感冒熱毒清合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

劉潔瓊，戴安印，濮曉燕，郭勝才

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院，浙江 杭州 310013

感冒熱毒清合劑是中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院（以下簡稱本院）根據(jù)名老中醫(yī)驗方并結(jié)合臨床實踐研制而成的中藥非標(biāo)準(zhǔn)制劑，質(zhì)量穩(wěn)定、起效快、臨床療效好。該制劑由連翹、知母、金銀花、蒲公英、板藍(lán)根、石膏等7 味中藥組方，具有清熱解毒、辛涼解表、抗菌消炎等功效，臨床上主要用于上呼吸道感染、病毒性感冒、急慢性扁桃體炎、咽喉炎、發(fā)熱等病癥。感冒熱毒清合劑已在本院生產(chǎn)使用近30年，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有綠原酸和連翹苷的薄層鑒別，無有效成分定量測定，為貫徹實施“軍隊醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計劃”，參照2015年版《中國藥典》和有關(guān)文獻(xiàn)［1-7］，對感冒熱毒清合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂，改進(jìn)了金銀花與綠原酸的鑒別方法和含量測定方法［4］，增加了蒲公英、知母的薄層鑒別，提高了制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效地控制制劑的生產(chǎn)質(zhì)量，使制劑質(zhì)量更穩(wěn)定，保證臨床用藥安全有效?，F(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司，萬分之一）；Cary 50 分光光度計（德國賀利氏瓦里安公司）；H.H.S4 數(shù)控恒溫水浴鍋（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠）；KQ-100DY型醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（HPLC純，中國淮安市恒天工貿(mào)有限公司）；乙腈（HPLC 純，中國淮安市恒天工貿(mào)有限公司）；純化水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201415，含量96.2%）；連翹苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110821-201514，含量93.5%）；其他試劑均為分析純。感冒熱毒清合劑樣品（本院制劑室提供，規(guī)格：250 mL，批號20171023、20171121、20180126）；陰性樣品按標(biāo)準(zhǔn)處方和制法制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 金銀花取本品5 mL，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1～2，用乙酸乙酯提取2 次，每次10 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。取缺金銀花的陰性對照品按標(biāo)準(zhǔn)處方和制法同法制成陰性對照溶液。稱取綠原酸對照品適量，配成每0.5 mg/mL的甲醇溶液，作為對照品溶液。遵照《中國藥典》2015年版四部通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠H薄層色譜板上，用乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置于波長365 nm的紫外燈下觀察。結(jié)果在供試品薄層色譜圖中，與對照品色譜的相應(yīng)位置，呈現(xiàn)相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液在相應(yīng)位置無斑點，表明在此薄層色譜條件下其他藥材對金銀花鑒別無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 金銀花薄層色譜圖

2.1.2 知母取本品40 mL，用水飽和的正丁醇作為提取溶劑，振搖提取3 次，每次40 mL，合并提取液，水浴蒸干，殘渣加20 mL 乙醇溶解，再加鹽酸2 mL，加熱回流1 h，放冷，加水10 mL，用石油醚20 mL（60～90 ℃）振搖提取2 次，合并石油醚提取液，水浴蒸干，殘渣用1 mL 乙醇溶解，作為供試品溶液。取缺知母的陰性對照藥材并按照感冒熱毒清處方和工藝同法制成陰性對照溶液。另取知母對照藥材粉末1 g，加稀乙醇20 mL，鹽酸2 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣用1 mL 乙醇溶解，作為知母對照藥材溶液。遵照《中國藥典》2015年版四部通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述3 種溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴適量5% 香草醛硫酸溶液，置105 ℃烘箱，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果在供試品色譜圖中，與對照藥材薄層色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點，陰性樣品無顯色斑點，表明陰性樣品在此條件下對知母鑒定無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 知母薄層色譜圖

2.1.3 蒲公英取感冒熱毒清10 mL，用乙酸乙酯超聲振搖提取2 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。按處方工藝取缺蒲公英的陰性對照品同法制成陰性對照溶液。另取蒲公英對照藥材1 g，加水煎煮2 次，每次1 h，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮至適量，加乙醇至含醇量60%，靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，放冷，同法提取，蒸干提取液，殘渣用1 mL 甲醇溶解，作為蒲公英對照藥材溶液。按照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液和蒲公英對照藥材溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮-冰醋酸（30∶1∶2∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置波長365 nm 紫外燈下檢視。感冒熱毒清供試品薄層色譜圖中，與對照品色譜的相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液在相應(yīng)位置無相同斑點，表明對鑒別無干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 蒲公英薄層色譜圖

2.2 綠原酸含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱為DiamonsiL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-1%醋酸（20∶80）；檢測波長327 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為室溫。理論塔板數(shù)按綠原酸色譜峰計算不低于2 000。

