長(zhǎng)鏈非編碼RNA-LA16c-313D11.11與突變型p53在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與臨床意義

丁 雪 辛衛(wèi)娟 華克勤

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma ,EC)是發(fā)生在子宮內(nèi)膜的一類(lèi)上皮性惡性腫瘤,是女性生殖系統(tǒng)3大惡性腫瘤之一,分為Ⅰ型(雌激素依賴(lài)型)和Ⅱ型(非雌激素依賴(lài)型)[1]。研究[2-3]結(jié)果表明，EC的發(fā)生、發(fā)展不僅與雌、孕激素水平相關(guān)，還涉及多種分子通路機(jī)制。Salmena等[4]提出的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源核糖核酸(competing endogenous RNA，ceRNA)假說(shuō)認(rèn)為，多種核糖核酸(RNA)可通過(guò)共享一個(gè)或多個(gè)同源性的微核糖核酸反應(yīng)元件(microRNA response element, MRE)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微核糖核酸(microRNA，miRNA)，從而實(shí)現(xiàn)相互調(diào)控。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被證實(shí)可作為ceRNA參與調(diào)控多種癌癥基因[5-7]。miRNA205既可靶向細(xì)胞凋亡通路，抑制細(xì)胞自噬[8]，又可調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲[9]，其高表達(dá)常與疾病預(yù)后不佳相關(guān)[10-11]。抑癌基因p53是miRNA205的直接靶點(diǎn)，miRNA205與p53結(jié)合后，可抑制該基因的作用，從而抑制癌細(xì)胞凋亡[12]。本課題組的前期研究[13]已成功鑒定出新的lncRNA，將其命名為lncRNA-LA16c-313D11.11。該lncRNA可作為ceRNA通過(guò)MRE與miRNA205結(jié)合，降低EC組織中miRNA205水平，維持細(xì)胞的生物學(xué)特性。因此，探索lncRNA-LA16c-313D11.11和p53與EC之間的聯(lián)系，有助于為臨床診治EC夯實(shí)理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院2013年9月—2016年9月收治的54例子宮內(nèi)膜癌患者的臨床資料?；颊吣挲g范圍為26～76歲，年齡為(56.00±10.66)歲。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics, FIGO)2014年制訂的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行分期。根據(jù)分化程度、異型性和核分裂象確定子宮內(nèi)膜樣腺癌惡性程度的級(jí)別：G1為分化良好，屬低度惡性；G2為中等分化，屬中度惡性；G3為低分化，屬高度惡性。納入標(biāo)準(zhǔn)：為首次接受手術(shù)治療的EC患者；患者手術(shù)前未接受放射治療(簡(jiǎn)稱(chēng)放療)或化學(xué)治療(簡(jiǎn)稱(chēng)化療)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤，相關(guān)臨床資料缺失。研究對(duì)象的臨床資料均來(lái)源于醫(yī)院組織庫(kù)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(審批號(hào):kyy2015-24)，所有患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2p53陽(yáng)性檢測(cè)與判定方法 鼠抗人單克隆p53抗體(批號(hào)為Do-7，M7001) 與免疫組織化學(xué)試劑盒(LSAB試劑盒)均購(gòu)自丹麥DAKO公司。經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋的EC組織標(biāo)本經(jīng)微波處理修復(fù)抗原后，應(yīng)用濃度為1∶100p53抗體進(jìn)行染色；突變型p53陽(yáng)性組織細(xì)胞核為棕黃色著色。應(yīng)用高倍熒光顯微鏡對(duì)染色的組織切片進(jìn)行觀察，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算其中的陽(yáng)性細(xì)胞比例，≤10%為p53陰性，>10%為p53陽(yáng)性。將切片編號(hào)后由兩位病理科醫(yī)師隨機(jī)閱片、獨(dú)立判讀，意見(jiàn)不一致時(shí)，進(jìn)行重新評(píng)判，以達(dá)成最終統(tǒng)一。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 應(yīng)用TRIzol試劑 (美國(guó)賽默飛生物科技有限公司) 提取患者EC組織總RNA。采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性。應(yīng)用Promega A3500反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (美國(guó)普洛麥格生物技術(shù)有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq試劑盒 (大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)lncRNA-LA16c-313D11.11水平。以GAPDH作為內(nèi)源性對(duì)照。lncRNA-LA16c-313D11.11的正向序列為5’-TGA AGG AGG TTA TTG ACG CA-3’，反向序列為5’-GAG GGG AAA CAG TCC AGA GT-3’。GAPDH的正向序列為5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG -3’,GAPDH的反向序列為5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3’。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)羅氏公司)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。通過(guò)比較循環(huán)閾值 (CT值) 分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以lncRNA-LA16c-313D11.11相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)(1.168)為標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分低表達(dá)組(≤1.168)與高表達(dá)組(>1.168)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(n)和百分率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料特征 納入的患者中，年齡<55歲21例(38.89%)，≥55歲33例(61.11%)；未絕經(jīng)14例(25.93%)，已絕經(jīng)40例(74.07%)；FIGO分期Ⅰ期36例(66.67%)，Ⅱ期7例(12.96%)，Ⅲ或Ⅳ期11例(20.37%)；子宮肌層浸潤(rùn)深度≥1/2 16例(29.63%)，子宮肌層浸潤(rùn)深度<1/2 38例(70.37%)；有脈管浸潤(rùn)12例(22.22%)，無(wú)脈管浸潤(rùn)42例(77.78%)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例(20.37%)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例(79.63%)；子宮內(nèi)膜樣腺癌41例 (75.93%)；子宮內(nèi)膜漿液性腺癌9例 (16.67%)，透明細(xì)胞癌4例(7.40%)。子宮內(nèi)膜樣腺癌惡性病理學(xué)程度分級(jí)G1的患者為26例(63.42%)，G2為8例(19.51%)，G3為7例(17.07%)。

