中藥活性成分直接作用靶點鑒定研究方法及應(yīng)用

魏君楠，戴建業(yè)

中藥活性成分直接作用靶點鑒定研究方法及應(yīng)用

魏君楠，戴建業(yè)*

蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

中藥因其確切的臨床療效受到越來越多的關(guān)注。隨著對中藥活性成分的深入研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多具有獨特活性和藥效的潛在創(chuàng)新藥物。然而，如何進一步對其藥效機制進行挖掘、發(fā)現(xiàn)全新的機制和靶點，成為創(chuàng)新中藥研究的關(guān)鍵。中藥活性成分靶點鑒定一直是研究者們所探尋的重要課題。隨著化學(xué)生物學(xué)技術(shù)尤其是化學(xué)蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的方法被建立并用于中藥活性成分的靶點鑒定。簡單來說，這些方法大致可被分為標記法和非標記法。標記法是通過將中藥活性成分改造為活性探針，進而探尋它們的作用靶標蛋白；而非標記法主要是基于中藥活性成分和靶標蛋白結(jié)合后會影響靶標蛋白的熱穩(wěn)定性等生物物理性質(zhì)從而識別可能的作用靶點。主要針對這2大類靶點鑒定方法進行歸納整理，從方法原理、大致操作流程、應(yīng)用、優(yōu)缺點等方面進行闡述，為中藥活性成分靶點鑒定提供一定的參考，以期助力中藥創(chuàng)新研究。

中藥活性成分；靶點鑒定；標記法；非標記法；活性探針

藥物的原始創(chuàng)新研究一直備受關(guān)注。中藥作為經(jīng)過長期臨床驗證的具有完整理論體系的中華文化瑰寶，應(yīng)該成為藥物原始創(chuàng)新研究的寶庫。如何將現(xiàn)有臨床用藥經(jīng)驗以及理論轉(zhuǎn)化為藥物創(chuàng)新的動力，成為中醫(yī)藥研究者必須面對的問題。中藥具有多成分、多靶點的特點，而中藥活性成分是中藥中具有醫(yī)療效用或生理活性的單體化合物，是新藥研發(fā)的重要來源。靶點是中藥活性成分發(fā)揮作用的基礎(chǔ)[1]。中藥活性成分通過靶向作用于體內(nèi)的生物大分子，調(diào)節(jié)其生物活性，進而調(diào)控靶點分子下游的細胞信號通路，擾動疾病網(wǎng)絡(luò)，從而預(yù)防和治療疾病[2]，因此明確中藥活性成分作用靶點是中藥研發(fā)的關(guān)鍵。中藥具有廣泛的適應(yīng)癥，若可以精確關(guān)聯(lián)中藥活性成分及其適應(yīng)癥，再對中藥活性成分進行深入的機制研究及靶點注釋，將“中藥-活性成分-靶點”串聯(lián)起來，將有望突破現(xiàn)有知識體系的限制，發(fā)現(xiàn)全新機制和靶點，推動原始創(chuàng)新藥物研究，為疾病治療提供新策略。

原始創(chuàng)新藥物研究的關(guān)鍵是發(fā)現(xiàn)全新的機制和靶點，而對具有已知藥效的中藥活性成分直接作用靶點進行鑒定將具有事半功倍的效果。一直以來，中藥及其活性成分的靶點鑒定是學(xué)者們持續(xù)關(guān)注且致力探索的領(lǐng)域，但鑒于未知小分子-蛋白相互研究方法的缺失，中藥活性成分靶點鑒定面臨嚴峻挑戰(zhàn)。隨著化學(xué)生物學(xué)、生物物理學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，藥物靶標識別和機制的闡明取得了重大進展，對揭示中藥藥效機制以及與全新靶點的理性設(shè)計至關(guān)重要[3]。目前中藥活性成分靶點主要是蛋白靶點，活性成分蛋白靶點鑒定的方法可分為標記法和非標記法。本文將從這2個方面展開解析，為中藥活性分子靶點鑒定的研究提供借鑒。

1 基于標記法對活性成分靶點進行鑒定

標記法是通過化學(xué)改造，將中藥活性成分改造成具有標記能力的探針，進而通過熒光成像或富集技術(shù)，對其作用靶點蛋白進行鑒定。最傳統(tǒng)的方法是親和色譜-蛋白質(zhì)譜學(xué)聯(lián)用法，其大致流程為對活性成分進行結(jié)構(gòu)改造，引入生物素與細胞裂解液共孵育，當藥物與其靶標蛋白形成穩(wěn)定結(jié)合后，利用一定固載方式（如瓊脂糖珠等）進行富集，最后通過變性或競爭實驗將結(jié)合蛋白洗脫下來進行鑒定。對于親和色譜法來說，主要存在2個缺陷：第1個是需要區(qū)分真正的高親和力靶標蛋白質(zhì)與低親和力但豐度高的蛋白質(zhì)；第2個是洗脫過程依賴經(jīng)驗，洗滌條件過強會大大減少鑒定到的靶點數(shù)，而洗脫條件過弱則會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，同時瓊脂糖珠上的非特異性吸附也會造成假陽性結(jié)果[4]。由此，化學(xué)和生物學(xué)家們一直在發(fā)展同時適用于低豐度或者結(jié)合力相對弱的靶點鑒定方法，其中最突出、實用的是基于活性的蛋白質(zhì)分析（activity-based protein profiling，ABPP）[5]。ABPP由美國Scripps研究所Cravatt課題組首次提出，該方法的核心是設(shè)計1個可以在蛋白質(zhì)組水平上與蛋白活性中心共價或非共價反應(yīng)的“活性分子探針（activity-based probe，ABP）”。

