人參水提取物中的人參三萜在人腸內(nèi)菌體外溫孵體系的轉(zhuǎn)化研究△

楊秀偉，張雷，徐嵬，鄭飛，白雪媛，陳長(zhǎng)寶

1.北京大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系/天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；

2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117

人參Ginseng Radix et Rhizoma 系五加科多年生草本植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥[1]，且其種植品被批準(zhǔn)為新資源食品[2]。人參藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，但直到1963 年，對(duì)其的研究才真正步入尋找藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的階段[3-4]。人參具有抗疲勞、保護(hù)心血管和肝臟系統(tǒng)、抗應(yīng)激、抗誘變、抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗癌等藥理活性，尤其是具有適應(yīng)原樣（adaptogenlike）作用，其主要活性成分為人參皂苷（ginsenoside，G）[5-7]。在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中，中醫(yī)形成了以口服為主的給藥途徑，中藥化學(xué)成分吸收進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)之前往往需要在腸內(nèi)細(xì)菌作用下活性化才能更好地發(fā)揮作用，這一機(jī)制的提出，為基于中藥化學(xué)成分體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化機(jī)制確定中藥有效成分和/或毒性成分[8-9]，以及通過(guò)尋找新藥先導(dǎo)化合物研制現(xiàn)代中藥開(kāi)辟了新途徑[10]。本實(shí)驗(yàn)采用超快速液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（UFLC-MS/MS）研究人參水提取物中的人參三萜（包括人參皂苷及其苷元）在人腸內(nèi)細(xì)菌體外溫孵體系的轉(zhuǎn)化。

1 材料

1.1 儀器

島津LCMS-8050 型超高效液相色譜-質(zhì)譜儀，包括Nexera X2型UFLC液相系統(tǒng)（LC-30AD型二元泵、SIL-30AC 型自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M30A 型檢測(cè)器和CTO-20AC型柱溫箱）、三重四極桿定量質(zhì)譜［配備電噴霧離子源（ESI）和LabSolution 工作站］；Waters ACQUITY UPLC?BEHShield RP18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；WatersACQUITY UPLC?BEH Shield RP18VanGuardTM色譜柱（5 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；Thermo Scientific 1029 型厭氧培養(yǎng)箱，配有高純氮?dú)夂透呒內(nèi)?lián)氣；XS105DU 型十萬(wàn)分之一電子天平（Mettler Toledo 公司）；AR4120 型萬(wàn)分之一電子天平［奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司］；KQ5200型超聲波清洗儀（功率200 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；CV200型真空離心濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（Millipore公司）。

1.2 試藥

人參飲片（批號(hào)：PG-Y-201606）購(gòu)自安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院楊秀偉教授鑒定為人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，憑證樣品存放于北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

LC-MS 級(jí)乙腈和甲醇購(gòu)自Fisher Scientific 公司；HPLC 級(jí)醋酸銨（Sigma-Aldrich 公司）；內(nèi)標(biāo)地高辛（digoxin，批號(hào)：100015-200709，純度：98.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；自制超純水。

對(duì)照品20(S)-G-Rh1（1）、20(R)-G-Rh1（2）、G-Rg6（3）、G-F4（4）、G-Rk3（5）、G-Rh4（6）、G-Rg1（7）、20(S)-G-Rf（8）、20(R)-G-Rf（9）、20(S)-三七皂苷R2［20(S)-NG-R2，10］、20(R)-NG-R2（11）、20(S)-G-Rg2（12）、20(R)-G-Rg2（13）、G-Rs2（14）、G-Rs1（15）、G-Rd（16）、NG-R1（17）、G-Re2（18）、GRe（19）、20-glu-G-Rf（20）、西洋參皂苷R1（Q-R1，21）、G-Ro（22）、G-Rb1（23）、G-Rc（24）、G-Rb2（25）、G-Ra2（26）、G-Ra3（27）、G-Rb3（28）[11]、G-Re1（29）、G-Re4（30）、G-Ra1（31）[12]、G-Rs4（32）、20(S)-G-Rs3（33）、20(R)-G-Rs3（34）、NG-R4（35）、G-Rk1（36）、G-Rg5（37）、20(S)-G-Rg3（38）、20(R) -G-Rg3（39）、G-Rg9（40）[11]、20(S) -G-Rh2（42）、20(R)-G-Rh2（43）、20(S)-原人參三醇［20(S)-PPT，44］、20(R)-PPT（45）、20(S)-原人參二醇［20(S)-PPD，46］、20(R)-PPD（47）[13]均為本課題組從紅參[11]、生曬參[12]、人參莖葉[13]中得到；對(duì)照品竹節(jié)參皂苷Ⅳ（CS-Ⅳ，41）、CS-Ⅳa（48）和G-CK（49）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；所有化合物純度經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）驗(yàn)證均大于98%。以上49個(gè)對(duì)照品的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 49個(gè)人參皂苷和內(nèi)標(biāo)地高辛結(jié)構(gòu)

