宮頸癌DExH-box解旋酶9抑制轉(zhuǎn)錄本來(lái)源的長(zhǎng)鏈非編碼RNA在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中的作用及其機(jī)制

馬 健 楊維維 李 帥 袁敏杰 魏 盟

全球范圍內(nèi),受糖尿病影響的成年人數(shù)量迅速增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)到近4億[1]?，F(xiàn)已證實(shí)，高血糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是糖尿病心肌病變的重要原因和始動(dòng)因素[2]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷在糖尿病心肌病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[3-5]。高血糖能夠加重葡萄糖氧化和增加線粒體ROS的生成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞DNA的損傷，加速細(xì)胞凋亡。

長(zhǎng)鏈非編碼(lnc)RNA是一類轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸且不具編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子，廣泛分布于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。lncRNA廣泛參與腫瘤、心血管疾病、腎臟病在內(nèi)的多種復(fù)雜性疾病的發(fā)生與發(fā)展。宮頸癌DExH-box解旋酶9(DHX9)抑制性轉(zhuǎn)錄物(cervical cancer DExH-box helicase 9 suppressive transcript，CCDST)來(lái)源的lncRNA(lnc-CCDST)在宮頸癌組織中顯著下調(diào),lnc-CCDST負(fù)調(diào)控宮頸癌的細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成，其在許多組織中均有表達(dá)，參與機(jī)體的正常發(fā)育、生理活動(dòng)，以及多種疾病的發(fā)病過(guò)程[6-8]。lnc-CCDST參與心血管的細(xì)胞代謝過(guò)程[9]，而lnc-CCDST與糖尿病心肌病變的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究利用糖尿病小鼠模型和高糖誘導(dǎo)新生小鼠心肌細(xì)胞(neonatal mouse cardiomyocyte，NMC)模型探討lnc-CCDST對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡的影響。

微RNA(microRNA，miRNA)的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，通過(guò)與3’-非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)、5’-UTR和(或)靶信使RNA(mRNA)編碼區(qū)的互補(bǔ)位點(diǎn)堿基配對(duì)，在調(diào)控靶基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。根據(jù)最近提出的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA假說(shuō)，多個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄物可以通過(guò)其miRNA結(jié)合位點(diǎn)充當(dāng)miRNA的內(nèi)源性誘餌，調(diào)節(jié)彼此的生物活性?；诖?提出了lnc-CCDST是否也能以類似于蛋白質(zhì)編碼基因的方式與miRNA相互作用的問(wèn)題。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-339-5p(miR-339-5p)可能負(fù)向調(diào)節(jié)lnc-CCDST的表達(dá)。因此，本研究進(jìn)一步探討lnc-CCDST受miR-339-5p負(fù)向調(diào)節(jié)的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 取4～6周齡SPF級(jí)雄性Balb/C小鼠40只(體重為20～22 g)和出生1～2 d新生小鼠60只，均由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司； 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和抗生素購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；45%葡萄糖液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；小干擾RNA(siRNA)siCCDST-1、siCCDST-2和陰性對(duì)照scramble siRNA(si-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司(GenePharma)；miR-339-5p mimic和陰性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 將40只雄性小鼠以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，取其中20只小鼠建立糖尿病小鼠模型(模型組)。方法為麻醉后腹腔內(nèi)注射1%STZ 50 mg/(kg·d)，連續(xù)5 d，最后一次注射STZ 72 h后測(cè)血糖，如血糖>15.0 mmol/L則確診為1型糖尿病。另20只小鼠用檸檬酸鹽緩沖液處理后作為對(duì)照組(血糖<12.0 mmol/L)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)兩組小鼠心肌細(xì)胞的lnc-CCDST表達(dá)。

1.2.2 NMC細(xì)胞培養(yǎng) 60只新生小鼠制備NMC，制備方法：取新生小鼠心臟用膠原酶和蛋白酶消化10 min，小心分離收集心肌細(xì)胞，使用含5% FBS的最低基本培養(yǎng)基(MEM)于37 ℃、二氧化碳(CO2)體積分?jǐn)?shù)為0.05條件下培養(yǎng)。NMC細(xì)胞分組處理如下：細(xì)胞接種于六孔板，正常糖組培養(yǎng)基為正常葡萄糖濃度的DMEM；高糖組培養(yǎng)基含35 mmol/L的D-葡萄糖。干預(yù)時(shí)間為24 h。每組至少重復(fù)3次。采用qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的lnc-CCDST表達(dá)。

