溫尖端法中處理C1、處理C3和處理C5的菌絲生長速度均高于CK，但處理C1較CK有顯著差異；常溫?cái)鄻蚍ㄖ刑幚鞤1、處理D3和處理D5的菌絲生長速度均高于CK，且處理D5與CK有顯著差異；高溫尖端法中除了處理G1略高于CK外，處理G3與CK相等，處理G5低于CK，但差異均不明顯。

2.1.2 不同處理方法對(duì)各菌株母種菌絲生長速度綜合比較

不同處理各菌株母種菌絲長速多重比較結(jié)果見表2。

表2 各菌株母種菌絲長速多重比較結(jié)果Tab.2 The results of multiple comparisons of the growth rate of the female strains of the mycelium

由表2可知，高溫尖端脫毒法與對(duì)照組之間無明顯差異，常溫尖端法與常溫?cái)鄻蚍阜N菌絲生長速度明顯快于對(duì)照組。

2.2 原種菌絲生長速度比較

2.2.1 各菌株在不同處理方法下原種菌絲生長速度的比較

不同處理各菌株原種菌絲生長速度比較見表3。

表3 各菌株原種菌絲生長速度比較結(jié)果Tab.3 Comparison results of primary filament growth rate of various strains

由表3可知，各處理在以棉籽殼為主料的培養(yǎng)基中，除常溫尖端法處理C1菌絲生長速度明顯低于對(duì)照組外；其余各處理原種菌絲生長速度均與CK無明顯差異。

2.2.2 不同處理方法對(duì)各菌株母種菌絲生長速度綜合比較

不同處理各菌株原種菌絲長速多重比較結(jié)果見表4。

表4 各菌株原種菌絲長速多重比較Tab.4 The results of multiple comparisons of the mycelium growth rate of the original strains

由表4可知，綜合常溫尖端、常溫?cái)鄻蚝透邷丶舛?種處理方式，在原種中的菌絲生長速度明顯低于對(duì)照組。

2.3 產(chǎn)量比較

各處理出菇產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)見表5，不同處理方法第一潮菇產(chǎn)量比較見圖1。

表5 各處理出菇產(chǎn)量Tab.5 Yield of fruiting body rods for each treatment

圖1 各菌株第一潮產(chǎn)量比較Fig.1 Comparison of the first-tide yield of various strains

由表4并結(jié)合圖1可以得出，各處理總產(chǎn)量大小依次為： G1>D1>C1>G3>D5>CK>D3>C3>G5>C5，處理G1總產(chǎn)量最高為15.75 kg，比對(duì)照高25%，處理D1次之（14.6 kg），比處理C高15.9%。各處理第一潮菇產(chǎn)量依次為C5>G1>C1>D3>D1=G5>G3>C>C3。由此可知，常溫尖端處理方法脫毒一次效果最好，隨著脫毒處理次數(shù)的增多，產(chǎn)量下降；斷橋尖端脫毒1次效果最好，連續(xù)處理5次產(chǎn)量無明顯變化；高溫尖端處理1次最好，隨著處理次數(shù)的增加，產(chǎn)量下降。

2.4 子實(shí)體形狀比較

科大雜優(yōu)原始菌株見圖2，常溫尖端、常溫?cái)鄻蚝透邷丶舛嗣摱揪攴謩e見圖3～圖5。

圖2 平菇品種“科大雜優(yōu)”原始菌株Fig.2 Original strain of Pleurotus ostreatus‘Kedazayou’

圖3 常溫尖端處理后子實(shí)體表現(xiàn)Fig.3 Sub-entity after treatment at room temperature

圖4 常溫?cái)鄻蛱幚砗笞訉?shí)體表現(xiàn)Fig.4 Sub-entity after normal temperature broken bridge treatment

