好氧反硝化細菌的分離鑒定及其應(yīng)用研究

謝曉娜， 張正波，2， 歐陽秋飛， 楊鄭州， 方春秋

（1.百色學院 農(nóng)業(yè)與食品工程學院， 廣西 百色 533000； 2.浙江環(huán)耀環(huán)境建設(shè)有限公司， 杭州 310014）

隨著工業(yè)化和城市化進程的加快， 氮素污染導(dǎo)致的水體富營養(yǎng)化日趨嚴重， 廢水脫氮研究尤為迫切。 傳統(tǒng)的生物脫氮包括好氧條件下自養(yǎng)硝化過程和厭氧條件下的異養(yǎng)反硝化過程［1］， 這2 個過程相對獨立， 分別由硝化菌和反硝化菌完成， 由于2 種菌的需氧濃度不同， 很難進行統(tǒng)一。

近年來， 研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)一些具有異養(yǎng)硝化－好氧反硝化雙功能的菌株， 這些菌株在好氧生長結(jié)束后， 會迅速進行反硝化作用， 將NO3－或NO2－轉(zhuǎn)化為N2O 或N2［2］。 異氧硝化細菌與自養(yǎng)菌相比， 生長速度快， 并能利用有機物質(zhì)作為碳源和能源在有氧條件下將氨氮轉(zhuǎn)變?yōu)镹2［3］， 這樣可在同一好氧環(huán)境條件下降低水體中的硝態(tài)氮（NO3--N）和氨態(tài)氮（NH4+-N）［1］， 從而提高生物脫氮效率［4］，實現(xiàn)了在同一反應(yīng)器中完成硝化和反硝化作用， 很大程度上節(jié)省了占地面積和投資成本。

異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌具有諸多的優(yōu)勢。 近十幾年， 國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)了新的異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌株， 拓寬雙功能菌的種類， 并研究其脫氮性能和機理［1，5］， 以求在實際工程中獲得更好的應(yīng)用［6-7］。 本研究從脫氮性能較佳的城鎮(zhèn)污水處理廠活性污泥中分離活性菌株， 探究其在好氧條件下對不同無機氮源的去除能力， 并評估其對生活污水的脫氮能力，為將其開發(fā)成為脫氮強化菌劑提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

Luria－Bertani 培 養(yǎng) 基（LB）： 蛋 白 胨10 g／L，NaCl 5 g／L， 酵母提取物5 g／L， pH 值7.0。

硝化模擬污水培養(yǎng)基（EM）： 以相同濃度NH4Cl 代替DM 培養(yǎng)基中的KNO3。

1.2 好氧反硝化細菌的篩選

（1） 富集培養(yǎng)。 取杭州某污水廠活性污泥1 g放入裝有100 mL DM 培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，用四層紗布封住瓶口， 于28 ℃、 160 r／min 搖床中振蕩培養(yǎng)48 h。

（2） 分離純化。 用接種環(huán)取上述富集培養(yǎng)物于DM 培養(yǎng)基平板上劃線分離， 單菌落長出后挑取單菌落； 再次劃線純化， 獲得2 株細菌， 分別命名為菌株B1 和F， 并進行LB 培養(yǎng)基斜面接種， 于4 ℃冰箱中保藏。

1.3 試驗用水

試驗用水取自浙江省麗水市某城鎮(zhèn)污水處理廠進水口， 其中COD 的質(zhì)量濃度為312 mg／L， 總氮的 質(zhì) 量 濃 度 為69.04 mg／L， 氨 氮 的 質(zhì) 量 濃 度 為34.89 mg／L， pH 值為5.7。

1.4 試驗方法

（1） 菌株的硝酸鹽還原能力及氨去除能力測試。 將斜面活化2 株分離得到的菌株， 轉(zhuǎn)接到100 mL LB 培養(yǎng)基中， 于30 ℃、 160 r／min 搖床培養(yǎng)24 h， 取10 mL 菌液， 于8 000 r／min 離心， 棄上清液， 再利用無菌蒸餾水洗滌沉淀， 再次離心， 如此重復(fù)3 次， 以去除菌體產(chǎn)生的無機氮素， 最后用10 mL 無菌蒸餾水制備成菌懸液。

取3 mL 的上述菌懸液分別接種30 mL EM 培養(yǎng)基和DM 培養(yǎng)基中， 以3 mL 的無菌蒸餾水為對照。 于30 ℃、 100 r／min 搖床培養(yǎng)22 h， 分別測量培養(yǎng)液中的NO3－－N、 NH4＋－N 和亞硝態(tài)氮（NO2－－N）的濃度。

（2） 混合菌株去除污水氮素效率。 將試驗用水分裝成30 mL／瓶（250 mL 三角瓶）， 每瓶添加6 g／L的葡萄糖溶液1 mL。 用1 mol／L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值為6.0、 7.2、 8.0， 備用。