1.2.3 使用siRNA抑制lnc-CCDST表達(dá) 將設(shè)計(jì)好的siCCDST-1(5’-CTT GTG AAG TCT ATG AAT ATT-3’)、siCCDST-2(5’-AGC ACA ACC TTG GAG AAT AAA-3’)，以及si-NC通過(guò)TransMessenger轉(zhuǎn)染試劑盒(Qiagen)轉(zhuǎn)染NMC。轉(zhuǎn)染24 h后，采用qRT-PCR檢測(cè)NMC的lnc-CCDST表達(dá)。后續(xù)選擇si-NC和抑制效率高的siRNA抑制NMC lnc-CCDST表達(dá)，分別在正常糖和高糖條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量、胱天蛋白酶-3(caspase-3)活性，以及DNA片段(DNA fragmentation)。ROS熒光探針(DCF-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，通過(guò)熒光顯微鏡記錄DCF-DA信號(hào)(Invitrogen)；使用熒光測(cè)定試劑盒(Biomol Research Laboratories)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性；使用DNA fragmentation ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞DNA fragmentation (瑞士羅氏公司)，各檢測(cè)結(jié)果以其與正常糖培養(yǎng)條件下si-NC組的比值表示，每組至少重復(fù)3 次。

1.2.4 驗(yàn)證lnc-CCDST的調(diào)控因子 經(jīng)miRcode軟件預(yù)測(cè)miR-339-5p，miRNA-4637(miR-4637)和miRNA579-3p(miR-579-3p)可能是調(diào)控lnc-CCDST表達(dá)的miRNA。采用Trans Messenger試劑盒將合成的miR-339-5p、mimic、miR-4637 mimic及miR-579-3p mimic轉(zhuǎn)染NMC,過(guò)表達(dá)細(xì)胞miR-339-5p、miR-4637和miR-579-3p，使用錯(cuò)義寡核苷酸(scrambled oligonucleotide)作為對(duì)照；選擇對(duì)lnc-CCDST有明顯抑制作用的miRNA，合成其化學(xué)修飾的反義寡核苷酸(antagomir，GenePharm)抑制該miRNA表達(dá)，仍使用scrambled oligonucleotide作為對(duì)照。利用TransMessenger轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用qRT-PCR檢測(cè)各組lnc-CCDST的表達(dá)。每組至少重復(fù)3 次。

1.2.5 高糖刺激下過(guò)表達(dá)miR-339-5p對(duì)NMC的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的影響 利用miR-339-5p mimic和scrambled oligonucleotide轉(zhuǎn)染NMC，再分別予正常糖和高糖刺激并檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量、caspase-3活性，以及DNA fragmentation，結(jié)果以其與相應(yīng)對(duì)照組的比值表示，每組至少重復(fù)3 次。

1.2.6 調(diào)節(jié)lnc-CCDST表達(dá)，分析miR-339-5p對(duì)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用 將lnc-CCDST基因克隆至表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，在高糖誘導(dǎo)處理的NMC中過(guò)表達(dá)lnc-CCDST。所有質(zhì)粒均經(jīng)測(cè)序證實(shí)，利用脂質(zhì)體3000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。設(shè)立對(duì)照組、miR-339-5p過(guò)表達(dá)組、lnc-CCDST過(guò)表達(dá)組，以及miR-339-5p+lnc-CCDST共過(guò)表達(dá)組，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性和DNA fragmentation，結(jié)果以其與相應(yīng)對(duì)照組的比值表示，每組至少重復(fù)3 次。

2 結(jié) 果

2.1 高糖對(duì)lnc-CCDST表達(dá)的影響 與正常小鼠比較，糖尿病模型小鼠心肌組織中l(wèi)nc-CCDST表達(dá)顯著增加(1.14±0.67 比 5.22±3.48,P<0.01)。與正常糖組比較，高糖組NMC中l(wèi)nc-CCDST表達(dá)顯著增加(1.00±0.00比2.54±0.72，P<0.01)。

2.2 抑制lnc-CCDST表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的NMC氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC比較，siCCDST-1、siCCDST-2均可顯著抑制NMC中l(wèi)nc-CCDST表達(dá)(1.00±0.00比0.41±0.11、0.49±0.08，P值均<0.05)，siCCDST-1抑制效果更為顯著，故以下實(shí)驗(yàn)使用siCCDST-1進(jìn)行。與正常糖組相比，高糖組NMC內(nèi)ROS含量和DNA fragmentation均顯著增加、caspase-3活性上升(P值均<0.05)，提示氧化應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡顯著增多。而抑制lnc-CCDST能夠減少高糖誘導(dǎo)的NMC內(nèi)ROS含量、降低caspase-3活性、抑制DNA fragmentation的增加(P值均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 抑制lnc-CCDST表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的NMC氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的影響