2.2 lncRNA-LA16c-313D11.11的表達(dá)與臨床和病理學(xué)特征關(guān)系 lncRNA-LA16c-313D11.11高表達(dá)組和低表達(dá)組在各FIGO分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中占比的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；而在不同年齡、絕經(jīng)情況、組織病理學(xué)分型、子宮肌層浸潤(rùn)深度，以及有無(wú)脈管浸潤(rùn)的患者中占比的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 突變型p53的表達(dá)與臨床和病理學(xué)特征關(guān)系 突變型p53陽(yáng)性患者在子宮內(nèi)膜樣腺癌、漿液性腺癌和透明細(xì)胞癌患者及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中占比的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；在不同年齡、絕經(jīng)情況、FIGO分期、子宮肌層浸潤(rùn)深度及有無(wú)脈管浸潤(rùn)的患者中占比的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 lncRNA-LA16c-313D11.11和突變型p53的表達(dá)情況與臨床和病理學(xué)特征的關(guān)系

2.4 lncRNA-LA16c-313D11.11與突變型p53表達(dá)的關(guān)系 lncRNA-LA16c-313D11.11高表達(dá)組突變型p53陽(yáng)性患者的占比為6/17，低表達(dá)組突變型p53陽(yáng)性患者的占比為11/17，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

EC是發(fā)生在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的一組惡性腫瘤，其發(fā)病率隨著人們生活和飲食習(xí)慣的改變而有所變化。在我國(guó)，EC是僅次于宮頸癌的第2高發(fā)婦科惡性腫瘤[14]，其確切的疾病機(jī)制尚不清楚。EC Ⅰ 型的發(fā)生與長(zhǎng)期無(wú)孕激素拮抗的雌激素刺激相關(guān)，可見(jiàn)于無(wú)排卵性疾病、絕經(jīng)后單雌激素替代治療等，常見(jiàn)病理學(xué)類(lèi)型為低分化的內(nèi)膜樣腺癌、黏液樣腺癌，腫瘤分化良好、惡性程度低，預(yù)后好。Ⅱ型的發(fā)生與雌激素水平無(wú)明確關(guān)系，被認(rèn)為與p53等基因突變相關(guān)，通常腫瘤分化程度低、惡性程度高，預(yù)后差，多數(shù)患者以陰道異常出血、排液為主要臨床表現(xiàn)。目前臨床上采用手術(shù)病理學(xué)分期，并遵循FIGO 2014年的分期標(biāo)準(zhǔn)。由于EC臨床表現(xiàn)明顯，患者多可早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)診治。分段診斷性刮宮是最為經(jīng)濟(jì)且有價(jià)值的診斷方法[15]，可有效清除病灶，輔以放療、化療和藥物治療后患者總體預(yù)后較好。早期EC的5年總生存率高達(dá)98%[16],但部分患者確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或初治后復(fù)發(fā)，故尋找EC的新型標(biāo)志物將有助于提高對(duì)其診治水平。