ABP主要包括2部分：第1部分是反應(yīng)基團即活性基團，反應(yīng)基團是活性分子探針的核心，決定了在蛋白質(zhì)組學(xué)中與其反應(yīng)的蛋白種類以及氨基酸殘基，對于某些反應(yīng)基團可以選擇性地與蛋白質(zhì)組中某一類蛋白酶的活性中心結(jié)合，并與其中執(zhí)行重要功能的親核氨基酸發(fā)生共價反應(yīng)，將探針與靶標蛋白牢牢地結(jié)合在一起[6]；但對于無法和靶標蛋白共價結(jié)合的探針，就需要引入光交聯(lián)基團將非共價作用轉(zhuǎn)化為共價作用，這種技術(shù)稱為光親和力標記（photoaffinity Labeling，PAL）[7]。PAL基本思路是在化合物中引入光交聯(lián)基團[8]，常用的光交聯(lián)基團包括二苯甲酮、芳香疊氮、雙吖丙啶[9]。通過PAL技術(shù)可以幫助標記細胞或者細胞裂解液中低豐度或與探針親和力較弱的靶標蛋白，也可以標記膜上受體等通常方法不易鑒定的蛋白質(zhì)[10]。第2部分是報告基團，報告基團主要包括羅丹明、熒光素等熒光基團以及生物素。羅丹明等熒光基團可以實現(xiàn)對靶標蛋白的可視化、高通量檢測；生物素可以通過與鏈霉親和素（streptavidin，SA）反應(yīng)實現(xiàn)對靶標蛋白的富集，然后進行生物質(zhì)譜分析。此外，將ABPP與細胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標記、同位素二甲基化標記等技術(shù)聯(lián)用，可以實現(xiàn)對照組和實驗組間的直接蛋白定量[11]。

在基于標記法對活性成分靶點進行鑒定的過程中最重要的是對活性成分的結(jié)構(gòu)進行修飾，化合物活性探針的構(gòu)建主要包括通過引入生物素標簽構(gòu)建活性成分探針、通過引入炔基或疊氮構(gòu)建活性成分探針以及針對活性氨基酸殘基的分子探針。

1.1 通過引入生物素標簽構(gòu)建活性成分探針

該方法的大致思路是通過對活性成分結(jié)構(gòu)進行修飾，引入生物素分子標簽作為報告基團構(gòu)建靶標-化合物-標簽，用SA進行富集從而實現(xiàn)活性成分靶標的富集以及鑒定。生物素廣泛存在于動植物的組織中，生物素分子主要由2部分組成：一部分是與親和素結(jié)合的咪唑酮環(huán)，另一部分是噻吩環(huán)，噻吩環(huán)的C-2位上連有戊酸側(cè)鏈，可以通過對戊酸側(cè)鏈的改造從而將其引入到活性成分中。親和素是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的堿性糖蛋白，生物素和親和素之間存在天然的特異性強相互作用，此外1個生物素可以與4個親和素結(jié)合，這一特點可以用于構(gòu)建1個多層次信號放大系統(tǒng)[12]。但由于親和素帶有1個糖鏈側(cè)鏈，容易和細胞表面的多糖發(fā)生非特異性親和，因此又開發(fā)出SA，SA由完全相同的4條肽鏈組成，1個生物素仍然可以和4個SA結(jié)合，但是其沒有糖基側(cè)鏈，從而避免了與膜表面的多糖發(fā)生特異性結(jié)合[13]。該法極大地減少了后續(xù)實驗操作步驟，還可以通過改變小分子與生物素之間的連接基團，有效地調(diào)整探針的脂溶性以及水溶性。

Zhu等[14]報道了雷公藤紅素可以通過抑制抵抗性炎癥改善高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征，其通過對雷公藤紅素結(jié)構(gòu)進行修飾在其羧基端引入生物素，構(gòu)建Cel-biotin分子探針，之后和標記的核糖核酸親和純化（tagged RNA affinity purification，TRAP）技術(shù)聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以與腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1（cyclase associated protein 1，CAP1）結(jié)合，抑制CAP1與抵抗素的相互作用，從而抑制環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）-核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路，改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠代謝綜合征。Zhao等[15]合成了生物素化的雷公藤甲素和熒光菁標記的雷公藤甲素，以富集和可視化雷公藤甲素靶標蛋白，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以靶向過氧化物酶I（peroxredoxin I，Prx I）。Prx I是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)，既作為抗氧化酶又作為分子伴侶，在腫瘤和炎癥發(fā)展中起著重要作用。雷公藤甲素可以與在維持Prx I的十聚體結(jié)構(gòu)和伴侶活性中起關(guān)鍵作用的83和173位半胱氨酸特異性地結(jié)合，觸發(fā)Prx I的高相對分子質(zhì)量低聚物的解離，從而以劑量相關(guān)性的方式抑制其伴侶活性，但不抑制其過氧化物酶活性。Dong等[16]在ainsliadimer A羥基位引入生物素進行靶標蛋白的釣取，ainsliadimer A含有α,β-不飽和烯酮，可以與靶標蛋白中的半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)從而實現(xiàn)小分子和靶標蛋白的共價結(jié)合；通過生物素-ainsliadimer A探針富集到了IκB激酶抑制劑α/β（inhibitor of IκB kinase α/β，IKKα/β）蛋白，ainsliadimer A可以選擇性地與IKKα/β 46位半胱氨酸殘基結(jié)合，通過變構(gòu)效應(yīng)抑制它們的活性，從而抑制NF-κB信號通路，進而誘導(dǎo)癌細胞死亡并抑制體內(nèi)腫瘤生長以及內(nèi)毒素介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。Liu等[17]對腺花香茶菜中的活性二萜化合物腺花素進行結(jié)構(gòu)改造，在其活性羥基端引入了生物素構(gòu)建腺花素探針，利用此探針釣取到靶標蛋白過氧化物酶（Prx I和Prx II），腺花素通過靶向Prx I和Prx II的半胱氨酸，抑制該過氧化物酶活性提高細胞內(nèi)過氧化氫水平，激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，上調(diào)CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β轉(zhuǎn)錄水平，從而誘導(dǎo)急性早幼粒細胞白血病細胞的分化并抑制腫瘤生長。Statsuk等[18]對海洋天然產(chǎn)物bistramide A進行結(jié)構(gòu)修飾引入生物素，通過SA基質(zhì)進行靶點富集，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)肌動蛋白（actin）是bistramide A的細胞受體，可以直接與單體G-actin以1∶1比例結(jié)合從而破壞actin的細胞骨架，抑制actin聚合，在體外解聚合絲狀F-actin，從而抑制細胞增殖。

