角膜膠原交聯(lián)中核黃素濃度檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

嚴(yán)夢(mèng)迪 黃錦海 王勤美 高蓉蓉

作者單位：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 325027

角膜膠原交聯(lián)術(shù)（Corneal collagen cross-linking，CXL）開(kāi)始研究已有20余年的歷史，是目前臨床上控制圓錐角膜進(jìn)展的主要方法之一，找到相較于傳統(tǒng)去上皮方案更安全的跨上皮CXL方案已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。核黃素作為光敏劑在角膜中的濃度影響到CXL的療效和安全性，也是新型跨上皮CXL方案評(píng)估的重要指標(biāo)之一。目前，不同文獻(xiàn)中報(bào)道的CXL過(guò)程中核黃素濃度存在較大差異，所用檢測(cè)方法也不盡相同。筆者將闡述核黃素的理化性質(zhì)及其在CXL中的作用機(jī)制，及角膜中核黃素濃度檢測(cè)的重要性和檢測(cè)方法。

1 核黃素的理化性質(zhì)和CXL的應(yīng)用

核黃素又稱維生素B2，是一種重要的維生素，其分子式為C17H20N4O6，分子量376，由異四氧嘧啶環(huán)和核醇鏈組成（見(jiàn)圖1），微溶于水。

圖1.核黃素的結(jié)構(gòu)式Figure 1.Structural formula of riboflavin.

CXL于2003 年出現(xiàn)以來(lái)，用于治療進(jìn)展期圓錐角膜，可明顯增強(qiáng)角膜的生物力學(xué)性能，也用于治療感染性角膜炎[1，2]、角膜溶解[3]和角膜基質(zhì)水腫[4]等眼部病變。CXL以核黃素為光敏劑，在365 nm波長(zhǎng)的紫外線-A（Ultraviolet A，UVA）照射下，核黃素從UVA中吸收能量，激發(fā)為三線態(tài)核黃素，CXL包括I型和II型機(jī)制：對(duì)于II型機(jī)制，三線態(tài)核黃素通過(guò)與三線態(tài)氧（3O2）的作用，產(chǎn)生活躍的單線態(tài)氧（1O2），可以與膠原的羰基相互作用；如果3O2耗盡，則I型機(jī)制占主導(dǎo)地位，即三線態(tài)核黃素直接作用于底物（膠原蛋白和蛋白聚糖）[5]。核黃素微溶于水，臨床上常用的是更易溶于水的核黃素-5'-磷酸，可被角膜中的酶轉(zhuǎn)化成為核黃素[6]。

2 角膜中核黃素濃度檢測(cè)的重要性

核黃素在CXL中具有2個(gè)重要功能：①作為光化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)的光敏劑，促進(jìn)底物交聯(lián)；②作為UVA吸收劑保護(hù)角膜內(nèi)皮、晶狀體和視網(wǎng)膜等結(jié)構(gòu)免受UVA過(guò)度照射的傷害。

在UVA照射之前角膜基質(zhì)中核黃素的濃度，以及其在照射期間核黃素的有效消耗是保證CXL療效的2 個(gè)主要因素[7]。CXL過(guò)程中，在3 mW/cm2的輻照度下，核黃素以每分鐘1%～2%的速率發(fā)生光降解[8]，按每分鐘降解約2%計(jì)算，如果不補(bǔ)充核黃素，30 min后將降解約60%，因此照射過(guò)程中需要補(bǔ)充核黃素。O'Brart等[9]用不同濃度的核黃素溶液進(jìn)行豬眼快速CXL后進(jìn)行抗胃蛋白酶溶解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)20 d后0.3%濃度組干重明顯大于0.05%濃度組，即核黃素濃度越高，抗溶解越好；他們還認(rèn)為基質(zhì)內(nèi)較高的核黃素濃度可導(dǎo)致前基質(zhì)UVA吸收增加，并在理論上減少角膜內(nèi)皮細(xì)胞的UVA輻射量，用于治療較薄的角膜。核黃素稀溶液的UVA吸收系數(shù)與其濃度呈線性相關(guān)，且在核黃素濃度達(dá)到0.1%時(shí)到達(dá)平臺(tái)期[10]，區(qū)別于先前研究中的0.04%[11]。對(duì)于目前臨床采用的UVA輻照量，最合適的基質(zhì)核黃素濃度尚有待研究。