按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程[14]制備一般厭氧培養(yǎng)基（GAM），成分為蛋白胨15.0 g·L-1、酵母粉5.0 g·L-1、大豆胨5.0 g·L-1、牛肉粉5.0 g·L-1、葡萄糖5.0 g·L-1、氯化鈉5.0 g·L-1、可溶性淀粉3.0 g·L-1、半胱氨酸0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀2.5 g·L-1、氯化血紅素0.005 g·L-1、維生素K10.001 g·L-1。

2 方法

2.1 人參總?cè)频闹苽?/h3>

稱取人參飲片5 g，加入蒸餾水275 mL，加熱回流提取2 h，濾過(guò)。濾渣再次加入蒸餾水275 mL，加熱回流2 h，濾過(guò)后合并2次濾液，水浴蒸至約50 mL，加入乙醇100 mL使乙醇體積分?jǐn)?shù)約為65%，4 ℃靜置過(guò)夜，3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為11 cm），收集上清液。上清液減壓濃縮除去乙醇后冷凍干燥，稱定質(zhì)量，得到人參總?cè)疲òㄈ圃碥占捌滠赵┨崛∥铮芊獗４妗?/p>

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各對(duì)照品適量，溶解于質(zhì)譜級(jí)甲醇中制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別移取適量?jī)?chǔ)備液混合并稀釋制成混合對(duì)照品母液，然后用甲醇連續(xù)稀釋得到系列質(zhì)量濃度溶液，濃縮干燥后加入含有滅活腸內(nèi)細(xì)菌的培養(yǎng)基中，加入內(nèi)標(biāo)地高辛溶液（1 mg·mL-1）5 μL，再加入乙酸乙酯3 mL，充分渦旋后15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為82 mm），分出乙酸乙酯層，用乙酸乙酯重復(fù)萃取3 次。用水飽和的正丁醇萃取3 次，每次3 mL。合并正丁醇萃取液，用少量水洗3 次。合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，減壓濃縮干燥。殘?jiān)尤爰状? mL 溶解，15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為82 mm），上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，進(jìn)行UFLCMS/MS分析。

2.3 厭氧培養(yǎng)基的配制和人腸內(nèi)菌叢的制備

按操作規(guī)程[14]，取10 號(hào)自封袋，充滿氮?dú)?，置換掉自封袋內(nèi)的氣體，擠壓出氣體后再通入氮?dú)?。如此重?fù)2 次，再次充滿氮?dú)?，將志愿者一次排出的所有糞便裝入自封袋，封口，并用手?jǐn)D壓自封袋使糞便均質(zhì)化；通過(guò)厭氧箱的置換倉(cāng)將糞便轉(zhuǎn)移至厭氧無(wú)菌操作條件下，取糞便3～5 g，放入配制好的GAM 溶液200 mL 中，加塞封口；置厭氧培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h；取出菌液1 mL，加至已裝有滅菌GAM 溶液約40 mL 的具塞錐形瓶中，37 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h，取出，置于4 ℃冰箱保存，即為人腸內(nèi)細(xì)菌混合菌叢。