p53是一種位于人類(lèi)染色體17q13.1上且被廣泛研究的抑癌基因，分為野生型和突變型。野生型p53具有抑制細(xì)胞周期、促進(jìn)凋亡、維持遺傳穩(wěn)定性和抑制血管形成等功能，發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)；突變型p53無(wú)上述功能，反而會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、惡化，其表達(dá)水平與EC惡性侵襲程度密切相關(guān)。正常組織p53的免疫組織化學(xué)染色通常為陰性，但由于突變型p53蛋白質(zhì)的半衰期長(zhǎng)、表達(dá)量高，故檢測(cè)結(jié)果常為陽(yáng)性[17-18]。本研究結(jié)果顯示，突變型p53陽(yáng)性患者在子宮內(nèi)膜樣腺癌、漿液性腺癌和透明細(xì)胞癌患者中的占比分別為19.51%、7/9和2/4，在無(wú)和有淋巴轉(zhuǎn)移的患者中的占比分別為23.26%、63.64%；當(dāng)突變型p53陽(yáng)性患者比例的升高，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC患者的比例也隨之升高；這與上述突變型p53引起EC患者不良結(jié)局的觀點(diǎn)一致。此外，在EC分子分型的研究中發(fā)現(xiàn)，拷貝數(shù)高的EC發(fā)生p53、PIK3CA和PPP2R1A等基因突變的頻率較高。癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，拷貝數(shù)高的EC形態(tài)包括漿液性腺癌(97.7%)、高級(jí)別子宮內(nèi)膜樣腺癌(19.6%)、低級(jí)別子宮內(nèi)膜樣腺癌(5.0%)和混合型EC(75.0%)等，患者多預(yù)后不良[19]。2017年，Hoang等[20]采用ProMisE模型分析了400例EC的分子亞型，其中包括黏液性癌、漿液性癌、透明細(xì)胞癌、去分化癌和癌肉瘤等，結(jié)果顯示，漿液性EC中p53突變率高達(dá)96%，該類(lèi)型預(yù)后較差，這與TCGA的分子分型結(jié)果基本一致。由此可見(jiàn),EC分子分型診斷在指導(dǎo)個(gè)體化精準(zhǔn)治療方面有重要的價(jià)值。

lncRNA最初以印記H19基因進(jìn)入研究人員的視野。其為長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸且不直接參與蛋白質(zhì)編碼的內(nèi)源性RNA，但后續(xù)研究顯示其具有強(qiáng)大的分子編碼功能，如參與印記基因調(diào)控、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄干擾等。相比miRNA，lncRNA的數(shù)量和種類(lèi)所占比例更高，lncRNA已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[21]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，lncRNA參與了多種惡性腫瘤的基因調(diào)控。例如，lncRNA DQ786243的高表達(dá)表明結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)[22]，lncRNA ATB過(guò)表達(dá)可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,可作為人前列腺癌不良預(yù)后的重要標(biāo)志物[23]，Linc00974可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移等[24]。本課題組前期研究[25]結(jié)果顯示，lncRNA-LA16c-313D11.11可作為ceRNA結(jié)合并抑制miRNA-205。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA-LA16c-313D11.11高表達(dá)的Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ或Ⅳ期EC患者占比分別為66.67%、4/7和3/11；低表達(dá)的Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期的患者占比分別為33.33%、3/7和8/11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但子宮內(nèi)膜癌lncRNA-LA16c-313D11.11表達(dá)情況與患者年齡、是否絕經(jīng)、組織病理學(xué)分型、子宮肌層浸潤(rùn)程度、有無(wú)脈管浸潤(rùn)無(wú)顯著相關(guān)性。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的lncRNA-LA16c-313D11.11高表達(dá)和低表達(dá)占比分別為65.12%和34.88%；而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的lncRNA-LA16c-313D11.11高表達(dá)和低表達(dá)占比分別為3/11和8/11，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 因此推測(cè)，lncRNA-LA16c-313D11.11高表達(dá)與患者子宮內(nèi)膜癌分期早和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

miRNA-205可通過(guò)靶向p53抑制其功能阻止癌細(xì)胞凋亡，而lncRNA-LA16c-313D11.11可與miRNA-205結(jié)合抑制其作用，推測(cè)lncRNA-LA16c-313D11.11可能通過(guò)抑制miRNA-205表達(dá)影響p53的功能。本研究亦證實(shí)，lncRNA-LA16c-313D11.11與突變型p53表達(dá)相關(guān)，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究與闡明。

綜上所述，lncRNA-LA16c-313D11.11的高表達(dá)與EC分期早、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且lncRNA-LA16c-313d11.11可能通過(guò)p53在EC的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。