2.2.2 溶液制備對照品溶液制備：精密稱取綠原酸對照品0.012 7 g，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，作為對照品貯備液。精密量取此對照品貯備液3 mL，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 mL 含60.96 μg的對照品溶液，即得。供試品溶液制備：精密量取感冒熱毒合劑25 mL，置50 mL 量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理30 min（功率300 W，頻率45 kHz），放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得?？瞻兹芤褐苽洌壕芰咳≌崭忻盁岫厩逄幏胶团渲乒に囍苽涞娜苯疸y花的陰性對照溶液25 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理30 min（功率300 W，頻率45 kHz），放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 專屬性分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、空白溶液各10 μL，在“2.2.1”色譜條件下分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖4。結(jié)果：對照品綠原酸主峰的保留時間為12.38 min，供試品溶液中的綠原酸保留時間為12.50 min，供試品溶液與對照品溶液綠原酸主峰的保留時間基本一致，在此色譜條件下溶劑及其他中藥成分不干擾綠原酸的測定，表明方法專屬性良好。

圖4 高效液相色譜圖：A.陰性對照品溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液

2.2.4 線性關(guān)系精密量取對照品貯備液1、2、3、4、5 mL，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性系列供試液。精密量取上述供試液各10 μL，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，求出綠原酸的線性回歸方程為Y=34.93X-142.30，r=0.999 2，表明綠原酸在20.32 μg/mL～101.60 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗精密吸取2.2.2 項下對照品溶液10 μL，照“2.2.1”色譜條件注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，測定峰面積，計算相對精密度RSD，6 次進(jìn)樣綠原酸色譜圖峰面積的RSD 為0.29%，表明精密度結(jié)果良好。

2.2.6 重復(fù)性考察精密量取同一批次的感冒熱毒清合劑（批號20180126）25 mL，共6 份，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，依法測定含量。結(jié)果綠原酸含量的RSD 值為1.09%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液10 μL，在“2.2.1”色譜條件下，分別于0，3，6，9，12，24 h 時進(jìn)樣，測定綠原酸峰面積，計算峰面積RSD，測得RSD 為1.58%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 基本穩(wěn)定。

2.2.8 回收率試驗精密量取已知含量的感冒熱毒清合劑供試品（批號20180126）12.5 mL 9 份，置于9個50 mL 容量瓶中，編號，分別精密加入“2.2.2”項下對照品儲備液1、3 和5 mL，加50%甲醇適量，超聲處理30 min（功率300 W，頻率45 kHz），放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，配成高、中、低3個綠原酸濃度水平的加樣溶液，每個濃度水平平行做3 份，濾過，取續(xù)濾液10 μL，照2.2.1 色譜條件注入液相色譜儀，分別計算平均回收率。實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果見表1。

表1 綠原酸加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.2.9 樣品含量測定取3批感冒熱毒清合劑（批號為20171023、20171121、20180126），按“2.2.2”制備供試品溶液，取10 μL，照2.2.1 色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計算綠原酸含量。結(jié)果依次為0.137、0.138 和0.129 mg/mL。

3 討論

感冒熱毒清是本院使用多年的自制制劑，由七味中藥經(jīng)提取制成，為有效控制制劑質(zhì)量，保證患者使用安全有效，通過實驗增加了知母、蒲公英的薄層色譜鑒別，簡化了綠原酸薄層色譜展開系統(tǒng)，鑒別方法簡單，操作簡便，重現(xiàn)性好。

金銀花為常用中藥，現(xiàn)代藥理研究表明，金銀花具有抗炎抑菌、抗病毒等作用，其主要有效成分為綠原酸，制劑中的綠原酸有效成分可選擇用乙醇或者甲醇來提取，通過大量預(yù)實驗最終選擇50%甲醇為提取溶劑，在此條件下對綠原酸的提取率較高，且無需萃取濃縮等預(yù)處理，感冒熱毒清合劑可直接稀釋并經(jīng)超聲后過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣，不但方法簡便，操作方便，而且結(jié)果準(zhǔn)確，分離度好，可以快速進(jìn)行制劑質(zhì)量檢測。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，測定綠原酸的高效液相色譜條件多選擇乙腈-0.4%磷酸溶液或甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液三元體系作為流動相［4-7］，磷酸鹽緩沖溶液易析出結(jié)晶，造成色譜系統(tǒng)堵塞，我們經(jīng)過大量實驗摸索，最終選擇用甲醇代替乙腈，冰醋酸代替磷酸鹽，以甲醇-1%冰醋酸（20∶80）作為流動相，結(jié)果表明，在此條件下綠原酸的色譜峰分離度佳，峰形良好，保留時間適中，且不會引起色譜系統(tǒng)堵塞，其他成分對測定無干擾，測定數(shù)據(jù)可靠、結(jié)果準(zhǔn)確，便于分析測定。

綜上所述，本試驗采用薄層色譜鑒別蒲公英、知母和金銀花，RP-HPLC 測定綠原酸含量，方法簡便快捷，靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于醫(yī)院制劑感冒熱毒清合劑的質(zhì)量控制。