分別取2 個菌株LB 培養(yǎng)基各10 mL 混勻， 按照上述方法制備成混合菌劑懸液， 取3 mL 混合菌劑（培養(yǎng)液V（B1）∶V（F）＝1 ∶1）懸液接種于上述每瓶污水中， 以3 mL 的無菌蒸餾水為對照。 于30℃、 100 r／min 搖床培養(yǎng)22 h， 分別檢測培養(yǎng)液中的NO3－－N、 NH4＋－N 的濃度。 每個處理重復(fù)3 次。

1.5 分析方法

NH4＋－N 采用水楊酸分光光度法測定， NO3－－N采用酚二磺酸分光光度法測定， NO2－－N 采用N－（1－萘基）－乙二胺測定， 總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定， COD 采用重鉻酸鉀法測定（HJ 828—2017）。

選取我院慢性心力衰竭（多病因）患者240例（2016年5月—2017年5月）作為觀察組，選取同期我院體檢健康人員240例作為對照組，觀察組男、女為139例、女101例，年齡61至84（71.83±5.12）歲，病史1至8（3.81±0.44）年，對照組男、女為135例、女105例，年齡62至83（72.61±5.56）歲，病史1至7（3.94±0.51）年。一般資料對比，P＞0.05。

1.6 菌株的鑒定

（1） 用革蘭氏染色法、 芽孢染色法觀察菌體形態(tài)特征。

（2） 16s rDNA 鑒定［8］。 將按照上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)分離的2 株細菌， 分別用一對通用引物f 27（5′－AGAGTTGATCCTGGCTCAG－3′）和r1492（5′－GGTTACCTTGTTACGSCTT－3′）對 細 菌 的 基 因 組DNA 進行16S rDNA 擴增， 擴增引物及擴增產(chǎn)物測序均由上海生工技術(shù)有限公司提供。 PCR 反應(yīng)程序為： 94 ℃5 min， 94 ℃1 min， 56 ℃1 min， 72℃2 min， 40 個循環(huán)； 72 ℃10 min。

（3） Biolog 微生物自動分析系統(tǒng)。 采用GENⅢ微孔鑒定板對2 株分離菌株進行了94 種表型測試，包括71 種碳源利用測試和23 種化學敏感性測試。試驗程序按照Biology 公司的鑒定操作指南進行［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 好氧反硝化細菌的篩選

采用富集培養(yǎng)和平板分離相結(jié)合的方式分離出2株細菌菌株B1 和F， 經(jīng)過LB 培養(yǎng)基活化培養(yǎng)制成菌懸液， 加入硝化模擬污水EM 培養(yǎng)基和反硝化模擬污水DM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)22 h。 分別測定培養(yǎng)液中NO3－－N、 NO2－－N 和NH4＋－N 的濃度， 結(jié)果見表1。

表1 分離菌株處理模擬污水Tab. 1 Treatment of simulated sewage by isolated strains

2 株分離菌株B1 和F 都有較好的NO3－－N 去除 效 果， DM 培 養(yǎng) 基 中NO3－－N 去 除 效 率 均 高 于80%， 其中菌株B1 處理的去除率達到84.93%。 在培養(yǎng)后的DM 培養(yǎng)物中， 均檢測到少量的NO2－－N和NH4＋－N。 由于NO2－－N 是硝酸鹽反硝化的中間產(chǎn)物［10-11］， 表明NO3－－N 的去除有好氧反硝化作用的參與。 NH4＋－N 的產(chǎn)生則是菌體生長代謝的產(chǎn)物， 通過硝酸鹽還原作用將NO3－－N 轉(zhuǎn)化為NH4＋－N 供菌體利用［12］， 在以NO3－－N 為唯一氮源培養(yǎng)基中， 好氧反硝 化 菌 Pseudomonas sp. Qy37［13］、 Alteromonas macleodii 8D［14］也存在類似的現(xiàn)象。 李耀東等［15］對好氧反硝化菌Pseudomonas sp. BN5 的氮平衡研究發(fā)現(xiàn)， 氮的去除為菌株反硝化作用和細胞同化作用共同的結(jié)果， 本研究中菌株B1 和F 對DM 培養(yǎng)基中NO3－－N 去除也表現(xiàn)為反硝化和細胞同化生長共同作用。

菌株B1 和F 均能在硝化模擬培養(yǎng)基EM 中生長， 同時具有較好的NH4＋－N 去除效果， 去除率均在60%左右， 這與白潔等［8］分離的異養(yǎng)硝化－好氧反硝化細菌Zobellella sp.B307 的NH4＋－N 去除率比較接近。 由于EM 培養(yǎng)基以NH4＋－N 為唯一氮源體系， 在菌株處理和對照處理的EM 培養(yǎng)基中， 均檢測到微量的NO2－－N 和NO3－－N， 且各處理濃度無顯著差異， 這可能是培養(yǎng)過程中氧氣充足， 自然氧化反應(yīng)引起的結(jié)果。

