高效液相色譜法測定槐仙顆粒中黃芩苷的含量

余春輝，劉紅英

1.豐城市中醫(yī)院，江西 豐城 331100；2.江西領行藥物研究所有限公司，江西 樟樹 331200

槐仙顆粒是由豐城市中醫(yī)院中醫(yī)師以《太平惠民和劑局方》中的“槐角丸”為基礎方加減而來，該制劑由槐角、地榆、防風、當歸、黃芩、麩炒枳殼、仙鶴草七味中藥制成。其功能主治為清腸疏風，涼血止血，潤腸通便；用于腸風便血，痔瘡腫痛，肛門瘙癢，便秘脫肛、肛裂等癥［1］。為了建立槐仙顆粒質(zhì)量標準，本研究用高效液相色譜法對制劑中黃芩的含量進行測定并建立標準限度，為制劑報批備案提供確實可行的技術依據(jù)。

處方中黃芩主含黃酮類化合物，包括有黃芩素，黃芩新素，黃芩苷，漢黃芩素，漢黃芩甙等［2-9］。實驗選擇方中主藥黃芩中的黃芩苷作為定量指標控制，以有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT 輸液泵，SIL-20A 自動進樣器，SPD-20A 檢測器，CTO-20A 柱溫箱，DGU-20A5R脫氣機。

1.2 試藥

甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110715-200212）；槐仙顆粒由醫(yī)院制劑室提供，規(guī)格：15 g/袋，10批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱拓譜C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動相，流速1 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫35 ℃。進樣10 μL；理論板數(shù)按黃芩苷峰計算均大于2 500。

2.2 溶液的制備

對照品溶液的制備：取60 ℃減壓干燥4 h的黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率150 W，頻率40 KHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取1 mL，至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，即得。

陰性樣品溶液的制備：按處方取除黃芩的其他藥材，依制法制成陰性樣品，再依供試品溶液制備方法制成黃芩陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件測定，色譜圖見圖1；結(jié)果顯示：黃芩苷對照品和制劑中的其他組分均能達到基線分離。

圖1 黃芩苷對照品、供試品、陰性樣品溶液HPLC圖譜

2.4 空白試驗

精密吸取10 μL 陰性樣品溶液按“2.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖1，結(jié)果陰性樣品無干擾，方法具專屬性。

2.5 線性關系的考察

精密稱取黃芩苷對照品24.1 mg 置25 mL 量瓶中搖勻并稀釋至刻度，精密量取3 mL 至50 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，得57.84 μg/mL。再分別精密吸取5 μL、10 μL、12 μL、15 μL、20 μL，2.1 項下色譜條件測定分析，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標，黃芩苷對照品的量為橫坐標繪制標準曲線（黃芩苷對照品溶液標準曲線圖）,計算得回歸方程：Y=4 000 000X-18 033，R2=1。結(jié)果表明黃芩苷在0.289 2 μg～1.156 8 μg 范圍內(nèi)具有良好線性關系。

2.6 精密度試驗

分別精密吸取黃芩苷對照品溶液（57.84 μg/mL）10 μL 重復進樣6 次，測定峰面積，各對照品溶液的峰面積積分值的相對標準偏差0.63%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取槐仙顆粒樣品（批號：20200701），依據(jù)“2.2”方法配置成供試品溶液，在室溫放置，分別于0、2、4、6、8 h 進樣測定，供試品溶液中黃芩苷在放置8 h 內(nèi)的峰面積基本一致，相對標準偏差為0.26%，表明所制備的供試品溶液中黃芩苷在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

取槐仙顆粒樣品（批號：20200701）6 份，依據(jù)“2.2”方法配置成供試品溶液，測定黃芩苷的含量，結(jié)果樣品中黃芩苷含量的相對標準偏差為0.65%，表明此法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取同一批已知含量的槐仙顆粒樣品（批號：20200701），精密稱取樣品約10 g，各6 份，分別定量加入黃芩苷對照品，依2.2 方法制備供試品溶液，測定黃芩苷含量。計算加樣加收率，結(jié)果平均回收率為99.09%，RSD 為1.84%,表明加樣回收率良好，見表1。

表1 黃芩苷回收率試驗結(jié)果

2.10 樣品測定

取槐仙顆粒不同批次的樣品10批，依“2.2”方法制備供試品溶液，測定黃芩苷含量，計算每克顆粒含黃芩苷的量，見表2。

表2 10批樣品含量測定結(jié)果（mg/g）

根據(jù)上述測定結(jié)果，結(jié)合《中國藥典》2015年版一部黃芩藥材中規(guī)定的黃芩苷含量限度［10］，以及本品黃芩苷的轉(zhuǎn)化率，暫將本品每克含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計，不得少于1.6 mg。

3 討論

（1）為了保證所測成分的靈敏度，實驗還對波長進行了選擇，取黃芩苷對照品溶液進行光譜掃描，結(jié)果對照品在277.84 nm 處有一較大的吸收峰，結(jié)合《中國藥典》2015年版一部黃芩藥材中黃芩苷含量測定項下的檢測波長為280 nm，故選擇280 nm為檢測波長。（2）為了確保各組分的分離及出峰時間，實驗對流動相進行了選擇比較，實驗對流動相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）和甲醇-乙腈-0.2%磷酸（35∶15∶50）進行了比較，結(jié)果流動相甲醇-乙腈-0.2%磷酸（35∶15∶50）黃芩苷對照品出峰時間過早，峰形較差。采用甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動相，黃芩苷與其他組分分離完全，結(jié)果滿意。（3）為了確保成分的充分提取，實驗比較了不同提取溶劑（70%乙醇及甲醇）、不同提取方法（70%乙醇超聲及70%乙醇回流）的樣品制備方法，最終確定70%乙醇超聲方法。既節(jié)能、環(huán)保，又操作方便。（4）本品方中主藥為槐角、黃芩，分別對該二味藥進行了大量研究，結(jié)果槐角苷含量較黃芩苷含量明顯偏低，且干擾較多，故不列入質(zhì)量控制標準。依《中國藥典》2015年版一部黃芩藥材項下標準選擇黃芩苷作為定量指標控制，以有效地控制本品的質(zhì)量。實驗證明，采用高效液相色譜法對本品中的黃芩苷進行定量，方法簡便、靈敏，重現(xiàn)性好。為院內(nèi)制劑槐仙顆粒的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。