基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物信息學的旋覆代赭湯治療胃食管反流病的作用機制研究

杜佳雪，劉紹能

1.中國中醫(yī)科學院 廣安門醫(yī)院，北京 100053；

2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）指胃內(nèi)容物反流入食管，引起不適癥狀和（或）并發(fā)癥的一種疾病[1]。目前，GERD 主要分為非糜爛性反流病（non-erosive reflux disease，NERD）、反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）和Barrett食管（Barrett esophagus，BE）三大臨床類型。典型和常見的GERD 癥狀為燒心和反流，其他少見或不典型的相關(guān)癥狀包括上腹痛、上腹不適、胸痛、噯氣、腹脹、咽部異物感、吞咽痛、吞咽困難等，此外還有食管外癥狀，如慢性咳嗽、咽喉炎、哮喘等[2]。GERD 在中醫(yī)中應(yīng)歸屬于“吐酸”“嘔苦”“吞酸”“嘈雜”“食管癉”等范疇，主要證型有肝胃郁熱證、膽熱犯胃證、氣郁痰阻證、瘀血阻絡(luò)證、中虛氣逆證、脾虛濕熱證。

旋覆代赭湯首載于《傷寒論·辨太陽病脈證并治》：“傷寒發(fā)汗，若吐若下，解后心下痞硬，噫氣不除者，旋覆代赭湯主之?！盵3]旋覆代赭湯為和胃降逆法的代表方劑，方中旋覆花、代赭石下氣降逆、消痰止嘔，半夏、生姜助其散結(jié)降逆、止嘔化痰之效，人參、大棗、甘草益氣和中，全方升降相因，共奏和胃降逆、調(diào)理脾胃升降之功[4]。現(xiàn)代藥理學研究表明，旋覆代赭湯具有抗炎、保護食管黏膜、促進胃動力、抑制胃酸分泌、抗胃潰瘍、鎮(zhèn)吐等作用。因此廣泛用于治療消化系統(tǒng)疾病，如反流性食管炎、反流性胃炎、功能性消化不良、頑固性呃逆、食管癌、反流性咳嗽、反流性喉炎等[5-6]。旋覆代赭湯主治“心下痞硬，噫氣不除”之證。動物實驗顯示，旋覆代赭湯對胃黏膜具有明顯的保護和修復作用，其作用機制可能與阻滯H2受體，抑制組胺對胃酸分泌的影響有關(guān)[7]。臨床觀察表明，旋覆代赭湯治療GERD療效顯著，能夠有效改善中醫(yī)證候、改善患者食管動力、改善患者胃黏膜組織，值得廣泛推廣[8-9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是在系統(tǒng)生物學與計算機技術(shù)高速發(fā)展的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)綜合地分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預與影響，揭示藥物多分子協(xié)同作用于人體的機制[10-11]，與中醫(yī)學的整體觀念和中藥及其復方多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的原理相符[12]。生物信息學主要研究生物系統(tǒng)中的信息現(xiàn)象、信息流及其相互作用和調(diào)控規(guī)律[13]。本研究基于旋覆代赭湯多成分、多靶點、多途徑作用的研究思路，使用網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物信息學技術(shù)，分析GERD 的差異表達基因，構(gòu)建旋覆代赭湯治療GERD 的化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，初步闡述旋覆代赭湯治療GERD 的作用機制，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 旋覆代赭湯活性成分的篩選及靶點預測

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索旋覆代赭湯的化合物成分，根據(jù)口服利用度（oral availability，OB）≥30% 且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 篩選藥物活性成分，并收集其預測靶點?；赥CMID 數(shù)據(jù)庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）和BATMAN 數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索旋覆代赭湯藥物的活性成分，并設(shè)置閾值Score≥20。運用STITCH 數(shù)據(jù)庫（http://stitch.embl.de/）預測旋覆代赭湯活性成分的潛在靶點。通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）檢索收集的藥物靶點蛋白，設(shè)置物種為人（homo sapiens），獲取靶點蛋白的官方名稱并篩除非人類蛋白。

1.2 GERD靶點的收集

在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載GSE9768 數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集由利茲大學分子流行病學實驗室使用GPL570 平臺測序，將Barrett 食管細胞系暴露于酸性環(huán)境（pH 4.5）中，分別在2、6 h 提取RNA，包括5 個2 h 提取的樣本和6 個6 h 提取的樣本。利用Perl 語言對數(shù)據(jù)集基因進行注釋，利用R語言中l(wèi)imma包對數(shù)據(jù)集進行差異分析，設(shè)置閾值 Fold Change≥2，P＜0.05。從GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）上檢索關(guān)鍵詞“gastroesophageal reflux”，收集疾病靶點，將GSE9768 數(shù)據(jù)集的差異表達基因與數(shù)據(jù)庫收集的疾病靶點合并去重后作為GERD的疾病靶點。

