煙薊馬取食與機械損傷對小蔥保護酶的影響

楊曉婷

（昌寧縣農(nóng)田和農(nóng)村能源管理站，云南昌寧 678100）

昆蟲取食和機械損傷時植物體同時存在保護酶系統(tǒng)，能夠清除體內(nèi)多余的自由基?？寡趸到y(tǒng)實際就是保護酶系統(tǒng)，它由許多酶和還原性物質(zhì)組成，其中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）是主要的抗氧化酶，植物提高對逆境的抗性是通過抗氧化酶加強抗氧化作用，從而防治自由基毒害。SOD的活性氧脅迫，是植物在逆境脅迫條件下產(chǎn)生的，對于清除超氧自由基起關(guān)鍵作用。CAT是一種抗氧化酶，在植物體組織中普遍存在，是生物氧化過程中一系列抗氧化酶的終端，能夠有效清除植物體內(nèi)多余的H2O2。POD是活性較高的適應(yīng)性酶，能夠反映體內(nèi)代謝狀況以及對外環(huán)境的適應(yīng)性、植物生長發(fā)育的特性。

從春雷等研究了西花薊馬取食與機械損傷對菜豆葉片抗氧化系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)西花薊馬取食與機械損傷兩種處理誘導(dǎo)及處理誘導(dǎo)時間的不同導(dǎo)致（SOD、POD、CAT）三種抗氧化酶活性有不同程度的升高，但變化規(guī)律不完全相同，西花薊馬對菜豆葉片的取食誘導(dǎo)明顯高于機械損傷對菜豆葉片抗氧化系統(tǒng)的影響。從春雷等對薊馬取食、機械損傷以及外源物對菜豆葉片的防御酶活性影響的研究，結(jié)果表明不同處理可誘導(dǎo)菜豆植株產(chǎn)生明顯的防御反應(yīng)。其他昆蟲的取食和機械損傷也可以引起植物體內(nèi)保護酶活性的變化，如MithoFer等研究表明，?；页嵋苟闟podoptera littoralis （Boisduval）取食和機械損傷處理后利馬豆Phaseolus Lunatus（Linnaeus）葉片內(nèi)SOD、CAT及POD的活性均升高。毛紅等研究綠盲蝽取食與機械損傷對棉花葉片內(nèi)防御酶活性的影響，結(jié)果表明綠盲蝽取食誘導(dǎo)不同抗性葉片的PAL、POD和PPO的活性顯著升高，機械損傷處理后，PAL、POD和PPO的活性變化沒有綠盲蝽取食誘導(dǎo)的明顯。本研究說明，這些酶活性的變化與逆境條件和脅迫時間有關(guān)。王艷穎等機械損傷對富士蘋果抗氧化酶活性的影響的研究表明，機械損傷顯著的影響了抗氧化酶的活性變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗蟲源

從周邊的蔥地采集煙薊馬成蟲，放到實驗室60 cm×60 cm×60 cm的養(yǎng)蟲籠中進行養(yǎng)殖，實驗室溫度在20～30 ℃適合煙薊馬成蟲的生長繁殖。在花盆上栽種小蔥放到養(yǎng)蟲籠里供煙薊馬成蟲食用。

1.1.2 不同處理操作

對照處理：在溫室大棚里栽種20盆小蔥，待蔥長大之后健康未受損小蔥葉片作為空白對照。

取食誘導(dǎo)處理：取10 cm長的健康小蔥蔥葉兩根，每根截成長度相等的3段放入玻璃管，用自制的吸蟲器吸取40頭煙薊馬成蟲放入玻璃管，立即用生物膜白處理，封上管口開始計時，進行煙薊馬的取食處理。

機械損傷誘導(dǎo)處理：在花盆上找到健康未受損的蔥葉，用消過毒的針頭在蔥葉上等距離刺10個孔作為機械損傷，并開始計時，做好標記。

1.1.3 實驗主要試劑與儀器

試驗主要試劑：測定植物三種保護酶試劑盒中的各種試劑，包括0.1mL/L磷酸鹽pH值7.0～7.4緩沖液、雙蒸水、Nacl。

試驗主要儀器：光照培養(yǎng)箱、電子天平、吸蟲管、容量瓶、昆蟲飼養(yǎng)籠、移液槍、藥匙、試管、水浴鍋、低速冷凍多管離心機、離心管、玻璃棒、小刀、分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 過氧化物酶（POD）的活力測定