2.4 人參總?cè)频娜四c內(nèi)細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化

準(zhǔn)確稱取2.1 項(xiàng)下人參總?cè)铺崛∥?.524 g（折合人參飲片1 g），加入到4 mL蒸餾水中，超聲使充分溶解后轉(zhuǎn)移至厭氧培養(yǎng)箱中。分別于10 mL 離心管中加入空白GAM 溶液3 mL、人腸內(nèi)細(xì)菌液0.2 mL 和人參總?cè)铺崛∥锶芤?.1 mL。密封后轉(zhuǎn)移至搖床，在37 ℃、100 r·min-1溫孵培養(yǎng)，分別于0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0 h 取出，加入乙酸乙酯3 mL 滅活，加入內(nèi)標(biāo)地高辛溶液（1 mg·mL-1）5 μL，充分渦旋后離心，分出乙酸乙酯層，再次加入乙酸乙酯3 mL，重復(fù)萃取3 次。乙酸乙酯萃取完成后加入水飽和正丁醇再萃取3 次，每次3 mL，合并正丁醇萃取液，用少量水洗3 次。合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，減壓濃縮干燥。殘?jiān)尤爰状? mL 溶解，在15 000 r·min-1離心（離心半徑為82 mm）10 min，上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，上樣UFLC-MS/MS 系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2.5 UFLC-MS/MS分析方法的建立和方法學(xué)考察

2.5.1 色譜及質(zhì)譜條件 綜合考慮分析物質(zhì)譜優(yōu)化的結(jié)果和生物基質(zhì)中可能存在的干擾成分的影響，最終選擇0.5 mmol·L-1的醋酸銨水溶液（A）和乙腈（B）作為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～3 min，80%～78%A；3～5min，78%～70%A；5～9min，70%～67%A；9～11min，67%～65%A；11～13 min，65%～58%A；13～23 min，58%～53%A；23～24 min，53%～48%A；24～29 min，48%～45%A；29～29.1min，45%～40%A；29.1～34min，40%～35%A；34～36 min，35%～5%A）；流速為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積為1 μL；柱溫為30 ℃。

優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為霧化氣流速：3 L·min-1；干燥氣流速：10 L·min-1；加熱氣流速：10 L·min-1；接口加熱器溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；接口電壓：-3.0 kV；檢測(cè)器電壓：1.80 kV；電離源為ESI；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；掃描模式為負(fù)離子模式。

2.5.2 方法學(xué)驗(yàn)證 按文獻(xiàn)方法分別對(duì)分析方法的專屬性、線性、定量下限和檢測(cè)下限、日內(nèi)和日間精密度及準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性進(jìn)行考察[15]。

3 結(jié)果與討論

3.1 UFLC-MS/MS分析方法的建立

利用單獨(dú)的對(duì)照品溶液分別優(yōu)化每個(gè)分析物的MRM 參數(shù)，利用混合對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜分離方法優(yōu)化。49個(gè)化合物經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 49個(gè)分析物和內(nèi)標(biāo)地高辛優(yōu)化后的MRM參數(shù)

續(xù)表1

3.2 UFLC-MS/MS分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證

經(jīng)方法學(xué)考察，空白基質(zhì)不會(huì)干擾人參皂苷和苷元的定量分析（圖2～3），49 個(gè)化合物線性、精密度和準(zhǔn)確性、回收率和穩(wěn)定性均符合生物樣品分析的要求。

圖2 空白基質(zhì)樣品MRM疊加圖

3.3 樣品前處理方法優(yōu)化

培養(yǎng)腸內(nèi)細(xì)菌的培養(yǎng)基成分復(fù)雜，很容易對(duì)色譜柱和分析儀器帶來(lái)不可逆的破壞。因此，有必要對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化以保證在保留待測(cè)成分基礎(chǔ)上盡可能多地去除干擾物質(zhì)。液-液萃取是比較常用的樣品前處理方法，乙酸乙酯和正丁醇是2 種最為常用的萃取溶劑。在最初篩選萃取溶劑時(shí)，為盡可能多的去除雜質(zhì)，只選擇乙酸乙酯，以2倍量體積加入，連續(xù)萃取6 次，萃取液蒸干后加入甲醇100 μL進(jìn)行UFLC-MS/MS 分析。結(jié)果表明，極性較大的人參皂苷如G-Rb1等得不到滿意的回收率。當(dāng)分別用乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取3 次時(shí)，低極性和高極性的人參皂苷均能被很好地萃取出來(lái)。因此選擇乙酸乙酯和正丁醇作為萃取溶劑進(jìn)行樣品制備。