1.2 通過引入炔基或疊氮構(gòu)建活性成分探針

通過對化合物結(jié)構(gòu)進行修飾引入長鏈生物素來進行靶標蛋白的富集，其缺點在于生物素相對分子質(zhì)量較大，會在一定程度上影響化合物的脂溶性使其不易進入細胞，此外也會因空間位阻較大影響化合物與靶標蛋白的結(jié)合。為了減小生物素等報告基團對化合物的影響實現(xiàn)生理條件下的標記，點擊化學(xué)-ABPP（click chemistry-ABPP，CC-ABPP）應(yīng)運而生，該技術(shù)的原理為在盡可能小地改變化合物生理活性的前提下引入相對分子質(zhì)量較小的炔基或者疊氮，利用銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAc）或者環(huán)張力誘導(dǎo)的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（strain promoted azide-alkyne cycloaddition，SPACC）等生物正交反應(yīng)，將生物素、熒光素等其他報告基團連接在探針上實現(xiàn)對化合物靶標蛋白的富集以及可視化，這種方式使得探針能夠更好地模擬小分子在細胞內(nèi)的作用模式[19]。

Wang等[20]在青蒿素上連接1個炔基，合成了1個與青蒿素有相同活性和結(jié)合位點的探針，用以檢測青蒿素在治療瘧疾過程中的靶標蛋白和具體作用機制，共尋找到124個相關(guān)靶點蛋白，涉及瘧原蟲體內(nèi)的各種通路；發(fā)現(xiàn)激活青蒿素的鐵離子來源于血紅素結(jié)合鐵而非游離鐵離子，青蒿素主要作用于瘧原蟲生命活動的后期而非初期。此外，合成了1個具有炔基的姜黃素探針，采用點擊化學(xué)結(jié)合同位素標記相對的絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)解析了姜黃素抗結(jié)腸癌的靶標蛋白，從人結(jié)腸癌HCT116細胞中確定了197個蛋白作為姜黃素結(jié)合靶點，這些靶點廣泛分布于細胞核、線粒體和質(zhì)膜中，參與代謝過程、調(diào)控、刺激反應(yīng)和細胞過程等多種生物學(xué)功能，提示姜黃素通過作用于真核翻譯起始因子2（eukaryotic translation initiation factor 2，EIF2）、EIF4/p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路和線粒體功能障礙通路等多個關(guān)鍵的生物學(xué)通路發(fā)揮抗癌作用，進一步驗證表明姜黃素可以通過下調(diào)細胞蛋白合成，誘導(dǎo)自噬、激活溶酶體和增加活性氧產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細胞死亡[21]。Dai等[22]針對黃芩中的主要成分黃芩苷改善飲食誘導(dǎo)的肥胖（diet-induced obese，DIO）和肝脂肪變性的靶標蛋白開展了深入研究，通過對黃芩苷的結(jié)構(gòu)修飾引入了二苯甲酮作為光交聯(lián)基團，以炔基為手臂構(gòu)建了黃芩苷探針，利用此探針確定了脂肪酸氧化控制酶肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）為黃芩苷的關(guān)鍵靶點，黃芩苷選擇性直接激活肝臟CPT1，加速脂質(zhì)流入線粒體進行氧化，從而改善DIO和肝脂肪變性。衣康酸是一種參與病原體巨噬細胞相互作用的抗炎代謝物，Qin等[23]開發(fā)了一種特異性的生物正交探針衣康酸酯炔，用于炎性巨噬細胞中衣康酸結(jié)合的定量和位點特異性化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在炎性巨噬細胞中鑒定了1926個衣康酸蛋白靶點，包括199個超敏蛋白靶點；此外，位點特異性分析發(fā)現(xiàn)了1131個半胱氨酸位點，包括參與炎性反應(yīng)和宿主防御的關(guān)鍵蛋白。Zhao等[24]將炔基引入到鶴草酚中，與疊氮生物素發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)并被SA捕獲，找到了鶴草酚殺死結(jié)核分枝桿菌作用的關(guān)鍵靶點Rv3852；Rv3852是一個可預(yù)測的、體外結(jié)合DNA的膜蛋白，等溫滴定量熱法證實鶴草酚與Rv3852之間存在配體-蛋白相互作用，導(dǎo)致Rv3852的DNA結(jié)合功能被破壞從而殺死結(jié)核分枝桿菌。