1.3 靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

對藥物靶點和疾病靶點取交集后，將交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫進行靶點PPI 分析，設(shè)置置信度為最高（0.9）。基于從STRING數(shù)據(jù)庫獲得的蛋白間相互作用關(guān)系，在Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，使用CytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學分析，設(shè)置拓撲參數(shù)閾值為介度中心性（degree centrality，DC）中位數(shù)2 倍值、介度中心性（betweenness centrality，BC）中位數(shù)、緊密中心性（closeness centrality，CC）中位數(shù)，篩選滿足上述參數(shù)的靶點蛋白作為旋覆代赭湯治療GERD的關(guān)鍵靶點。

1.4 化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

在Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，使用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學分析，設(shè)置拓撲參數(shù)閾值為DC 中位數(shù)2 倍值、BC中位數(shù)、CC 中位數(shù)，篩選滿足上述參數(shù)的活性成分作為旋覆代赭湯治療GERD的關(guān)鍵藥效分子。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行GO 富集分析，利用Bioconductor 中的R 包clusterprofile 對交集靶點進行KEGG 通路富集分析，設(shè)置閾值P＜0.05，根據(jù)富集分析結(jié)果在Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 旋覆代赭湯的活性成分和預測靶點

利用TCMSP、TCMID、BATMAN、STITCH 數(shù)據(jù)庫共收集到旋覆代赭湯382 個活性成分和2364 個潛在靶點，其中半夏包含38個活性成分，大棗包含84個活性成分，代赭石包含1 個活性成分，甘草包含152 個活性成分，人參包含104 個活性成分，生姜包含42個活性成分，旋覆花包含30個活性成分。

2.2 GERD靶點

對GSE9768數(shù)據(jù)集進行差異分析，共得到1549個差異基因，見圖1～2。通過GeneCards、TTD、DisGeNET數(shù)據(jù)庫共收集到2996 個疾病靶點，與差異基因合并去重后共收集到4371個GERD的疾病靶點。

圖1 GSE9768數(shù)據(jù)集差異基因分析熱圖

圖2 GSE9768數(shù)據(jù)集差異分析火山圖

2.3 靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

旋覆代赭湯靶點和GERD 疾病靶點的816 個交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)及經(jīng)過篩選后的關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖3 所示，靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有665 個節(jié)點和3833 條邊，關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有204 個節(jié)點和2258條邊，圖3中節(jié)點直徑和顏色深度與節(jié)點DC 值成正比。網(wǎng)絡(luò)的拓撲學分析結(jié)果如表1 所示，網(wǎng)絡(luò)DC 中位數(shù)2 倍值為14，BC 中位數(shù)為297.122 62，CC 中位數(shù)為0.032 832 28，據(jù)此篩選出164 個關(guān)鍵靶點，其中DC最大的6個靶點為E1A結(jié)合蛋白P300（EP300，88）、磷脂酰肌醇3-激酶CA（PIK3CA，86）、腫瘤蛋白p53（TP53，80）、蛋白激酶B1（Akt1，71）、CREB 結(jié)合蛋白（CREBBP，72）、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3，71）。

表1 旋覆代赭湯治療GERD靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)部分拓撲學分析

圖3 旋覆代赭湯治療GERD靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)及經(jīng)過篩選后的關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

旋覆代赭湯治療GERD 的化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)如圖4 所示，網(wǎng)絡(luò)共有476 個節(jié)點和2385 條邊，包括1 個疾病節(jié)點、7 個藥物節(jié)點、304 個化合物節(jié)點、164 個關(guān)鍵靶點節(jié)點。網(wǎng)絡(luò)DC 中位數(shù)2 倍值為12，BC 中位數(shù)為109.961 202 5，CC 中位數(shù)為0.360 396 4，據(jù)此篩選出36個關(guān)鍵藥效分子（表2）。其中DC 值較高的有白樺脂醇、水菖蒲酮、槲皮素、姜酮、3-甲基-6，7，8-三氫吡咯[1,2-A]嘧啶-2-酮、三磷酸腺苷、延胡索乙素、葫蘆巴堿、β-谷甾醇。

表2 旋覆代赭湯治療GERD的關(guān)鍵藥效分子拓撲學參數(shù)