圖3 對(duì)照品溶液中49個(gè)分析物和內(nèi)標(biāo)地高辛MRM疊加圖

3.4 人參三萜的人腸內(nèi)菌體外溫孵生物轉(zhuǎn)化特征研究

3.4.1 不同類型人參三萜在人腸內(nèi)菌體外溫孵轉(zhuǎn)化途徑 人參三萜包括人參三萜皂苷（簡(jiǎn)稱人參皂苷）及其苷元。人參皂苷通常含有多個(gè)糖基，這些糖基在腸內(nèi)細(xì)菌的糖苷酶作用下會(huì)發(fā)生水解，生成相應(yīng)的脫糖基產(chǎn)物。對(duì)22 個(gè)PPT 型、24 個(gè)PPD 型和3 個(gè)齊墩果烷（OLE）型人參皂苷及其皂苷元的轉(zhuǎn)化特征及時(shí)間-濃度曲線進(jìn)行研究。PPD 型人參皂苷及其苷元包括G-Rs1、G-Rs2、20(S)-G-Rs3、20(R)-G-Rs3、G-Rs4、Q-R1、G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3、G-Rb1、GRb2、G-Rb3、G-Rc、G-Rd、NG-R4、G-Rk1、G-Rg5、20(S)-G-Rg3、20(R)-G-Rg3、20(S)-G-Rh2、20(R)-GRh2、G-CK、20(S)-PPD 和20(R)-PPD；PPT 型人參皂苷及其苷元包括G-Re、G-Re1、G-Re2、G-Re4、20(S)-G-Rf、20(R)-G-Rf、20-glu-G-Rf、G-Rg1、20(S)-GRg2、20(R)-G-Rg2、G-Rg6、G-Rg9、20(S)-G-Rh1、20(R)-G-Rh1、G-Rh4、G-F4、G-Rk3、NG-R1、20(S)-NGR2、20(R)-NG-R2、20(S)-PPT 和20(R)-PPT；OLE 型人參皂苷包括G-Ro、CS-Ⅳ和CS-Ⅳa。根據(jù)各人參皂苷在腸內(nèi)細(xì)菌作用下的含量變化趨勢(shì)和相關(guān)文獻(xiàn)，分別總結(jié)出了PPD、PPT 和OLE 型人參皂苷在腸內(nèi)細(xì)菌作用下的轉(zhuǎn)化途徑。

以G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3為例，PPD類型人參皂苷在人腸內(nèi)細(xì)菌作用下可能的轉(zhuǎn)化途徑見(jiàn)圖4。G-Rb3脫糖基轉(zhuǎn)化為G-Rd，可再轉(zhuǎn)化為G-Rg3、G-Rh2、PPD、G-Rg5和G-Rk1。苷元C-3 糖鏈末端葡萄糖基的C-6 結(jié)合乙酰基的G-Rs1和G-Rs2由酯解酶作用下轉(zhuǎn)化為G-Rd，此后依圖4 所示轉(zhuǎn)化；而G-Rs3由酯解酶作用下轉(zhuǎn)化為G-Rg3，此后依圖4所示轉(zhuǎn)化。

圖4 PPD類型人參皂苷在人腸內(nèi)細(xì)菌作用下可能的轉(zhuǎn)化途徑

以G-Re 為例，PPT 類型人參皂苷在人腸內(nèi)細(xì)菌作用下可能的轉(zhuǎn)化途徑見(jiàn)圖5。OLE型人參皂苷在人腸內(nèi)細(xì)菌作用下可能的轉(zhuǎn)化途徑比較簡(jiǎn)單，見(jiàn)圖6。