1.3 針對活性氨基酸殘基的分子探針

由于要參與催化反應(yīng)，蛋白酶活性中心的氨基酸殘基通常是內(nèi)在化學(xué)性質(zhì)較為活潑的氨基酸[6]，針對不同的氨基酸殘基相繼開發(fā)出具有專一性的小分子探針，此外探針中不同類別的活性碳親電體在蛋白質(zhì)組中也顯示出迥然不同的氨基酸偏好。Weerapana等[25]合成了一些帶有不同親電基團的分子探針，不同種類的碳親電試劑在蛋白質(zhì)組中表現(xiàn)出明顯不同的氨基酸標記譜。2-氯--(6,5-炔基)乙酰胺和1-辛烯-7-炔-3-酮探針的反應(yīng)性非常有限，它們選擇性地標記蛋白質(zhì)組中的半胱氨酸殘基，2-氯--(6,5-炔基)乙酰胺可以和半胱氨酸上的巰基發(fā)生親核取代；1-辛烯-7-炔-3-酮含有α,β不飽和酮，可以和巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。相比之下，十一碳- 10-炔-1-醇-苯磺酸鹽探針對天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和組氨酸殘基等氨基酸進行了獨特的標記。

由于巰基的高親核性和氧化還原活性，蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基具有多種催化和調(diào)節(jié)功能，定量研究半胱氨酸反應(yīng)性的蛋白質(zhì)組學(xué)可以為復(fù)雜蛋白質(zhì)組中功能半胱氨酸殘基的翻譯后修飾狀態(tài)提供有價值的信息。碘乙酰胺-炔是ABPP研究中應(yīng)用最廣泛的硫醇反應(yīng)探針，該探針可以和半胱氨酸殘基上的巰基共價結(jié)合，利用該探針可以對蛋白質(zhì)組中的反應(yīng)型半胱氨酸進行鑒定。Weerapana等[26]利用碘乙酰胺探針描述了一種基于同位素標記的小分子親電試劑的定量反應(yīng)譜，來全面表征蛋白質(zhì)組中的半胱氨酸功能和活性。利用此探針在活細胞中標記到了大量高反應(yīng)活性的半胱氨酸，在檢測到的890個人類蛋白中共標記了8910個半胱氨酸中的1082個，在蛋白質(zhì)組中這些高反應(yīng)活性的半胱氨酸對其蛋白發(fā)揮重要的催化和/或調(diào)節(jié)功能。Abo等[27]對碘乙酰胺探針進一步優(yōu)化合成了一種籠狀溴甲基酮親電試劑caged-BK探針，該探針通過紫外光照控制親電試劑的活化，利用該探針監(jiān)測了人表皮癌A431細胞在表皮生長因子刺激下細胞活性氧釋放時半胱氨酸的反應(yīng)性變化，為識別不同半胱氨酸修飾相關(guān)反應(yīng)性變化研究提供了一個的強大工具。Qin等[28]報道了用于代謝聚糖標記的過氧乙?；翘烊粏翁侨缢孽；?疊氮乙酰甘露糖胺，可以與各種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)上的半胱氨酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，為開發(fā)基于半胱氨酸糖基化的半胱氨酸分析策略提供了機會。

絲氨酸水解酶是在真核生物和原核生物中發(fā)現(xiàn)的最大和最多樣化的一類酶，絲氨酸水解酶占哺乳動物中所有蛋白質(zhì)的1%，在凝血、消化、神經(jīng)系統(tǒng)信號傳導(dǎo)、炎癥和癌癥等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。此外，絲氨酸水解酶在細菌和病毒中也發(fā)揮著重要作用[29]。Liu等[5]設(shè)計了1個帶有氟磷酸反應(yīng)基團的分子探針，氟磷酸可以和絲氨酸水解酶活性中心的絲氨酸殘基羥基發(fā)生親核取代。-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯是絲氨酸水解酶抑制劑，其中氨基甲酸酯作為反應(yīng)基團可以與絲氨酸水解酶中心的絲氨酸殘基發(fā)生共價反應(yīng)，它依賴于活性位點絲氨酸殘基羥基的強親核性。Niphakis等[30]合成了一系列氨基甲酸酯的衍生物探針來探究其在蛋白質(zhì)組中的反應(yīng)活性以及選擇性，發(fā)現(xiàn)它們都可以選擇性地與小鼠體內(nèi)不同的絲氨酸水解酶活性中心的絲氨酸殘基發(fā)生共價反應(yīng)。Gu等[31]研究了基于磺酰氟化物的化學(xué)探針在植物和動物蛋白質(zhì)組上的標記，該探針可以標記絲氨酸蛋白酶活性中心絲氨酸以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶中的酪氨酸殘基。