稱取小蔥葉片1 g，為制備不同濃度的勻漿液加入不同量的Nacl，在0 ℃冰箱內(nèi)靜置3 min后取出，立即機械勻漿，3500 r/min的條件下離心10 min，取上清液待測。待測液于420 nm處顯色反應(yīng)，步驟（見表1）。

表1 測定POD活性試劑用量（mL）

1.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）的活力測定

稱取小蔥葉片1g，為制備不同濃度的勻漿液加入不同量的0.1mL/L磷酸鹽pH值 7.0～7.4緩沖液，在0℃冰箱內(nèi)靜置3 min后取出，立即機械勻漿，3500 r/min的條件下離心10 min，取上清液待測。待測液于550 nm處顯色反應(yīng)，步驟（見表2）。

表2 測定SOD活性試劑用量（mL）

1.2.3 過氧化氫酶（CAT）的活力測定

稱取小蔥葉片1g，為制備不同濃度的勻漿液加入不同量的生理鹽水，在0℃冰箱內(nèi)靜置3 min后取出，立即機械勻漿，3500 r/min的條件下離心10 min，取上清液待測。待測液于405 nm處顯色反應(yīng)，步驟（見表3）。

表3 測定CAT活性試劑用量（mL）

2 結(jié)果與分析

2.1 組織勻漿濃度和不同處理對小蔥超氧化物歧化酶活力的影響

2.1.1 組織勻漿濃度對小蔥超氧化物歧化酶活性的影響

根據(jù)勻漿濃度與絕對OD值繪制標準曲線，由圖1可知，當(dāng)組織勻漿濃度為0.03g/mL以后，絕對OD值變趨近于0.6，濃度再升高，絕對OD值差異不大。所以當(dāng)組織勻漿濃度為0.03g/mL時，超氧化物歧化酶活性趨近于最大值。

圖1 勻漿濃度與絕對OD值變化趨勢圖

2.1.2 不同處理對超氧化物歧化酶活力的影響

煙薊馬取食與機械損傷誘導(dǎo)處理小蔥葉片后，SOD的活力在不同時間內(nèi)表現(xiàn)不同。誘導(dǎo)24 h時取食誘導(dǎo)蔥葉內(nèi)SOD活力與健康植株相比無明顯變化，機械損傷處理明顯高于健康植株；誘導(dǎo)48 h時煙薊馬取食和機械損傷處理SOD活力明顯高于健康植株；誘導(dǎo)72 h時煙薊馬取食處理SOD活力升高到最高值，至96 h時酶活力略有下降，但仍然高于健康植株，機械損傷處理和健康植株酶活力無明顯變化（見表4）。

表4 不同處理的SOD活力時間變化（U/g）

由圖2可知，健康植株活力在不同時間保持不變在77 U/g附近；機械損傷在處理24 h時就達到了最大值123 U/g，后逐漸下降；煙薊馬取食處理是一個先上升后下降的過程，在72 h時達到最高點123 U/g。

圖2 不同處理的SOD活力時間變化

2.2 組織勻漿濃度和不同處理對小蔥過氧化物酶活力的影響

2.2.1 組織勻漿濃度對小蔥過氧化物酶活性的影響

由圖3可看出，當(dāng)植物組織勻漿濃度在0.04 g/mL以后，絕對OD值在0.45附近，濃度再增加絕對OD值變化不大，所以組織勻漿濃度為0.04 g/mL時活性趨近最大值。

圖3 勻漿濃度與絕對OD值變化趨勢圖

2.2.2 不同處理對過氧化物酶活力的影響

煙薊馬取食和機械損傷誘導(dǎo)對POD活力的影響在不同時間范圍有所不同。由表5可知，誘導(dǎo)處理24 h時，機械損傷和取食誘導(dǎo)處理對蔥葉內(nèi)POD活力無明顯影響；48 h時兩種誘導(dǎo)處理的POD活力明顯高于健康植株，但兩處理之間無顯著差異；至72 h時兩處理的蔥葉POD活力均達到最高值，且明顯高于健康植株，煙薊馬取食誘導(dǎo)的POD活力也明顯高于機械損傷。隨后酶活力下降；到96 h時兩種處理與健康植株均無明顯差異。