圖5 PPT型人參皂苷在人腸內(nèi)細(xì)菌作用下可能的轉(zhuǎn)化途徑

圖6 OLE型人參皂苷在人腸內(nèi)細(xì)菌作用下可能的轉(zhuǎn)化途徑

3.4.2 不同類型人參三萜在人腸內(nèi)菌體外溫孵轉(zhuǎn)化特征 利用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算單個(gè)人參皂苷在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)腸內(nèi)細(xì)菌和人參三萜同時(shí)加入，2 h 內(nèi)幾乎所有化合物均較為穩(wěn)定。2 h 后大部分成分的含量開(kāi)始迅速變化，同時(shí)溫孵液明顯渾濁，表明腸內(nèi)菌生長(zhǎng)和人參三萜轉(zhuǎn)化隨之進(jìn)行。所有人參皂苷，無(wú)論是PPD、PPT 型還是OLE 型，其整體的變化趨勢(shì)均為隨溫孵時(shí)間延長(zhǎng)，含糖基較多的皂苷含量逐漸下降，同時(shí)含糖基較少的皂苷含量逐漸上升。根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果可知，不同類型的人參皂苷在轉(zhuǎn)化能力方面有非常明顯的差異。整體來(lái)說(shuō)，PPD 型人參皂苷轉(zhuǎn)化程度較PPT 型要高；OLE型人參皂苷也會(huì)在腸內(nèi)細(xì)菌作用下發(fā)生明顯轉(zhuǎn)化；連有乙?；娜藚⒃碥崭菀自谀c內(nèi)菌作用下水解。與加入初期相比，經(jīng)過(guò)72 h 溫孵后其含量上升超過(guò)30%的化合物包括G-Rd、20(S)-G-Rh2、20(R)-G-Rh2、20(S)-PPT、20(R)-PPT、20(S)-PPD、20(R)-PPD、GCK 和CS-Ⅳa。其中20(S)-G-Rh2、20(S)-PPD 和G-CK的含量變化最為明顯，尤其是G-CK的含量變?yōu)槌跏贾档?0 倍。除G-Rd 外，這些化合物均為低極性人參皂苷或皂苷元。這表明，在腸內(nèi)菌叢的作用下，人參皂苷非常容易脫去糖基生成G-CK 以及幾個(gè)苷元，而這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不僅吸收能力更強(qiáng)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也證明其具有著更好的生物學(xué)活性。經(jīng)過(guò)72 h 溫孵質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降超過(guò)30%的化合物包括20(S)-G-Rf、G-Rg1、G-Rs1、G-Rs2、20(S)-G-Rs3、20(R)-G-Rs3、GRs4、NG-R1、NG-R4、G-Re、G-Re1、G-Re2、G-Re4、Q-R1、G-Ro、G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc、G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3、G-Rk1和CS-Ⅳ。從這些化合物的結(jié)構(gòu)來(lái)看，其往往含有多個(gè)糖基，這些糖基容易在腸內(nèi)菌作用下水解脫去，最終形成對(duì)應(yīng)的次級(jí)苷或者苷元。

表2 人參三萜提取物中49個(gè)成分的人腸內(nèi)細(xì)菌體外溫孵過(guò)程中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

續(xù)表2

幾個(gè)帶有乙?；娜藚⒃碥召|(zhì)量分?jǐn)?shù)下降非常迅速，G-Rs1、G-Rs2、Q-R1等連有糖基較多的化合物下降更為明顯，在6～8 h 時(shí)基本已經(jīng)降到初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)的10%左右。幾個(gè)連糖基較少的皂苷如G-Rs4、20(S)-G-Rs3、20(R)-G-Rs3質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降相對(duì)較緩，在12 h 左右才基本不再變化?？赡艿脑蚴沁B有乙?；幕衔镌谀c內(nèi)菌的作用下會(huì)同時(shí)發(fā)生脫乙?；兔撎腔磻?yīng)，此三者會(huì)在轉(zhuǎn)化過(guò)程中不斷的生成和消耗，最終表現(xiàn)為含量緩慢下降。

PPD 型人參皂苷含量下降非常明顯，到72 h 時(shí)大部分化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均下降了50%以上，表明腸內(nèi)菌中的酶更容易與PPD 型人參皂苷發(fā)生作用，使其發(fā)生水解。從圖4 可以看出，G-Rd 是腸內(nèi)菌水解人參皂苷過(guò)程中非常重要的中間產(chǎn)物，其含量隨著時(shí)間具有明顯的波動(dòng)性變化。從圖7 可以看出，在最初的時(shí)候G-Rd的水解生成占據(jù)主導(dǎo)地位，其含量明顯上升，到8 h時(shí)含量達(dá)到最高。而隨著其他化合物轉(zhuǎn)化生成的逐漸減少以及G-Rd進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的增加，其含量開(kāi)始緩慢下降或者波動(dòng)。但即使72 h 以后，G-Rd的含量仍然是初始值的2倍以上。說(shuō)明G-Rd在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)揮藥效作用不容小視。

