Box-Behnken設(shè)計優(yōu)選加味結(jié)石湯的提取工藝△

胡靜，汪毓文，徐林忠，夏志持

麻城市人民醫(yī)院 藥劑科，湖北 麻城 438300

加味結(jié)石湯是麻城市人民醫(yī)院傳統(tǒng)協(xié)定處方，由金錢草、連錢草、山楂、雞內(nèi)金、車前子、滑石等12 味中藥組成，具有清熱利濕、通淋消石的功效，臨床用于濕熱引起的肝膽結(jié)石、黃疸、尿路結(jié)石、石淋、熱淋、小便澀痛等[1-3]。鑒于傳統(tǒng)湯劑臨床服用攜帶不便、質(zhì)量不可控等缺點，為了保證臨床效果，故擬將該方開發(fā)研制成加味結(jié)石顆粒劑。本實驗以總黃酮提取率和干浸膏得率為評價指標[6]，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對該顆粒劑的提取工藝進行優(yōu)選，以期為臨床院內(nèi)制劑的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

53-WB 型紫外-可見分光光度計（上海光學(xué)儀器廠）；WGL-230B 型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；QUINTIX125D-1CN 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HH-6型恒溫水浴鍋（江蘇中大儀器科技有限公司）。

1.2 試藥

金錢草（批號：191001-X）、連錢草（批號：190501-X）、山楂（批號：20190801）、雞內(nèi)金（批號：20191001）、車前子（批號：20191001）等購于亳州市善安堂中藥飲片有限公司，經(jīng)麻城市人民醫(yī)院藥劑科主任中藥師徐林忠鑒定為正品；對照品蘆?。兌龋?8%，批號：190705，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司）；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對照品12.61 mg，置25 mL量瓶中，加70%乙醇約20 mL，密塞，超聲使其溶解，放冷，定容，即得（0.5045mg·mL-1）。

2.1.2 樣品溶液的制備 取0.2 倍量處方中藥，加入適宜體積的水，浸泡30 min，提取相應(yīng)次數(shù)，濾過，濾液合并，濃縮至適量，放冷至室溫，加水定容至50 mL量瓶中，備用。精密吸取提取液5 mL，置50 mL量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，超聲20 min，濾過，精密吸取續(xù)濾液2 mL置5 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。

2.1.3 最大吸收波長的確定 分別吸取對照品和樣品溶液各1 mL，使用硝酸鋁顯色法，于200～800 nm波長處掃描，發(fā)現(xiàn)兩者均在510 nm 的波長處有最大吸收（圖1），故選用510 nm 作為檢測波長。

圖1 加味結(jié)石湯供試品溶液和蘆丁對照品溶液紫外掃描圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1 項下對照品溶 液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，分別加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min，最后加4%氫氧化鈉溶液4 mL，70%乙醇定容至10 mL，混勻，靜置15 min[4]。以相應(yīng)試劑為空白對照，在510 nm 處測吸光度，以吸光度值為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得回歸方程：Y=0.011 5X-0.001 1（r=0.999 8），在12.36～74.16μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 取質(zhì)量濃度為0.037 08 mg·mL-1的對照品溶液，按2.1.4 項下方法，連續(xù)測定6 次，RSD為0.13%，表明儀器精密性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密移取同一份樣品溶液1.0 mL，按2.1.4 項下方法，于5、10、15、20、25、30 min測定，RSD 為0.55%，表明供試品溶液在30 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取0.2 倍量處方藥材，按照樣品制備方法（液料比為12∶1，煎煮時間為1.5 h，煎煮次數(shù)為2 次）平行煎煮6 份樣品，按2.1.4 項下方法測定吸光度值并計算總黃酮含量，RSD 為1.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱定0.1 倍量處方藥材，共6份，精密加入蘆丁對照品溶液適量（與0.1倍處方藥材所含黃酮量相當），按照樣品制備方法（液料比為12∶1，煎煮時間為1.5 h，煎煮次數(shù)為2次）煎煮樣品，按2.1.4項下方法測定吸光度，測得平均回收率為97.78%，RSD 為2.91%，加樣回收率符合要求。

2.2 干膏得率的測定

精密吸取樣品提取液20 mL，放置于蒸發(fā)皿（經(jīng)干燥至質(zhì)量恒定），在水浴中蒸干，保持105 ℃溫度條件，5 h 后于干燥器冷卻1 h?？焖俜Q取質(zhì)量，根據(jù)公式（1）計算出膏率[5]。