賴氨酸殘基側(cè)鏈含有氨基具有親核性，且賴氨酸存在于許多功能位點如酶活性位點和介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的位點，因此賴氨酸是蛋白質(zhì)氨基酸中共價配體開發(fā)的潛在候選物。賴氨酸也經(jīng)常作為乙?；⒓谆?、泛素化等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的翻譯后調(diào)控位點。Shannon等[32]探索了一組通過親核芳香取代機制發(fā)揮作用的芳基鹵化物的蛋白質(zhì)反應(yīng)性，這些親電試劑的反應(yīng)活性可以通過改變芳基環(huán)上的取代基來微調(diào)，鄰氯硝基苯具有高度的半胱氨酸選擇性，而二氯三嗪有利于與賴氨酸的反應(yīng)。蛋白激酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著核心作用，所有的蛋白激酶的活性中心都含有1個保守的親核性賴氨酸位點，這類酶催化磷酸從三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）轉(zhuǎn)移并共價結(jié)合到特定蛋白質(zhì)分子中某些絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，從而改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性[33]。Patricelli等[34]合成了1個磷酸?；结槪撎结樋梢院偷鞍准っ傅腁TP結(jié)合位點進行選擇性共價反應(yīng)，從標記的蛋白質(zhì)組中捕獲生物素化肽片段，然后使用基于質(zhì)譜的分析平臺進行測序和鑒定。

除了上述針對半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸的特異性分子探針，對于其他活潑的氨基酸殘基也相繼開發(fā)出了一些探針。Hahm等[35]對磺酰氟化物探針進行改進，將離去基團氟改為三氮唑使該探針對酪氨酸的選擇性提高至其他親核氨基酸的5倍。Bach等[36]使用光活化的2,5-二取代四唑，以優(yōu)異的選擇性定量細菌蛋白質(zhì)組中8971個天冬氨酸和谷氨酸。Ma等[37]描述了一種新的反應(yīng)性探針3-苯基-2-氮丙啶，它能夠在體外和原位條件下高效地對蛋白質(zhì)中的羧基進行化學(xué)選擇性修飾，即可用于標記天冬氨酸和谷氨酸。Lin等[38]以氧氮環(huán)丙烷為反應(yīng)基團在一系列生物相容性的反應(yīng)條件下實現(xiàn)高度選擇性、快速和穩(wěn)定的蛋氨酸標記，從而識別整個蛋白質(zhì)組中高反應(yīng)活性的蛋氨酸殘基。

2 基于非標記法對活性成分靶點進行鑒定

非標記法是基于中藥活性成分和靶標蛋白結(jié)合后會影響靶標蛋白的熱穩(wěn)定性、氧化速率等生物物理性質(zhì)，進而識別中藥活性成分可能作用靶點。相較于標記法，非標記法不需要對活性成分進行結(jié)構(gòu)修飾。非標記法主要包括藥物親和反應(yīng)的靶點穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）分析、氧化速率蛋白穩(wěn)定性（stability of proteins from rates of oxidation，SPROX）分析、蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析（cellular thermal shift assay，CETSA）和熱蛋白組分析（thermal proteome profiling，TPP）。

2.1 DARTS

Lomenick于2009年首次提出DARTS技術(shù)，其主要利用藥物結(jié)合時靶標蛋白對蛋白酶降解的敏感性降低這一特性，不需要對藥物結(jié)構(gòu)進行修飾且不依賴藥物的活性，依賴于藥物分子和其蛋白質(zhì)靶點之間的親和性，因此能夠精確地找到藥物的直接結(jié)合靶點。Lomenick等[39]進一步驗證了DARTS技術(shù)的可行性，以免疫抑制藥物雷帕霉素和FK506的靶點FKBP12作為研究對象，枯草桿菌蛋白酶作為工具酶，觀察FKBP12與藥物結(jié)合后的抗水解作用，發(fā)現(xiàn)靶標蛋白和藥物結(jié)合后靶標蛋白的穩(wěn)定性增強。DARTS技術(shù)的大致流程是細胞裂解、蛋白定量、加入小分子藥物與裂解液共同孵育、蛋白酶水解，最后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、蛋白二維電泳（2D-PAGE）、膠染色技術(shù)、凝膠或非凝膠質(zhì)譜技術(shù)、親核色譜等多種方法對結(jié)合蛋白進行檢測或鑒定。

Kim等[40]采用DARTS技術(shù)驗證了姜黃素與APN的相互作用，鏈霉蛋白酶處理2 min后APN的穩(wěn)定性明顯降低，而姜黃素處理過的APN穩(wěn)定性保持不變；還發(fā)現(xiàn)老刺木精可以直接作用于血管內(nèi)皮生長因子受體2，從而抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞生長。Hwang等[41]報道了抗抑郁藥物舍曲林是自噬誘導(dǎo)劑，采用DARTS技術(shù)研究了電壓依賴性陰離子通道蛋白1（voltage-dependent anion channel 1，VDAC1）與舍曲林的直接相互作用，發(fā)現(xiàn)舍曲林處理后，VDAC1對鏈霉蛋白酶的穩(wěn)定性增加，且成劑量相關(guān)性；而ACTB與舍曲林無結(jié)合親和力，其蛋白水解敏感性無變化。表明舍曲林特異性地結(jié)合到VDAC1，通過結(jié)合并拮抗線粒體VDAC1，導(dǎo)致細胞ATP降低，激活A(yù)MPK并抑制其下游mTOR-RPS6KB1信號通路誘導(dǎo)細胞自噬。Huang等[42]通過DARTS、等溫滴定量熱法等技術(shù)發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛蘇林堿可以直接靶向熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）并破壞其與β-catenin的相互作用，從而增加泛素介導(dǎo)的β-catenin蛋白酶體降解。Huang等[43]以ES2和AtEXO70A1為例展示了如何通過DATRS技術(shù)來測試小分子與純化候選靶標蛋白的相互作用。木香烴內(nèi)酯是一種天然倍半萜內(nèi)酯，具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性。Liu等[44]利用scPDB蛋白結(jié)構(gòu)庫進行高通量反向虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2）是木香烴內(nèi)酯最特異的結(jié)合蛋白；進一步通過CETSA和DARTS技術(shù)證實了木香烴內(nèi)酯與CDK2可以結(jié)合，木香烴內(nèi)酯通過直接靶向CDK2，抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。但DARTS技術(shù)的限制因素為質(zhì)譜檢測的靈敏度，對于許多低豐度的靶標蛋白來說不易將目標蛋白可視化，此外進化選擇上有些蛋白很難被蛋白酶消化[39]。