圖7 人參提取物中G-Rd的人腸內(nèi)菌體外溫孵含量-時(shí)間曲線

此外，還有2 個(gè)比較特殊的人參皂苷為G-Re1和G-Re2，兩者均為PPT 型皂苷。這2 個(gè)化合物的含量變化和G-Rd 相似，均為先上升后下降，在6 h 時(shí)含量達(dá)到最高點(diǎn)（圖8）。而結(jié)構(gòu)類似的G-Re 和G-Re4則沒(méi)有這一特點(diǎn)。比較2 類化合物的結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)G-Re1和G-Re2的糖基只有葡萄糖基，而G-Re 和G-Re4除葡萄糖基外還含有其他類型的糖基。結(jié)果表明，人參提取物中可能存在一類與G-Re1、G-Re2結(jié)構(gòu)類似但連有更多的糖基、乙?；虮；腜PT 型人參皂苷，在腸內(nèi)菌的作用下某些基團(tuán)被水解生成G-Re1和G-Re2。同時(shí)這2 個(gè)化合物本身極性也較大，會(huì)在腸內(nèi)菌作用下發(fā)生進(jìn)一步水解。

圖8 人參提取物中G-Re1和G-Re2的人腸內(nèi)菌體外溫孵含量-時(shí)間曲線

此外，隨著溫孵時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)OLE型人參皂苷的含量也變化明顯，G-Ro 在前4 h 變化比較緩慢，從6 h開(kāi)始含量逐漸下降，72 h時(shí)含量下降已十分明顯。CS-Ⅳ的含量持續(xù)降低，從12 h 開(kāi)始明顯下降。CS-Ⅳa含量則有明顯的先升后降過(guò)程，其含量在前幾個(gè)小時(shí)逐漸上升，至12 h達(dá)到頂點(diǎn)，后續(xù)則開(kāi)始逐漸下降。這與G-Rd 的轉(zhuǎn)化特征較類似。根據(jù)結(jié)構(gòu)可知，CS-Ⅳa 可由G-Ro、CS-Ⅳ以及其他OLE 型皂苷轉(zhuǎn)化生成，因此其含量表現(xiàn)出了隨時(shí)間波動(dòng)的特點(diǎn)。

從以上結(jié)果可以看出，在人腸內(nèi)菌叢作用下，各人參皂苷的初始質(zhì)量濃度并不能代表其實(shí)際在腸道中被吸收時(shí)的質(zhì)量濃度，某些化合物的含量在腸內(nèi)菌的作用下會(huì)發(fā)生顯著的變化。通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，部分人參皂苷的含量提高，如化合物G-Rd、G-CK、PPD 和PPT 等低極性人參皂苷和皂苷元。因此，即使這些化合物在生藥人參中初始含量極低，在口服給藥后仍能在動(dòng)物體內(nèi)大量檢測(cè)到。值得一提的是，動(dòng)物體內(nèi)不管是在腸內(nèi)菌種類上還是在數(shù)量上均會(huì)明顯高于體外模型，優(yōu)勢(shì)菌的種類也會(huì)有所不同。因此，在體模型中人參皂苷的轉(zhuǎn)化會(huì)更為明顯。

4 結(jié)論

本研究利用UFLC-MS/MS，對(duì)人參三萜提取物中49個(gè)化合物在人腸內(nèi)菌作用下的轉(zhuǎn)化特點(diǎn)和時(shí)間-含量變化曲線進(jìn)行了研究。人參三萜在人腸內(nèi)菌作用下會(huì)發(fā)生明顯的生物轉(zhuǎn)化，根據(jù)總結(jié)得到的PPT、PPD 和OLE 型人參三萜的轉(zhuǎn)化途徑可知脫糖基水解是人參三萜（人參皂苷）在腸內(nèi)菌液中最主要的轉(zhuǎn)化方式，其次還可能伴有脫水以及異構(gòu)化。轉(zhuǎn)化最后絕大多數(shù)高極性人參皂苷含量明顯降低，同時(shí)會(huì)生成大量具有良好藥理活性的G-CK、PPD 和PPT 等低極性人參皂苷和皂苷元。此外，發(fā)現(xiàn)PPD 型人參皂苷在人腸內(nèi)菌叢作用下的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，PPT 型人參皂苷則相對(duì)較弱，OLE 型人參皂苷也有比較明顯的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。當(dāng)人參皂苷分子上再連有乙?；?，其在腸內(nèi)菌作用下的轉(zhuǎn)化能力大大增加。