式中，W為出膏質(zhì)量，M為藥材質(zhì)量，V為樣品溶液的體積。

2.3 單因素試驗

以總黃酮含量和干膏得率為指標，采用加權(quán)綜合評分法，兩者的權(quán)重分別為50、50，按公式（2）計算綜合評分[6]。

對液料比（8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1）、煎煮時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、煎煮次數(shù)（1、2、3 次，考慮到成本和實際生產(chǎn)，煎煮次數(shù)試驗只選1、2、3 次）這些因素進行考察，結(jié)果顯示，加水量為12 倍時綜合評分最高，煎煮時間為1.5 h時綜合評分最高，綜合評分隨著煎煮次數(shù)的增加而增加，煎煮次數(shù)為2 次時，綜合評分急劇增加，當煎煮次數(shù)達到3 次時，綜合評分曲線增加變緩，說明繼續(xù)增加煎煮次數(shù)已無實質(zhì)性意義。

2.4 Box-Behnken法優(yōu)化加味結(jié)石湯提取工藝

2.4.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果 據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇液料比（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數(shù)（C）3 個因素作為考察對象，每個因素三水平（表1），根據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案，總共設(shè)計17組，見表2，采用Design-Expert 8.0.6軟件對綜合評分數(shù)據(jù)進行回歸，結(jié)果見表3。

表1 加味結(jié)石湯提取工藝響應(yīng)面試驗因素與水平

表2 加味結(jié)石湯提取工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

使用統(tǒng)計軟件Design Expert 8.0.6 對表2 中各指標性成分的綜合權(quán)重數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得回歸方程：Y=97.20-0.33A-2.38B+4.53C+0.95AB-3.57AC-1.97 BC-5.22A2-11.24B2-8.16C2，3個因素中對加味結(jié)石湯提取工藝影響結(jié)果依次為C＞B＞A?；貧w模型P＜0.000 1，說明此模型具有顯著性，且r=0.988 6，表明模型擬合度良好，失擬項P＞0.05，表明模型失擬不顯著，試驗誤差小，說明可以很好地對加味結(jié)石湯的提取工藝進行預(yù)測和分析。

2.4.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)響應(yīng)方程繪制響應(yīng)面曲面圖，見圖2，從圖2可以看出，兩兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響，隨著各因素的水平值增加，綜合評分值會出現(xiàn)一個峰值，當各水平持續(xù)升高時，綜合評分值又下降或坡度相對平緩，如隨著煎煮時間的增加，綜合評分先升高后下降，煎煮次數(shù)由1 次升高為2 次時，提取效率顯著升高，當煎煮次數(shù)增加為3 次時，曲面相對平緩。使用Design-Expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化過后的最佳提取工藝條件為液料比11.37∶1，煎煮時間1.46 h，煎煮次數(shù)2.31 次，在此條件下，綜合評分最大值為97.95?？紤]到實際操作過程中的局限性，將各參數(shù)調(diào)整為液料比12∶1，煎煮時間1.5 h，煎煮次數(shù)2次。

圖2 加味結(jié)石湯各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.5 驗證實驗的結(jié)果分析

進一步對提取工藝進行驗證，考察所得優(yōu)化后的提取工藝的穩(wěn)定性，按照處方比例稱取藥材3 份，加12 倍量水，煎煮2 次，每次1.5 h，測得總黃酮平均提取率為2.29%，干膏得率為22.20%，都接近響應(yīng)面法最優(yōu)數(shù)據(jù)的理論值，表明該方法準確可靠。

3 討論

本實驗選擇了干膏得率和總黃酮含量作為雙指標，其原因為濃膏的出膏率對制劑后續(xù)的醇沉、制粒等工藝操作影響較大[7]，另一方面加味結(jié)石湯方中重用金錢草、連錢草為君藥，兩者質(zhì)量占整個方子總量的40%，金錢草、連錢草主要化學(xué)成分均為黃酮類[8-10]。研究報道，金錢草的利尿排石作用機制可能為提取液中黃酮類成分的羰基和酚羥基與草酸根競爭性結(jié)合鈣離子的結(jié)合位點有關(guān)，從而達到減少草酸鈣的形成[7，11]。

響應(yīng)面分析法被廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取，該方法試驗次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高且能夠研究幾種因素間的交互作用[12-13]，與傳統(tǒng)方法相比，能更直觀、更準確得到最優(yōu)組合。

肝膽結(jié)石和泌尿系統(tǒng)結(jié)石是臨床的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率呈逐年增高趨勢，并嚴重危害人類的健康和生命[1,14]。加味結(jié)石湯是麻城市人民醫(yī)院傳統(tǒng)協(xié)定處方，該方以中藥傳統(tǒng)方《太平惠民和劑局方》記載的八正散（車前子、瞿麥、扁蓄、滑石、梔子、甘草、木通、大黃）加減所得[15]，根據(jù)藥物特點，可同時兼顧治療肝膽結(jié)石和尿路結(jié)石。本實驗采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，為該方開發(fā)成治療結(jié)石的顆粒制劑提供參考。