圖5 高溫尖端處理后子實(shí)體表現(xiàn)Fig.5 Sub-entity after high temperature tip treatment

由圖2～圖5可知，畸形菇子實(shí)體經(jīng)過組織分離以及常溫尖端、常溫?cái)鄻蚝透邷丶舛嗣摱竞?，重新制種進(jìn)行栽培，子實(shí)體外形有所改觀，花邊，粗柄現(xiàn)象消失，但菌褶紊亂經(jīng)過3種方法脫毒處理，表現(xiàn)不同。經(jīng)過常溫尖端處理，隨著脫毒次數(shù)增多，菌褶有所改善；斷橋尖端處理5次后，菌褶紋理有序；高溫尖端脫毒后，隨著脫毒次數(shù)增加，菌褶紊亂度下降。

3 討論

目前，我國己經(jīng)成為世界上最大的食用菌生產(chǎn)國，人工栽培的食用菌種類最多。菌種在食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起著重要且不可替代的作用，菌種的優(yōu)劣決定栽培的成敗[8-10]。因此，分離培育優(yōu)良菌種對(duì)食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展十分重要。在日常生產(chǎn)中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)菌株退化，菌種老化等現(xiàn)象，而簡單、易操作的脫毒、復(fù)壯方法，對(duì)于菌株的提純復(fù)壯，預(yù)防菌種的老化具有非常重要的實(shí)踐意義[11-12]。

從各菌株母種生長狀況看，常溫尖端、常溫?cái)鄻蛱幚韺?duì)菌絲有很好的復(fù)壯、純化作用，處理C1生長速度最快，隨著處理次數(shù)的增多，菌絲生長速度下降，對(duì)涉及母種轉(zhuǎn)接的生產(chǎn)科研工作具有重要指導(dǎo)意義。常溫?cái)鄻蛱幚恚S著處理次數(shù)增多，母種菌絲生長速度增加，處理D5生長速度最快。

從原種菌絲生長速度來看，各處理菌株相較對(duì)照而言，均有所下降，并存在顯著差異，但隨著處理次數(shù)的增加，菌絲生長速度有所回升，但處理次數(shù)何時(shí)可以達(dá)到或者超過對(duì)照組，有待進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)采用常溫尖端法、常溫?cái)鄻蚍?、高溫尖端法?duì)攜帶病毒（菌） 的平菇畸形菌株脫毒（菌） 處理，從子實(shí)體形態(tài)看，采用3種脫毒分離方法，子實(shí)體外形均有所改觀，菌柄粗細(xì)適中，菌蓋大小勻稱，邊緣整齊，對(duì)菇體的商品價(jià)值有所提升。常溫尖端，高溫尖端法隨著處理次數(shù)的增多，其子實(shí)體菌褶紋理逐漸整齊，常溫?cái)鄻蛱幚矸椒▽?duì)子實(shí)體形狀起到了很好的修復(fù)作用，而且處理D5表現(xiàn)最好，常溫?cái)鄻蛱幚響?yīng)不少于5次。

4 結(jié)論

衡量一個(gè)菌株的優(yōu)劣，產(chǎn)量是必不可少的重要指標(biāo)。從各處理菌株總體產(chǎn)量看，高溫尖端處理對(duì)產(chǎn)量的提高效果最為顯著，常溫?cái)鄻蛱幚泶沃Ｆ焦狡贩N“科大雜優(yōu)”作為廣溫偏高型菌株，能搶季上市非常重要，因此第一潮產(chǎn)量較為關(guān)鍵。從第一潮菇產(chǎn)量，處理C5表現(xiàn)最為突出，第一潮產(chǎn)量達(dá)10.70 kg，比對(duì)照的第一潮產(chǎn)量提高100%；處理G1第一潮菇產(chǎn)量比對(duì)照高出61.7%。這些結(jié)果對(duì)工廠化栽培，增加單位時(shí)間內(nèi)茬數(shù)并獲得更高產(chǎn)量，大幅度提高廠房利用率，降低生產(chǎn)成本，增加收益有重要意義[13]。

綜合所有因素，對(duì)于科大雜優(yōu)帶病毒（菌） 菌株，使用常溫?cái)鄻蚍椒ㄟB續(xù)5次處理對(duì)菌絲的長速有促進(jìn)作用，且該方法對(duì)菇型的改善和產(chǎn)量的提高均有很大作用，因此常溫?cái)鄻蚍ㄊ翘峒儚?fù)壯科大雜優(yōu)帶病毒（菌）菌株的最佳方法。