2.3 miR-339-5p負(fù)向調(diào)節(jié)lnc-CCDST表達(dá) 應(yīng)用DIANA-LncBase 和 miRcode軟件分析證實(shí)，miR-339-5p存在與lnc-CCDST的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。分別于NMC中過(guò)表達(dá)miR-339-5p、miR-4637和miR-579-3p，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-339-5p抑制lnc-CCDST最為顯著，miR-339-5p組細(xì)胞lnc-CCDST的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(0.45±0.09比1.00±0.00，P<0.05)；miR-4637和miR-579-3p組細(xì)胞lnc-CCDST的表達(dá)分別為0.68±0.32、0.93±0.27，與對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用antagomir抑制miR-339-5p表達(dá)，lnc-CCDST的表達(dá)(1.83±0.43)隨之增加，與對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 miR-339-5p與lnc-CCDST的結(jié)合位點(diǎn)

2.4 miR-339-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)引起的NMC氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡的影響 過(guò)表達(dá)miR-339-5p能夠減少高糖誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量、降低caspase-3活性、抑制DNA fragmentation的增加(P值均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miR-339-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)引起的NMC氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡的影響

2.5 過(guò)表達(dá)lnc-CCDST抵消miR-339-5p對(duì)NMC氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用 過(guò)表達(dá)miR-339-5p后，高糖誘導(dǎo)的NMC中caspase-3活性顯著降低，DNA fragmentation顯著減少(P值均<0.05)；在此基礎(chǔ)上同時(shí)過(guò)表達(dá)lnc-CCDST可使miR-339-5p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的caspase-3活性顯著升高，DNA fragmentation顯著增加(P值均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 過(guò)表達(dá)lnc-CCDST抵消miR-339-5p對(duì)NMC氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

3 討 論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，各種lncRNA通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其生理、病理功能[10]。同時(shí)，miRNA又可進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶蛋白和lncRNA的表達(dá)。lncRNA與mRNA有許多共同特征：均具有復(fù)雜的剪接模式，通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄。lncRNA可能以類似于蛋白質(zhì)編碼基因的方式被調(diào)節(jié)[11-12]。近年來(lái)，關(guān)于lncRNA在糖尿病及其并發(fā)癥中的作用研究引起了廣泛關(guān)注[13]，而lncRNA調(diào)節(jié)糖尿病心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究較為缺乏，故研究lnc-CCDST在糖尿病心肌組織中的表達(dá)，以及探討其與糖尿病心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的關(guān)系，將是預(yù)防和治療糖尿病心肌重構(gòu)和心功能障礙的新的研究方向。

本研究結(jié)果顯示，無(wú)論離體或在體試驗(yàn)，高糖干預(yù)后心肌細(xì)胞中l(wèi)nc-CCDST表達(dá)均顯著增加，提示lnc-CCDST變化可能參與糖尿病心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過(guò)程。近年研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成是糖尿病心肌損傷的重要機(jī)制，本研究同樣發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)ROS生成和細(xì)胞凋亡明顯增加;而靶向性抑制lnc-CCDST后,心肌細(xì)胞中ROS生成、細(xì)胞凋亡得到顯著逆轉(zhuǎn)，證實(shí) lnc-CCDST可能通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成、細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與糖尿病心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的過(guò)程。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明，miR-339-5p與lnc-CCDST之間具有明確的作用位點(diǎn)，且miR-339-5p負(fù)向調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中的lnc-CCDST表達(dá)；高糖環(huán)境下過(guò)表達(dá)miR-339-5p能夠靶向性抑制lnc-CCDST表達(dá),進(jìn)而減少心肌細(xì)胞內(nèi)的ROS生成及細(xì)胞凋亡，最終發(fā)揮抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用，而這一保護(hù)作用在過(guò)表達(dá)lnc-CCDST后被明顯抵消。

新近研究明確提示,ROS生成在心肌重構(gòu)過(guò)程中具有重要作用，抑制心肌細(xì)胞線粒體ROS生成可以顯著逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)。與其他課題組研究結(jié)論一致，本團(tuán)隊(duì)的前期研究[16]結(jié)果亦證實(shí),給予靶向性抗氧化劑mito-TEMPO可以有效減少心肌細(xì)胞ROS生成并改善糖尿病心肌重構(gòu)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)上調(diào)F0F1-ATP合酶表達(dá)及其活性能夠減少心肌細(xì)胞線粒體ROS生成，并最終改善糖尿病小鼠心肌損傷[17]。而miR-339-5p/lnc-CCDST通路是否直接調(diào)節(jié)ATP合酶表達(dá)，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞ROS生成尚不明確，因此也為下一步的研究提供了前提和方向。

本研究證實(shí)，miR-339-5p/lnc-CCDST通路參與了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡的過(guò)程，其機(jī)制與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞ROS生成、caspase-3活性及DNA損傷有關(guān)，提示miR-339-5p/lnc-CCDST通路能夠影響糖尿病心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及心肌重構(gòu)。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步探索糖尿病心肌病及心臟功能障礙的防治提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)，從心肌細(xì)胞代謝角度為糖尿病心肌病變的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和方向。