2.2 SPROX

SPROX技術(shù)主要基于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)配體的熱力學(xué)穩(wěn)定性，即在化學(xué)變性劑（如鹽酸胍或尿素）濃度增加的情況下利用過氧化氫氧化蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸（氧化產(chǎn)物為甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜），用電噴霧或基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法測定特定氧化時間下甲硫氨酸的氧化程度與變性劑濃度的函數(shù)，未氧化產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物變性劑關(guān)系曲線的交點為遷移中點，由于蛋白質(zhì)和其配體結(jié)合后蛋白穩(wěn)定性提高，與對照組相比，在相同濃度的氧化產(chǎn)物下需要更多的變性劑，從而導(dǎo)致遷移中點右移[45]。SPROX優(yōu)點在于不需要純化蛋白，且可以與串聯(lián)質(zhì)譜標簽（tandem mass tags，TMT）、細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(shù)（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）相結(jié)合，通過標記蛋白質(zhì)氨基來確定肽的相對含量，以此擴大SPROX在全蛋白質(zhì)組上的覆蓋率[46-47]。

Geer Wallace等[48]將iTRAQ與SPROX技術(shù)聯(lián)用，對低氧培養(yǎng)條件下的人乳腺癌MDA-MB-231細胞裂解液進行了與manassantin A的相互作用分析，共鑒定出28個蛋白，為后期闡明manassantin A的作用機制奠定了基礎(chǔ)。格爾德霉素是一種天然產(chǎn)物，具有良好的抗癌活性。Hsp90是格爾德霉素已知的靶點，格爾德霉素可直接與Hsp90端ATP結(jié)合域結(jié)合，抑制Hsp90 ATP酶活性，文獻報道的解離常數(shù)（d）值從納摩爾到微摩爾差異較大，Xu等[49]利用SPROX技術(shù)測量格爾德霉素與人乳腺癌MCF-7細胞裂解液中未純化的Hsp90的結(jié)合親和力，證實d值取決于SPROX分析前格爾德霉素與裂解液平衡的時間。Liu等[50]利用SPROX技術(shù)分析了MCF-7細胞分別與BT-474細胞、MDA-MB-468細胞的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差別，證明熱力學(xué)穩(wěn)定性差異可以區(qū)分不同的乳腺癌亞型。SPROX技術(shù)的限制因素在于只能檢測含有甲硫氨酸的蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合，此外并不是所有的甲氨酸殘基都表現(xiàn)出不同的氧化速率，因此不能完全確證蛋白質(zhì)和配體相互作用[51]。

2.3 CETSA

Martinez Molina等[52]基于配體誘導(dǎo)的靶標蛋白熱穩(wěn)定性改變原理開發(fā)出CETSA技術(shù)，隨著溫度的升高，蛋白熱穩(wěn)定性降低，而小分子和靶標蛋白結(jié)合后會改變靶標蛋白的熱穩(wěn)定性。該方法的大致流程為將多個等量的細胞裂解液或者組織勻漿液與小分子孵育，然后加熱至不同溫度進行熱變性；冷卻后，將樣品離心，從沉淀蛋白中分離可溶性組分；通過Western blotting法對可溶性部分中的目標蛋白進行定量，或基于質(zhì)譜方法根據(jù)其熔解曲線分析可溶性蛋白的熱穩(wěn)定性，從而確證小分子與靶標蛋白的結(jié)合。傳統(tǒng)的熱位移分析技術(shù)只能使用純化的蛋白質(zhì)，而CETSA的樣本可以為細胞裂解液、完整細胞以及組織勻漿液等，極大地擴大了樣品檢測范圍，使檢測更方便快捷。