3 角膜中核黃素濃度的檢測(cè)方法

核黃素的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍為440～500 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為510～550 nm[12]。通過(guò)檢測(cè)樣品內(nèi)核黃素的熒光強(qiáng)度，利用熒光強(qiáng)度與其濃度呈正比，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線得到核黃素濃度，可進(jìn)行定量分析。目前角膜中核黃素濃度的檢測(cè)方法大部分是基于這一特性，主要包括使用熒光顯微鏡進(jìn)行核黃素?zé)晒鈴?qiáng)度分析、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）、分光光度法、無(wú)創(chuàng)性實(shí)時(shí)檢測(cè)、眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡觀察法等。檢測(cè)核黃素濃度的另一種原理是基于檢測(cè)質(zhì)譜中的特定峰，即基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像技術(shù)（Imaging mass spectrometry by matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI-IMS）。

3.1 利用熒光顯微鏡檢測(cè)角膜冰凍切片的核黃素濃度

目前大部分研究中檢測(cè)核黃素濃度是通過(guò)使用熒光顯微鏡對(duì)角膜進(jìn)行熒光成像，研究采用的共聚焦熒光顯微鏡激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm或458 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為505～565 nm不等，雙光子熒光顯微鏡（Two-photon microscopy，TPM）激發(fā)光波長(zhǎng)范圍為760～890 nm不等，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為505～650 nm不等。熒光顯微鏡檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是能檢測(cè)角膜全層的熒光強(qiáng)度以反映不同基質(zhì)深度的核黃素濃度，缺點(diǎn)是冰凍切片制作過(guò)程中包埋劑會(huì)溶解，在切片表面易發(fā)生核黃素的彌散遷移[13]。在冰凍切片制作完成后，應(yīng)盡快進(jìn)行熒光顯微鏡的拍攝，還可以用無(wú)熒光浸油覆蓋于切片表面以減少擴(kuò)散[13]。

有研究使用共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)CXL前后兔角膜基質(zhì)內(nèi)的核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)20 min和30 min后去上皮組核黃素濃度為0.036%和0.049%，跨上皮組濃度低于0.010%，CXL術(shù)后1 d，去上皮組角膜熒光強(qiáng)度下降約100%，跨上皮組下降約60%[14]。Gore等[13]對(duì)35 μm厚的兔角膜冰凍切片進(jìn)行TPM熒光成像，發(fā)現(xiàn)不同跨上皮核黃素制劑的基質(zhì)穿透能力均不如傳統(tǒng)去上皮方案，前基質(zhì)中，去上皮組、MedioCross TE組和Ricrolin組的核黃素濃度分別為0.090%、0.054%和0.031%，300 μm基質(zhì)深度處分別為0.075%、0.018%和0.016%。他們還用此方法比較了不同離子導(dǎo)入方案的核黃素滲透性，發(fā)現(xiàn)使用MedioCross TE溶液進(jìn)行2個(gè)周期的離子導(dǎo)入（即1 mA電流離子導(dǎo)入5 min—浸泡5 min—1 mA電流離子導(dǎo)入5 min—浸泡5 min），在離體兔眼中可達(dá)到與去上皮相似的滲透量[15]。Lanzini等[16]使用共聚焦熒光顯微鏡對(duì)5 μm厚的人供體角膜冰凍切片進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)采用離子導(dǎo)入浸潤(rùn)法與傳統(tǒng)去上皮方案有相似的效果。