表5 不同處理的POD活力時間變化（u/g）

由圖4可看出，健康植株在不同時間的變化過程中，POD活性變化不明顯，活力值接近60 U/g；機械損傷處理POD活力是先上升后下降，在72 h時達到最大值97 U/g，后下降至與健康植株差別不大；煙薊馬取食處理也是先上升后下降的過程，在72 h時達到最大值133 U/g，后下降到健康植株酶活力水平。

圖4 不同處理的POD活力時間變化

2.3 組織勻漿濃度和不同處理對小蔥過氧化氫酶活力的影響

2.3.1 組織勻漿濃度對小蔥過氧化氫酶活性的影響

根據(jù)勻漿濃度與絕對OD值繪制標準曲線（圖5），由圖可看出當(dāng)勻漿濃度為0.03 g/mL以后，絕對OD值趨近于0.35，濃度再升高，絕對OD值變化不大，所以當(dāng)組織勻漿濃度為0.03 g/mL時，過氧化氫酶活性趨近于最大值。

圖5 勻漿濃度與絕對OD值變化趨勢圖

2.3.2 不同處理對過氧化氫酶活力的影響

煙薊馬取食與機械損傷對小蔥CAT活力在時間范圍內(nèi)也有明顯變化。24 h時機械損傷與取食誘導(dǎo)處理酶活力都略高于健康植株；至48 h時誘導(dǎo)處理葉片與健康植株相比差異顯著；72 h時煙薊馬取食處理酶活力顯著上升，機械損傷處理下降，但仍然高于健康植株；96 h時煙薊馬取食上升至最大值，機械損傷和健康植株酶活力無明顯差異，（見表6）。

表6 不同處理的CAT活力時間變化（U/g）

（續(xù)上表）

由圖6可看出，健康植株在不同時間CAT活力無明顯變化，活力值接近45 U/g；機械損傷是一個先上升后下降的過程，在48 h時達到最高值91 U/g，后下降到和健康蔥葉活力無明顯差異；煙薊馬取食誘導(dǎo)是一個逐漸上升的過程，在96 h時達到最高值。

圖6 不同處理的CAT活力時間變化

3 結(jié) 論

3.1 薊馬取食與機械損傷對過氧化物酶活力的影響

薊馬取食誘導(dǎo)處理SOD活力隨處理時間不斷上升，最大值出現(xiàn)在72 h時（123.48 U/g），至96 h時SOD活力已降至與48 h時接近；機械損傷處理在24 h時就達到了最大值（123.84 U/g），之后SOD活力一直下降，至96 h時與健康植株接近；兩誘導(dǎo)處理葉片SOD活力顯著高于健康植株，在整個誘導(dǎo)處理過程中，煙薊馬取食誘導(dǎo)SOD活力也明顯高于機械損傷誘導(dǎo)。

3.2 煙薊馬取食與機械損傷對超氧化物歧化酶活力的影響結(jié)果

煙薊馬取食誘導(dǎo)處理、機械損傷誘導(dǎo)處理POD活力變化均為先上升后下降。誘導(dǎo)處理24 h時，機械損傷和取食誘導(dǎo)處理對蔥葉內(nèi)POD活力無明顯影響；48 h時兩種誘導(dǎo)處理的POD活力明顯高于對照處理；至72 h時兩處理的蔥葉POD活力均達到最高值，且明顯高于健康植株，煙薊馬取食誘導(dǎo)POD活力也明顯高于機械損傷誘導(dǎo)；到96 h時兩種處理與健康植株均無明顯差別。

3.3 煙薊馬取食與機械損傷對過氧化氫酶活力的影響結(jié)果

機械損傷誘導(dǎo)處理CAT活力變化是先上升后下降，最大值出現(xiàn)在48 h時（91.22 U/g）之后不斷下降，至96 h時與對照接近；煙薊馬取食誘導(dǎo)24 h時CAT活力比健康植株略高，之后一直上升，96 h時酶活力達到最大值（96.47 U/g）；煙薊馬取食誘導(dǎo)處理CAT活力最大值略高于機械損傷誘導(dǎo)處理。

總之，煙薊馬取食誘導(dǎo)和機械損傷處理對蔥葉內(nèi)過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力均有影響，影響度是：煙薊馬取食處理＞機械損傷處理＞對照處理；保護酶活性在誘導(dǎo)的不同時間段變化規(guī)律也不完全相同，煙薊馬取食處理對小蔥保護酶的影響高于機械損傷處理。