Nagasawa等[53]開發(fā)了一種將CETSA和基于2D-PAGE的蛋白質(zhì)組學(xué)分析相結(jié)合的改進方法即2DE-CETSA，通過2DE-CETSA分析了一種靶標未知的化合物NPD10084，該化合物對大腸癌細胞具有較好的體內(nèi)外抗增殖活性，并確定了丙酮酸激酶肌亞型2（pyruvate kinase M2，PKM2）作為候選靶標蛋白。NPD10084可以通過阻斷PKM2和β-catenin或STAT3間的蛋白-蛋白相互作用，進而抑制下游信號通路。BH3模擬物類抗腫瘤藥物是一類靶向B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）家族抗凋亡成員蛋白的新型抗腫瘤藥物，可以模仿唯BH3域蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2家族抗凋亡成員結(jié)合并使其釋放促凋亡因子。Guo等[54]使用CETSA技術(shù)評估了不同BH3模擬物（ABT-737、ABT-199、A-1210477）對Bcl-2和髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）的靶標結(jié)合能力，并驗證了該方法可以提供與體外結(jié)合實驗一致的親和力排序和選擇性。Ishii等[55]利用CETSA技術(shù)成功監(jiān)測了腦和脾臟樣本中受體相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）抑制劑與體內(nèi)RIPK1直接結(jié)合，證明CETSA可以作為動物和臨床研究的有力工具。-GlcNAc糖基化修飾參與基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控等多種細胞生命活動，并與II型糖尿病、老年神經(jīng)退行性疾病、癌癥等多種疾病密切相關(guān)；-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶能夠特異地催化蛋白質(zhì)發(fā)生-GlcNAc糖基化修飾。Drake等[56]用CETSA技術(shù)檢測了-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶對Nod2和Nod1細胞穩(wěn)定性的影響，該技術(shù)也將成為研究翻譯后修飾的有力工具。CETSA技術(shù)的限制因素在于：①較大的蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)復(fù)合物更可能產(chǎn)生較弱或沒有配體誘導(dǎo)反應(yīng)，在這方面的局限性仍需充分證實；②加熱會影響細胞膜的通透性，可以通過減少加熱時間、選擇合適的加熱方式、增加對照實驗來解決；③小分子的孵育時間會影響小分子識別靶標蛋白，如果此化合物參與快速響應(yīng)信號通路，可能會影響靶標蛋白翻譯后的狀態(tài)，進而影響抗體對靶標蛋白的檢測，可以使用基于質(zhì)譜方法來檢測靶標蛋白；④檢測需要的藥物濃度較高，在發(fā)現(xiàn)新靶點的過程中明顯通量不足，常被用作靶點的驗證[57]。

2.4 TPP

TPP將CETSA技術(shù)和基于多重定量質(zhì)譜相結(jié)合，可以監(jiān)測藥物作用過程中整個蛋白組蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的變化，增加了在靶點和脫靶識別以及生物識別上的應(yīng)用，實現(xiàn)對靶標蛋白的高通量檢測。其大致操作流程為將細胞或裂解液在有無化合物條件下處理，然后將樣本平均分成10份，在10個溫度下分別加熱，用PBS溶液提取可溶部分，再用胰蛋白酶處理樣本并用TMT10進行標記，最后混合所有樣本進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析，得到的報告離子強度用于擬合曲線并計算每個蛋白質(zhì)的特定熔解溫度（m），從而找到穩(wěn)定性差異蛋白[58]。除了化合物之外，核酸、蛋白間的相互作用或翻譯后修飾都會影響靶標蛋白熱穩(wěn)定性。這種方法不僅僅能夠檢測細胞或組織中的蛋白質(zhì)-配體相互作用，還可以檢測不同狀態(tài)下細胞蛋白質(zhì)組的熱穩(wěn)定性。該方法適用于體外、原位和體內(nèi)檢測，已成功應(yīng)用于藥物靶點和脫靶識別、蛋白質(zhì)代謝物和蛋白質(zhì)相互作用的研究。因此，TPP提供了一種獨特的視角，在蛋白質(zhì)組水平上了解蛋白質(zhì)的狀態(tài)和相互作用，從而為研究基本的生物過程及其潛在機制打下了堅實的基礎(chǔ)[59]。

天然產(chǎn)物vioprolide A～D對人急性淋巴母細胞白血病細胞表現(xiàn)出強大的毒性，Kirsch等[60]利用TPP技術(shù)發(fā)現(xiàn)了人外周血白血病T細胞Jurkat中vioprolide A的靶標蛋白核仁蛋白14（nucleolar protein 14，NOP14），該蛋白在核糖體生物發(fā)生中起重要作用；并通過一系列蛋白質(zhì)組學(xué)和生物學(xué)實驗進一步證實了NOP14是vioprolide A的特異性靶標。Lu等[61]發(fā)現(xiàn)氯馬斯汀可與惡性瘧原蟲TCP-1環(huán)復(fù)合物或含有TCP-1的伴侶蛋白（TRiC/CCT）結(jié)合，通過TPP技術(shù)發(fā)現(xiàn)氯馬斯汀使8個惡性瘧原蟲TRiC亞基不穩(wěn)定；利用SPROX技術(shù)進一步證明氯馬斯汀會改變瘧原蟲TRiC δ亞基的熱力學(xué)穩(wěn)定性。Conophylline是從山茱萸中提取的一種長春花生物堿，Kakegawa等[62]通過TPP技術(shù)鑒定出谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）是conophylline的結(jié)合蛋白，conophylline通過靶向GPX4誘導(dǎo)脂質(zhì)活性氧積累和自噬。Reinhard等[63]擴展了TPP使用方法實現(xiàn)對人類細胞中跨膜蛋白小分子相互作用的檢測，將人慢性骨髓性白血病細胞K562加熱至70 ℃，然后用SDS、NP-40、CHAPS、CHAPSO、DDM、β-辛基葡萄糖苷、Brij 35或Pluronic F127進行提取，并通過PAGE分析，結(jié)果表明0.4% NP-40足以溶解許多膜蛋白，且在親和蛋白組學(xué)研究中不影響蛋白-藥物親和性的準確測定。

3 總結(jié)與展望

基于現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)闡明中藥藥效機制及其作用靶點，是貫徹“傳承精華，守正創(chuàng)新”的關(guān)鍵，也是實現(xiàn)我國原始藥物創(chuàng)新的重要途徑。因此，尋找中藥活性成分直接作用靶點是醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的學(xué)者共同關(guān)心的主題，但鑒于技術(shù)瓶頸，相關(guān)研究推進困難?；瘜W(xué)生物學(xué)等技術(shù)的興起為中藥活性成分直接作用靶點鑒定提供了方法。蛋白質(zhì)作為生物功能直接的執(zhí)行者，更是成為學(xué)者們關(guān)注的重要藥物靶點。因此，本文系統(tǒng)綜述了基于化學(xué)生物學(xué)技術(shù)尤其是化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的中藥活性成分直接作用靶點鑒定方法，以期為研究者提供借鑒。