3.2 利用熒光顯微鏡檢測(cè)完整角膜的核黃素濃度

對(duì)完整角膜進(jìn)行成像可以避免核黃素在切片表面的擴(kuò)散，從而更準(zhǔn)確地對(duì)不同基質(zhì)深度的核黃素濃度進(jìn)行檢測(cè)。Sondergaard等[17]將去上皮后的完整豬眼角膜直接置于載玻片上，內(nèi)皮面朝向共聚焦熒光焦顯微鏡的物鏡，通過(guò)光學(xué)切片以10 μm的間隔記錄測(cè)量整個(gè)角膜的熒光強(qiáng)度，觀察到熒光強(qiáng)度在前50 μm內(nèi)達(dá)到峰值，然后急劇下降，在200 μm處降低至基線，并且隨著浸潤(rùn)時(shí)間由10 min延長(zhǎng)至20 min，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而由20 min延長(zhǎng)至30 min，熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，且當(dāng)核黃素濃度由0.1%增加到0.2%時(shí)，前基質(zhì)中的熒光強(qiáng)度明顯增加，但其深度分布不受時(shí)間和濃度的影響。Laggner等[18]使用共聚焦熒光顯微鏡觀察去上皮浸潤(rùn)5、10、20 min后人供體角膜內(nèi)核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)20 min組濃度明顯高于另2組。Seiler等[19]使用TPM檢測(cè)核黃素溶液去上皮浸潤(rùn)10 min后人供體角膜的核黃素濃度，測(cè)得后基質(zhì)濃度為0.035%，內(nèi)皮水平的濃度為0.015%，低于先前理論計(jì)算的0.025%[20]。Kampik等[21]使用TPM顯示，核黃素浸潤(rùn)去上皮的豬角膜中30 min后基質(zhì)熒光信號(hào)呈空間均勻分布。有研究使用TPM測(cè)得在核黃素浸潤(rùn)去上皮的豬角膜40 min后，角膜條帶橫截面的熒光信號(hào)已接近均勻，浸潤(rùn)60 min后熒光信號(hào)隨深度呈線性下降，因此信號(hào)的降低是由于信號(hào)衰減而非核黃素濃度的空間變化，校正信號(hào)衰減后，核黃素濃度隨著浸潤(rùn)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，浸潤(rùn)30min后最大組織濃度為0.094%（1.36 mg/ml），300 μm基質(zhì)深度處的平均濃度為0.086%（1.25 mg/ml），浸潤(rùn)50 min后整個(gè)基質(zhì)濃度達(dá)到均勻[22]。

在跨上皮評(píng)估方面，Zhang等[23]以完整胚胎雞角膜為對(duì)象，通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡觀察到肽NC-1059 對(duì)核黃素的跨上皮擴(kuò)散有明顯作用，且作用呈濃度和時(shí)間依賴，NC-1059為100 μmol/L濃度組的基質(zhì)內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯高于50 μmol/L濃度組，30 min后接近去上皮組。Arboleda等[24]使用共聚焦熒光顯微鏡研究離子導(dǎo)入對(duì)核黃素跨大鼠角膜上皮的作用，發(fā)現(xiàn)不含右旋糖酐的核黃素-磷酸鹽溶液在離子導(dǎo)入下可以跨上皮，但仍不如去上皮組，且此過(guò)程呈時(shí)間依賴性，認(rèn)為右旋糖酐的高分子量和高黏度阻礙了核黃素的跨上皮浸潤(rùn)。

3.3 利用HPLC檢測(cè)角膜溶解液的核黃素濃度

HPLC的過(guò)程是將角膜在特定溶液里完全溶解，得到溶解液作為流動(dòng)相被高壓輸液系統(tǒng)泵入含固定相的色譜柱，溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同，引起不同的排阻作用，因而使核黃素得以分離，進(jìn)入檢測(cè)器得到其濃度。HPLC可以單獨(dú)分離出核黃素，減少了其他物質(zhì)可能的干擾，相較于其他方法有更高的精準(zhǔn)度（可達(dá)到ng級(jí)別），但只能檢測(cè)角膜中平均核黃素濃度，不能直觀地描述核黃素的空間分布，而且由于不能將角膜表面的核黃素完全沖洗干凈而高估核黃素濃度[25]。

