續(xù)斷“發(fā)汗”條件及川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與色度的相關(guān)性研究△

周太敏，龔安慧，何華，李良遠(yuǎn)，徐嬌，江維克，周濤

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asperWall.ex Henry 的干燥根，含有三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類、生物堿類等化學(xué)成分，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等功效[1]?！鞍l(fā)汗”是一種常見的中藥材產(chǎn)地加工技術(shù)，《中華人民共和國藥典》2020 年版規(guī)定，續(xù)斷等5 種藥材需經(jīng)“發(fā)汗”加工。其中，續(xù)斷的加工程序：用微火烘至半干，堆置“發(fā)汗”至內(nèi)部變綠色時(shí)，再烘干；同時(shí)，規(guī)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于2.0%。這表明通過“發(fā)汗”使“內(nèi)部變綠”是藥材質(zhì)量合格的表現(xiàn)。傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)也認(rèn)為，續(xù)斷斷面墨綠色為佳[2-3]。已有研究表明，續(xù)斷在“發(fā)汗”過程中，川續(xù)斷皂苷Ⅵ等化學(xué)成分含量有明顯變化[4-6]，但這種顏色變化和成分含量變化的相關(guān)性并不清楚。本研究對(duì)續(xù)斷“發(fā)汗”條件及“發(fā)汗”前后的續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與外觀顏色進(jìn)行量化，探討兩者的相關(guān)性。

1 材料

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（美國沃特斯公司）；AG285型電子天平（瑞士梅特勒公司）；SK1200H 型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器公司）；GM-1.33A 型真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；UPT-Ⅱ-20T 型純水儀（成都超純科技有限公司）；EOS 60D型照相機(jī)（Canon公司）。

1.2 試藥

新鮮續(xù)斷采于貴州省龍里縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)江維克教授鑒定為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asperWall.ex Henry的根。

對(duì)照品川續(xù)斷皂苷Ⅵ（山東省分析測(cè)試中心，批號(hào)：111685-201305，純度：99.29%）；乙腈（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；95%乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.048 0 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，并用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為0.209 6 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取藥材細(xì)粉約1 g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取2 h，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液30 mL至50 mL量瓶中，70%乙醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 色譜條件 Symmetry-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脫（0～30 min，9%～21%A；30～65 min，21%～22%A；65～90 min，22%～60%A；90～100 min，60%～9%A）；流速為0.7 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長為212 nm；進(jìn)樣量為10 μL[7]。

2.2 續(xù)斷“發(fā)汗”相對(duì)含水量計(jì)算方法

通過控制樣品質(zhì)量，間接控制樣品相對(duì)含水量。相對(duì)含水量是指川續(xù)斷樣品的含水量占飽和含水量的百分比；相對(duì)含水量的測(cè)定：將采收的續(xù)斷根用清水洗凈，濾紙吸干表面水分，稱取適量續(xù)斷3 份，稱質(zhì)量（此時(shí)稱為飽和鮮質(zhì)量M1）；105 ℃下烘干至質(zhì)量恒定，稱為干質(zhì)量M2；M3為對(duì)應(yīng)含水量樣品的干質(zhì)量。按公式（1）計(jì)算相對(duì)含水量。

相對(duì)含水量=(M1-M3)/(M1-M2)×100% （1）

2.3 續(xù)斷“發(fā)汗”工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以相對(duì)含水量（A）、發(fā)汗溫度（B）及發(fā)汗時(shí)間（C）為考察因素，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量為指標(biāo)，優(yōu)選續(xù)斷的“發(fā)汗”條件，因素水平見表1。

表1 續(xù)斷“發(fā)汗”正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平（±s,n=3）

表1 續(xù)斷“發(fā)汗”正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平（±s,n=3）

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

稱取續(xù)斷段，按表2 中各實(shí)驗(yàn)序號(hào)對(duì)應(yīng)的相對(duì)含水量、溫度及時(shí)間進(jìn)行“發(fā)汗”，按2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量；極差分析可知，3 個(gè)因素對(duì)續(xù)斷“發(fā)汗”加工的影響為B＞A＞C，續(xù)斷優(yōu)選“發(fā)汗”條件為A2B1C2，即45 ℃烘至相對(duì)含水量為（40±5）%時(shí)，在25 ℃環(huán)境下“發(fā)汗”72 h。結(jié)果見表2。

表2 不同“發(fā)汗”條件下川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量結(jié)果

2.5 續(xù)斷“發(fā)汗”前后川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量及樣品斷面顏色測(cè)定

2.5.1 續(xù)斷“發(fā)汗”前后川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測(cè)定 基于優(yōu)選的“發(fā)汗”條件進(jìn)行樣品處理，按2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定對(duì)應(yīng)樣品“發(fā)汗”前后川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)續(xù)斷“發(fā)汗”后川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.29%～10.54%，而“發(fā)汗”前質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.23%～7.64%，表明“發(fā)汗”后川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量顯著升高（P＜0.05，表3）。