異氧菌的好氧反硝化脫氮機制并未闡明， 在以NH4＋－N、 NO2－－N 和NO3－－N 等為唯一氮源時， 菌株的脫氮性能差異顯著［16］， 有些菌種只能利用其中的1 種 或2 種 氮 源， 如Acinetobacter calcoaceticus HNR 只能利用NH4＋－N［17］， 而Pseudomonas stutzeri C3 則可以利用NO3－－N， 但不能利用NH4＋－N［18］。 本研究中菌株B1 和F 均可以利用NO3－－N 和NH4＋－N，有較好的開發(fā)利用潛力。

2.2 好氧反硝化細菌處理城鎮(zhèn)污水的生物脫氮效率

用分離得到的2 株細菌， 制備成混合菌劑（培養(yǎng)液V（B1） ∶V（F） ＝1 ∶1）， 用于處理城鎮(zhèn)生活污水， 考察其生物脫氮效果， 結(jié)果如表2 所示。

由表2 可以看出， 在pH 值為6.0 ～ 8.0 范圍內(nèi)， 該混合菌劑對污水中的NH4＋－N 和總氮均有較高的去除效果。 當pH 值為中性7.2 時， 處理22 h后NH4＋－N 和 總 氮 的 去 除 效 果 最 好， 分 別 為77.09%、 59.25%； 而 當pH 值 為6.0 和8.0 時，NH4＋－N 和總氮去除率無明顯差異， 且低于中性條件時的去除率， 這與朱曉明等［19］研究惡臭假單胞菌（Pseudomonas Putida）XK51 脫氮最適合pH 值為7.0 相一致， 當pH ＜6.5 或pH ＞8.0 時， 脫氮效率會明顯降低。 同一pH 值條件下， 混合菌劑對污水中NH4＋－N 的去除率明顯高于總氮的去除率， 且混合菌劑對城鎮(zhèn)生活污水NH4＋－N 的去除率（77.09%）明顯高于模擬污水EM 培養(yǎng)基的NH4＋－N 去除率（60.20%）。 這可能是因為城鎮(zhèn)生活污水中不僅含有有機氮源， 還含有形式多樣的無機氮源， 其豐富的混合氮源體系有利于NH4＋－N 的代謝［10］。

表2 分離菌株混合菌劑對城鎮(zhèn)污水的生物脫氮效果Tab. 2 Effect of isolated mixed strain agents on biochemical nitrogen removal from municipal sewage

2.3 好氧反硝化細菌菌種鑒定

在LB 培養(yǎng)平板上， 菌株B1 形成的菌落， 表面凸起， 干燥， 邊緣形成不規(guī)則。 經(jīng)光學顯微鏡觀察， 菌株呈桿狀， 革蘭氏染色陽性， 產(chǎn)芽孢。 菌株F 形成的菌落， 表面平整， 不光滑， 干燥， 邊緣形成不規(guī)則。 經(jīng)光學顯微鏡觀察， 菌株呈桿狀， 革蘭氏染色陽性， 產(chǎn)芽孢。

菌株B1 和F 的16S rDNA 基因序列通過Blast比對分析， 菌株B1 與Bacillus cereus WPySW2（CP 053289.1）的同源性達100%， 根據(jù)形態(tài)特征， 初步鑒定菌株B1 為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）； 菌株F 與Bacillus subtilis J－5（CP 018295.1）的同源性達99%， 根據(jù)形態(tài)特征， 初步鑒定菌株F 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）， 如圖1 所示。

圖1 基于16S rDNA 基因序列同源性構(gòu)建菌株B1 和F 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of strain B1 and F based on the sequences of 16S rDNA gene

2 個菌株通過Biolog 自動微生物鑒定系統(tǒng)（GENⅢ微孔鑒定板）分析， 菌株B1 與Bacillus cereus 的SIM 值最高為0.276（小于0.5）， 菌株F 與Bacillus subtilis 的SIM 值最高為0.181（小于0.5）。 由于2 株菌的SIM 值均小于0.5， 僅能確定分離菌株B1 和F為芽孢桿菌屬［9］。 結(jié)合16S rDNA 分析的結(jié)果， 可認定菌株B1 為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）， 菌株F為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3 結(jié)論

（1） 從活性污泥中分離得到2 株異養(yǎng)硝化－好氧反硝化細菌B1 和F， 經(jīng)鑒定分別為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

（2） 菌株B1 和F 均可以利用單一無機氮源NH4＋－N 和NO3－－N， 對反硝化模擬污水DM 培養(yǎng)基中NO3－－N 去除率分別為84.93%和81.19%， 對硝化模擬污水EM 培養(yǎng)基中NH4＋－N 的去除率分別為60.20%和60.95%。

（3） 2 株細菌的混合菌劑對城鎮(zhèn)生活污水均具有較好的脫氮效果， 當pH 值為7.2 時， 處理22 h后NH4＋－N 和總氮的去除率分別為77.09%、 59.25%。因此， 該好氧反硝化細菌B1 和F 可開發(fā)作為生物脫氮菌劑的潛力菌株。