有研究使用HPLC測(cè)得5、15、30 min后保留上皮浸潤(rùn)組供體人角膜中核黃素平均濃度分別為91.88、95.60、94.92 ng/g，而去上皮組分別為14.42、20.92、24.06 mg/g，表明角膜上皮阻礙了核黃素的浸潤(rùn)[25]。Cassagne等[26]通過(guò)HPLC比較離子導(dǎo)入法與傳統(tǒng)去上皮法的兔眼角膜基質(zhì)和房水中的核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)離子導(dǎo)入組均低于去上皮組[角膜基質(zhì)：（936±313）ng/mlvs.（1 708±908）ng/ml，房水：（68±70）ng/mlvs.（1 497±1 168）ng/ml）]。Mastropasqua等[27]使用飛秒激光對(duì)核黃素浸潤(rùn)后的人角膜分層并進(jìn)行HPLC，發(fā)現(xiàn)表層基質(zhì)中，傳統(tǒng)去上皮組的核黃素濃度為離子導(dǎo)入組的2倍，為保留上皮組的4倍濃度，3組濃度均隨深度增加而明顯下降，在中、后基質(zhì)中無(wú)明顯差異。Ostacolo等[28]通過(guò)HPLC在離體豬角膜中觀察到d-α-生育酚聚乙二醇1 000琥珀酸酯（Vitamin E-tocopherylpolyethylene glycol succinate，VE-TPGS）對(duì)核黃素的跨上皮穿透具有影響作用，在核黃素溶液內(nèi)加入0.5% VE-TPGS，浸潤(rùn)20 min后角膜內(nèi)核黃素濃度可以接近去上皮方案。

3.4 利用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)完整角膜的核黃素濃度

物質(zhì)中的分子和原子吸收入射光中的某些波長(zhǎng)的光能量，發(fā)生相應(yīng)的分子振動(dòng)能級(jí)躍遷和電子能級(jí)躍遷。每種物質(zhì)的分子、原子構(gòu)成和空間結(jié)構(gòu)各異，因此具有獨(dú)特的吸收光譜曲線，曲線上的特征波長(zhǎng)處的吸光度可用于定性和定量分析該物質(zhì)的含量。紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)相較其他方法操作更簡(jiǎn)單，但不能提供核黃素隨深度變化的趨勢(shì)。Iselin等[29]使用該方法（激發(fā)光譜420～490 nm、吸收光譜530～630 nm）檢測(cè)到15 min內(nèi)人工前房中核黃素平均濃度從5 ng/mL增加到903 ng/mL，30 min后達(dá)到1 089 ng/mL，證明核黃素可以穿透人供體角膜。有研究同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用TPM和分光光度法測(cè)量人供體角膜CXL過(guò)程中基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度，浸潤(rùn)30 min后，在100～250 μm基質(zhì)深度平均峰值濃度為0.020%±0.001%，在250～240（320±53）μm的基質(zhì)深度范圍濃度幾乎恒定，然后向內(nèi)皮方向逐漸降低，后基質(zhì)中濃度為0.016%±0.001%，常規(guī)UVA照射和快速UVA照射后，濃度分別均勻下降87%±2%和67%±3%[30]。另一研究使用此方法測(cè)得核黃素納米制劑跨上皮浸潤(rùn)和標(biāo)準(zhǔn)溶液去上皮浸潤(rùn)后，人供體角膜基質(zhì)中核黃素平均濃度分別為0.008%±0.003%和0.017%±0.001%，UVA照射后，2組平均消耗量分別為52%±13%和67%±2%[31]。Lombardo等[32]使用分光光度法測(cè)得含促滲劑的低滲核黃素可通過(guò)完整的人角膜上皮滲入基質(zhì)，平均濃度為0.004%，但不如去上皮組（0.012%），在加入15%右旋糖酐后，核黃素不能通過(guò)完整角膜上皮，認(rèn)為可能是因?yàn)橛倚囚母叻肿恿亢透唣ば浴?/p>

3.5 利用自行研發(fā)的儀器無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)檢測(cè)角膜的核黃素濃度