圖4 旋覆代赭湯治療GERD的化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析和化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

對交集靶點進行的GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，結(jié)果見圖5～6。GO 富集分析共富集到生物過程（biological processes，BP）條目806 個、細胞組分（cellular component，CC）條目81 個和分子功能（molecular function，MF）條目131 個，包括細胞增殖的陽性調(diào)節(jié)（positive regulation of cell proliferation）、絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)（MAPK cascade）、血管生成（angiogenesis）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、細胞因子活動（cytokine activity）等。KEGG 通路富集分析共富集到183 條通路，包括內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB 信號通路（NF-κB signaling pathway）、含血清素的神經(jīng)突觸（serotonergic synapse）、胃酸分泌（gastric acid secretion）、FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）等。

圖5 旋覆代赭湯治療GERD靶點的GO富集分析

旋覆代赭湯治療GERD 的化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)如圖7 所示，網(wǎng)絡(luò)中共有647 個節(jié)點和5295 邊，包括7 個藥物節(jié)點、284 個化合物節(jié)點、156 個關(guān)鍵靶點節(jié)點、183 個通路節(jié)點。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)顯示，旋覆代赭湯通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮治療GERD的作用。

圖6 旋覆代赭湯治療GERD靶點的KEGG通路富集分析

圖7 旋覆代赭湯治療GERD的化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

GERD 是抗反流屏障功能減弱、食管清除能力下降等引起的反酸、燒心[14-15]。近年來，隨著生活方式的改變，GERD 的發(fā)病率呈逐漸升高趨勢[16]，在我國患病率約12.5%[17]。中醫(yī)藥治療GERD的臨床療效確定、價格低廉、復發(fā)率低[18]，具有一定的特色和優(yōu)勢。旋覆代赭湯出自《傷寒論》，主要功效為和胃降逆、下氣消痰，主治胃虛痰阻、氣逆不降之證，對于GERD具有一定的臨床療效。

化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析結(jié)果顯示，白樺脂醇、姜酮、槲皮素、延胡索乙素、葫蘆巴堿等活性成分DC值較高，作用靶點較多，可能在旋覆代赭湯治療GERD 的過程中發(fā)揮重要作用。動物實驗表明，GERD 的發(fā)生并不是從食管的化學性損傷開始的，而是由于深層組織發(fā)生了炎癥和免疫反應(yīng)，導致表面組織發(fā)生了損傷[19]。白樺脂醇是一種三萜類化合物，Laavola 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇及其衍生物能夠選擇性地抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，還可抑制細胞因子白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）等炎癥因子的表達。延胡索乙素是一種生物堿，李毓等[21]研究表明，延胡索乙素能明顯抑制胃黏膜基礎(chǔ)胃酸分泌，被壁細胞攝取后可能進入泌酸小管，通過降低質(zhì)子梯度而影響壁細胞的泌酸功能。Yoshinari 等[22]研究表明，飲食中添加葫蘆巴堿可以抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）形成，使得血紅蛋白糖化和脂質(zhì)積累，下調(diào)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和線粒體電子傳遞系統(tǒng)的基因表達，葫蘆巴堿能夠抑制或減緩機體的氧化應(yīng)激。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，具有良好的抗癌[23]、抗炎[24]、抗氧化[25]活性，可以抑制由炎癥因子脂多糖所引起的中性粒細胞自發(fā)性凋亡的延遲，同時槲皮素也可降低中性粒細胞對炎癥因子的敏感性，從而達到抗炎的目的[26]。Butt 等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，姜酮等香料類生物活性物質(zhì)的高抗氧化活性可以在細胞水平上激發(fā)自由基清除能力，從而緩解各種代謝綜合征，此外，香料類生物活性物質(zhì)能夠增強免疫和減少炎癥。

對靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)的分析顯示，EP300、PIK3CA、TP53、Akt1、CREBBP、STAT3 等靶點蛋白DC 值較高，意味著這些蛋白與其他蛋白作用較多，可能在旋覆代赭湯治療GERD 的過程中發(fā)揮重要作用。EP300 和CREBBP 是屬于KAT3 家族的組蛋白/蛋白賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，其作為轉(zhuǎn)錄活化因子能夠通過修飾組蛋白和非組蛋白核蛋白的賴氨酸殘基，增強轉(zhuǎn)錄[28]。CREBBP 和EP300的失活突變會導致基因組整體乙?；浇档秃突蛘{(diào)控異常，潛在的促進了腫瘤的發(fā)生[29]。TP53作為與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，一直以來受到廣泛的關(guān)注。TP53基因編碼蛋白質(zhì)為p53，作為轉(zhuǎn)錄因子，p53 誘導下游蛋白p21、BAX 和GADD4 等表達，在細胞凋亡、周期變化、DNA 修復、細胞代謝及自噬過程中都起著重要的作用[30-32]。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[33]。PIK3CA基因?qū)儆谠┗虻囊环N，可表達于正常的人體組織中，通常不易被檢測到，在正常細胞中起調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等作用，在突變時可呈過度表達，促使PI3K 催化活性增強及蛋白合成量增加，激活下游靶點Akt。激活后的Akt 具有生物活性，能持續(xù)刺激下游一系列靶蛋白，從而抑制凋亡基因的表達，引起細胞周期變短，從而導致腫瘤發(fā)生[34]。STAT3 可通過介導炎癥介質(zhì)的細胞外信號調(diào)控腫瘤細胞、免疫細胞等的生物學行為，是慢性炎癥促進腫瘤發(fā)生及腫瘤相關(guān)性炎癥形成過程中不可或缺的關(guān)鍵性分子[35]。此外，近期有研究報道，瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）能夠直接或間接參與多種消化道疾病的病理生理過程，如疼痛發(fā)生、內(nèi)臟高敏感性、炎癥反應(yīng)等，GERD 患者食管黏膜TRPV1 表達量增加，且與患者的癥狀積分相關(guān)，提示TRPV1 受體在GERD 患者癥狀的產(chǎn)生中起著重要的作用[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，麻黃堿、甘草次酸、甘草萜醇、樺木酸等活性成分均能夠作用于TRPV1，可能是旋覆代赭湯治療GERD的重要機制之一。

GO 富集分析結(jié)果顯示，旋覆代赭湯對GERD 的治療作用可能主要通過調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、周期等，涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管生成、炎癥反應(yīng)、細胞因子活動等。KEGG 通路富集分析結(jié)果主要包括內(nèi)分泌抵抗、NF-κB 信號通路、含血清素的神經(jīng)突觸、胃酸分泌、FoxO 信號通路等。Nomura 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征和肥胖是已知的GERD 危險因素，常在甲狀腺功能障礙和垂體功能減退等內(nèi)分泌疾病患者中發(fā)現(xiàn)。5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）是調(diào)節(jié)胃腸道運動、分泌及感覺功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，90%存在于消化道黏膜[39]。崔秀芳等[40]臨床研究表明，胃食管反流病患者中5-HT 水平較高，且5-HT 水平與患者腹痛有關(guān)。張婷[41]研究發(fā)現(xiàn)，5-HT通過作用于5-HT4R，對離體食管黏膜肌條具有舒張作用，對于離體食管下括約肌條具有收縮作用。NF-κB 是一類關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，與免疫細胞的活化、炎性分子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、T 和B 淋巴細胞的發(fā)育、細胞凋亡、應(yīng)激性反應(yīng)等有關(guān)[42]。FoxO 家族是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其上游受PI3K/PKB 磷酸化級聯(lián)通路的調(diào)節(jié)，下游調(diào)節(jié)的靶基因多與細胞周期、細胞凋亡、衰老及代謝有關(guān)，F(xiàn)oxO 的磷酸化/非磷酸化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能有密切關(guān)系[43]。由于FoxO 的促凋亡和抗增殖作用，其被認為是腫瘤抑制因子，在抗腫瘤中起著至關(guān)重要的作用[44-45]。

綜上所述，本研究基于中藥多成分、多靶點、多途徑作用的研究思路，以生物信息學及網(wǎng)絡(luò)藥理學為基礎(chǔ)，篩選出Barrett 食管細胞系接觸膽汁酸不同時間的差異基因，構(gòu)建了化合物-關(guān)鍵靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)、靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，對關(guān)鍵藥效分子和關(guān)鍵靶點進行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，旋覆代赭湯中的白樺脂醇、姜酮、槲皮素、延胡索乙素、葫蘆巴堿等活性成分，能夠作用于EP300、PIK3CA、TP53、Akt1、CREBBP、STAT3、TRPV1等靶點，通過調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞因子活動、胃酸分泌、胃腸道運動等生物過程達到治療GERD 的目的。本研究初步闡述了旋覆代赭湯治療GERD 的作用機制，為后續(xù)研究提供了參考。但中藥的化合物成分及潛在靶點并未全部錄入，因此諸多機制尚待實驗研究驗證。