2.5.2 續(xù)斷“發(fā)汗”前后樣品顏色測(cè)定 通過優(yōu)選的“發(fā)汗”條件平行“發(fā)汗”處理10 批樣品，采用數(shù)碼相機(jī)與計(jì)算機(jī)圖像技術(shù)對(duì)續(xù)斷“發(fā)汗”前后的皮部斷面顏色進(jìn)行數(shù)字化表征[8-9].從每批樣品中隨機(jī)選取3 份續(xù)斷，在每份續(xù)斷樣品皮部的同一部位采集圖像，建立續(xù)斷圖庫。在Photoshop 打開續(xù)斷圖像，選擇工具欄中的“窗口”菜單下的“信息”命令，在顏色模型中選擇L*（代表顏色明暗）、a*（代表顏色紅綠色度）、b*（代表顏色黃藍(lán)色度）模型，讀取每組續(xù)斷圖像中的L*、a*、b*值，計(jì)平均值。

2.5.3 續(xù)斷“發(fā)汗”前后樣品斷面顏色測(cè)定結(jié)果根據(jù)10批樣品“發(fā)汗”前后的色差值發(fā)現(xiàn)，10批樣品“發(fā)汗”前后的斷面皮部顏色具有差異。進(jìn)一步比較續(xù)斷“發(fā)汗”前后的顏色參數(shù)值（表3），發(fā)現(xiàn)“發(fā)汗”后L*值減小，b*值增大，導(dǎo)致續(xù)斷斷面顏色加深；且L*及b*值在“發(fā)汗”前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（雙尾檢測(cè)概率P＜0.05），而a*值在“發(fā)汗”前后差異不明顯，表明亮度和黃藍(lán)度差異是造成續(xù)斷“發(fā)汗”前后斷面皮部顏色差異的主要原因。

表3 續(xù)斷“發(fā)汗”前后顏色值及川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.6 相關(guān)性分析

續(xù)斷經(jīng)優(yōu)選出的“發(fā)汗”條件處理后，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量相對(duì)“發(fā)汗”前升高，續(xù)斷斷面顏色較“發(fā)汗”前加深。將續(xù)斷“發(fā)汗”前后的有效成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與顏色指標(biāo)L*、a*、b*相關(guān)聯(lián)，用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。續(xù)斷“發(fā)汗”前川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與L*、a*、b*的相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.602、0.107、0.195；“發(fā)汗”后川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與L*、a*、b*的r分別為0.573、0.102、-0.118，兩者P值均大于0.05，則川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與續(xù)斷“發(fā)汗”前后L*、a*、b*相關(guān)性不顯著，表明在一定程度上續(xù)斷斷面顏色變化與川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量變化無直接聯(lián)系。

表4 續(xù)斷“發(fā)汗”前后川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與L*、a*、b*相關(guān)性(n=10)

3 討論

歷版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，續(xù)斷藥材需“發(fā)汗”加工，但影響“發(fā)汗”加工效果的因素并未研究。本研究通過預(yù)試驗(yàn)，擬定了3 個(gè)與“發(fā)汗”效果相關(guān)的影響因素（樣品相對(duì)含水量、發(fā)汗時(shí)間、發(fā)汗溫度），以川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討上述3 個(gè)因素對(duì)“發(fā)汗”效果的影響，同時(shí)建立了續(xù)斷的“發(fā)汗”條件：續(xù)斷鮮品45 ℃烘至樣品相對(duì)含水量為（40±5）%，25 ℃環(huán)境下“發(fā)汗”72 h。極差分析結(jié)果顯示，發(fā)汗溫度對(duì)樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的影響最大。這可能與溫度導(dǎo)致“發(fā)汗”過程中的酶促反應(yīng)及微生物活動(dòng)發(fā)生變化，促進(jìn)其外觀性狀及內(nèi)在品質(zhì)變化有關(guān)[10-11]。以往研究關(guān)于“發(fā)汗”對(duì)續(xù)斷顏色的影響都是文字描述，未進(jìn)行量化比較，本研究結(jié)合數(shù)碼相機(jī)和計(jì)算機(jī)圖像技術(shù)的方法對(duì)續(xù)斷顏色進(jìn)行數(shù)字化表征，同時(shí)將“發(fā)汗”前后續(xù)斷藥材斷面顏色與川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者并不具有顯著相關(guān)性，推測(cè)斷面顏色變化不是川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量變化導(dǎo)致的，可能與“發(fā)汗”過程中的其他化學(xué)成分變化有關(guān)。龔安慧[12]對(duì)續(xù)斷進(jìn)行“發(fā)汗”處理后也發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量升高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)總皂苷、續(xù)斷苷A、續(xù)斷苷B 含量降低，續(xù)斷斷面皮部墨綠色或黃棕色，并對(duì)色澤與化合物含量變化進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，“發(fā)汗”前后色澤差異與續(xù)斷苷A、續(xù)斷苷B 及續(xù)斷總皂苷含量的差異具有顯著相關(guān)性。在其他藥材“發(fā)汗”研究中也表明，環(huán)烯醚萜類成分能發(fā)生一系列的氧化、聚合、轉(zhuǎn)化等化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致穩(wěn)定呈色物質(zhì)的產(chǎn)生[13]。以上研究暗示可從環(huán)烯醚萜類成分著手分析續(xù)斷“發(fā)汗”前后顏色變化。

本研究采用數(shù)碼相機(jī)和計(jì)算機(jī)圖像技術(shù)對(duì)續(xù)斷藥材顏色進(jìn)行數(shù)字化表征，并與續(xù)斷所含成分的含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的方法，為續(xù)斷“發(fā)汗”顏色變化機(jī)制提供了思路，為需要“發(fā)汗”工藝的藥材建立質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供參考。