CXL治療結(jié)果的不確定性與患者的角膜組織有關(guān)，例如滲入角膜基質(zhì)的核黃素量和照射過(guò)程中核黃素的消耗等可能存在個(gè)體差異，目前缺少針對(duì)每例患者的個(gè)性化治療。如果在治療過(guò)程中能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者角膜內(nèi)核黃素濃度，則有可能實(shí)現(xiàn)個(gè)性化CXL。Lombardo等[7]研發(fā)了一臺(tái)儀器，能非侵入實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中的基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度，他們利用17片人供體角膜進(jìn)行CXL，UVA照射期間通過(guò)分光光度法測(cè)量得到實(shí)時(shí)吸光度值，根據(jù)校準(zhǔn)曲線得到基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)30 min后基質(zhì)中平均濃度為0.014%±0.003%，UVA照射30 min后降為0.003%±0.001%，并且角膜生物力學(xué)增強(qiáng)的程度與照射前基質(zhì)內(nèi)核黃素量以及照射時(shí)核黃素的消耗量明顯相關(guān)。Lombardo[33]設(shè)計(jì)了一個(gè)由UVA光源、紅-綠-藍(lán)照相機(jī)（用于治療過(guò)程中獲取角膜的熒光圖像，相機(jī)的綠色信號(hào)與核黃素的熒光光譜重疊）和一臺(tái)計(jì)算機(jī)（用于管理整體操作和原始數(shù)據(jù)處理）組成的設(shè)備，用于無(wú)創(chuàng)性地實(shí)時(shí)測(cè)定人供體角膜中核黃素平均濃度，浸潤(rùn)30 min后，基質(zhì)內(nèi)平均濃度為0.015%±0.003%，2種UVA照射方案（3 mW/cm2×30 min和9 mW/cm2×10 min）的基質(zhì)內(nèi)總的核黃素濃度均呈指數(shù)下降，消耗動(dòng)力學(xué)曲線無(wú)明顯差異。然而，上述研究無(wú)法提供核黃素濃度隨角膜深度變化的規(guī)律，且處于離體實(shí)驗(yàn)階段，準(zhǔn)確性和重復(fù)性有待進(jìn)一步研究。

3.6 利用眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡觀察法檢測(cè)在體角膜的核黃素濃度

Rubinfeld等[34]使用眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡觀察法評(píng)估兔眼角膜內(nèi)核黃素含量，并制定了分級(jí)方案：0級(jí)為不可見(jiàn)綠色，1級(jí)為剛剛可見(jiàn)的淡綠色，2級(jí)為強(qiáng)于1級(jí)的可見(jiàn)綠色，3級(jí)為明顯的綠色，4級(jí)為明亮的綠色，5級(jí)為強(qiáng)而明亮的綠色，該方法結(jié)果與HPLC高度相關(guān)（R2=0.940），但是結(jié)果依賴于檢查者的主觀評(píng)估，重復(fù)性和再現(xiàn)性尚未得到驗(yàn)證，未得到普遍應(yīng)用。

3.7 利用MALDI-IMS檢測(cè)角膜冰凍切片的核黃素濃度

MALDI-IMS是一種相對(duì)較新的技術(shù)，MALDI離子源由具有紫外發(fā)射的氮激光形成，激光將能量提供給基質(zhì)晶體引起解吸和電離，質(zhì)譜分析儀收集并檢測(cè)基質(zhì)和分析物（離子形式）質(zhì)譜中的特定峰（組織學(xué)分辨率約50 μm），從而識(shí)別化合物或其代謝物，已用于眼部的藥代動(dòng)力學(xué)研究。Vinciguerra等[35]使用MALDI-IMS評(píng)估傳統(tǒng)去上皮法、離子導(dǎo)入法和保留上皮法在兔角膜和人供體角膜中核黃素的濃度和分布，將20 μm厚的冰凍角膜切片干燥2 h后涂上MALDI基質(zhì)，進(jìn)行高分辨MALDI質(zhì)譜儀分析，前2組在角膜各深度和角膜緣處均檢測(cè)到核黃素信號(hào)，但離子導(dǎo)入組最深層的濃度稍低于去上皮組，而保留上皮組的核黃素信號(hào)極微弱。

4 總結(jié)

角膜內(nèi)核黃素濃度及其分布的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于CXL安全性和有效性的評(píng)估，新型跨上皮CXL方案的評(píng)估以及個(gè)性化手術(shù)方案的設(shè)計(jì)均至關(guān)重要。目前研究中不同測(cè)量方法得出的結(jié)果差異較大，可能與測(cè)量原理、采用的組織和樣品的制備有關(guān)。核黃素的無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)檢測(cè)方面已有少量的離體研究，但仍處于初步探索階段，迫切需要在體的檢測(cè)技術(shù)以滿足基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用需求，并提供可靠的工具。

利益沖突申明本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明嚴(yán)夢(mèng)迪：收集文獻(xiàn)資料并歸納分析；撰寫論文；根據(jù)修改意見(jiàn)進(jìn)行論文修改。黃錦海、王勤美：對(duì)論文的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱。高蓉蓉：參與選題設(shè)計(jì)；指導(dǎo)資料的分析和解釋；參與論文的修改