具體來說，根據(jù)是否使用探針標記，廣泛應(yīng)用于中藥活性成分以及天然產(chǎn)物的作用靶點鑒定方法可以被分為標記法及非標記法2大類。標記法的應(yīng)用門檻較高，不適用于改造后活性喪失、化學(xué)合成困難以及微量的活性成分研究。應(yīng)用活性氨基酸殘基探針進行研究時，只能針對與氨基酸殘基具有共價結(jié)合能力的活性成分，同時結(jié)合工具探針使用。但標記法也具備明顯的優(yōu)勢，可以直接標記直接靶標蛋白，并通過后續(xù)蛋白變性的方法排除間接靶標蛋白，大大降低了靶點鑒定過程中的假陽性結(jié)果。非標記法的結(jié)果可信度不如標記法，同時很難排除藥物結(jié)合蛋白所在復(fù)合體中其他蛋白的影響。但非標記法可以對任意活性成分（包括微量活性成分）甚至多成分進行靶點鑒定。因此，將標記法與非標記法的主流技術(shù)原理整合在圖1，學(xué)者們在選擇靶點鑒定方法時，可以根據(jù)其優(yōu)缺點自主選擇。

圖1 中藥活性成分直接作用靶點鑒定的研究方法以及流程圖

雖然中藥活性成分靶點鑒定對于新藥研發(fā)以及闡明中藥藥效機制至關(guān)重要，但是更應(yīng)該在所鑒定的靶點中尋找與藥物表型關(guān)聯(lián)最大的靶點，并通過后續(xù)應(yīng)用生物物理學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)對所鑒定的靶點進行驗證。在明確了活性成分的靶點以及藥效機制后，再通過對活性成分進行結(jié)構(gòu)修飾改善先導(dǎo)化合物的理化性質(zhì)、藥效學(xué)性質(zhì)、藥動學(xué)性質(zhì)以及安全性等，從而得到成藥性更高的先導(dǎo)化合物，可以極大地縮短新藥研發(fā)進程。

在用標記法鑒定中藥活性成分靶點時除了上述提到的還包括噬菌體展示等技術(shù)，此外Epoxy- activated Sepharose 6B beads、AffiGel、Toyopearl、AQUAFIRMUS、SG beads等親和基質(zhì)也可以用于某些化合物靶標蛋白的鑒定[64]。非標記法還包括降解標簽、RNA干擾、CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)、Connectivity Map等基于基因組學(xué)以及生物信息學(xué)分析的方法[65]，通過多種方法結(jié)合實現(xiàn)化合物靶點鑒定。

綜上所述，現(xiàn)階段學(xué)者們已經(jīng)應(yīng)用標記法及非標記法對中藥活性成分和天然產(chǎn)物靶點鑒定進行了一定的研究。但是任何靶點的鑒定都需要進一步的活性相關(guān)性研究，從而確定所鑒定靶點對其藥效的關(guān)鍵性。隨著科技的發(fā)展，未來會建立越來越多用于鑒定化合物靶點的方法，這些方法將共同推進對中藥以及其活性成分的研究，推動原始創(chuàng)新藥物研究以及中醫(yī)藥研究的科學(xué)化進程。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research method and application for identifying direct target of bioactive components from traditional Chinese medicine

WEI Jun-nan, DAI Jian-ye

College of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Chinese herbal medicine has been paid more and more attention because of its exact clinical efficacy. With the in-depth study of the bioactive components of Chinese herbal medicine, many potential innovative drugs with unique activity and efficacy have been discovered. However, how to further explore the pharmacodynamic mechanism and discover new mechanisms and targets has become the key to the original innovative research of Chinese herbal medicine. The target identification of bioactive components in Chinese herbal medicine has always been an important topic that researchers have been exploring. With the development of chemical biology technology, especially chemical proteomics technology, more and more methods have been established for the identification of bioactive components in Chinese herbal medicine. These methods mainly include labeling and non-labeling methods. The labeling method is to transform the bioactive components into active probes, and then explores their target proteins, while the non-labeling method is mainly based on the biophysical properties such as the thermal stability of target proteins which will be affected by the combination of bioactive components of Chinese herbal medicine and target proteins, so as to identify possible targets. In this paper, these two kinds of target identification methods are summarized and elaborated from the aspects of principle, general operation process, application, advantages and disadvantages, etc., which provide a certain reference for the target identification of bioactive components, and expect to help the original innovative research of Chinese herbal medicine.

active components of Chinese herbal medicine; target identification; labeling method; label-free method; active probes

R285.52

A

0253 - 2670(2021)17 - 5378 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.030

2021-08-06

國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC17063005）；甘肅省科技計劃重點項目（20JR10RA586）；中央高?；緲I(yè)務(wù)項目（lzujbky-2021- kb40）；隴原青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才項目

魏君楠（1996—），女，碩士研究生，研究方向為化學(xué)生物學(xué)。E-mail: weijn19@lzu.edu.cn

戴建業(yè)，沈陽藥科大學(xué)72期藥物制劑專業(yè)校友，隴原青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為藥效評價以及分子機制研究。E-mail: daijy@lzu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]