乳腺癌中Cyclin D1和TGF-β1蛋白表達(dá)及其臨床意義

嵇曉輝，李軍，楊金花

(河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院 病理科，河南 鄭州 450003)

乳腺癌是一種多病因、高風(fēng)險(xiǎn)、多途徑發(fā)生的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康。近年來(lái)隨著醫(yī)藥發(fā)展及靶向治療的飛速發(fā)展，乳腺癌的治療方法也逐步由傳統(tǒng)的手術(shù)切除及放化療向精準(zhǔn)治療方向發(fā)展[1-2]。細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)是細(xì)胞癌變過(guò)程中重要的調(diào)控因子，通過(guò)與相應(yīng)的蛋白激酶結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)酶活性，從而影響細(xì)胞分裂周期。Cyclin D1定位于染色體11q13，是G1期正向細(xì)胞周期蛋白，驅(qū)動(dòng)G1期進(jìn)入S期，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一個(gè)多效的生物因子，定位于染色體19q13，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等多種病理生理過(guò)程。目前研究認(rèn)為TGF-β1在腫瘤發(fā)生初期起抑制腫瘤作用，但在細(xì)胞惡變或腫瘤晚期過(guò)程中，其通過(guò)促腫瘤血管生成、抑制腫瘤免疫，而促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[4-5]。本研究采用免疫組化Max Vision法檢測(cè)Cyclin D1和TGF-β1在乳腺癌組織中的表達(dá)，并分析二者與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，探討二者對(duì)乳腺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移及預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院病理科2017年6月至2019年8月存檔的組織活檢標(biāo)本，包括86例乳腺癌、60例正常乳腺組織和60例乳腺良性增生組織，所有標(biāo)本均經(jīng)病理科確診?；颊呔鶠榕?，平均年齡為50歲，術(shù)前均未行放、化療及生物免疫治療。標(biāo)本經(jīng)中性甲醛固定后石蠟包埋，切片厚度4 μm。

1.2 檢測(cè)方法鼠抗人Cyclin D1單克隆抗體和兔抗人TGF-β1多克隆抗體(即用型)、二抗及DAB均購(gòu)自福州邁新公司。免疫組化采用Max Vision法，常規(guī)石蠟制片后，進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗和二抗分別于37 ℃孵育2 h和20～30 min，DAB顯色10 min，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷Cyclin D1蛋白以細(xì)胞核、TGF-β1蛋白以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽(yáng)性，每張選取5個(gè)高倍鏡視野。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下。(1)按細(xì)胞陽(yáng)性率計(jì)分。陽(yáng)性細(xì)胞率<5%為0，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分。細(xì)胞未染色為0，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘>2分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間表達(dá)陽(yáng)性率采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cyclin D1和TGF-β1在正常乳腺組織、乳腺良性增生及乳腺癌組織中的表達(dá)Cyclin D1在正常乳腺組織、乳腺良性增生及乳腺癌組織中的陽(yáng)性率分別為46.67%(28/60)、31.67%(19/60)及69.77%(60/86)；TGF-β1在正常乳腺組織、乳腺良性增生及乳腺癌組織中的陽(yáng)性率分別為48.33%(29/60)、41.67%(25/60)及79.07%(68/86)。采用χ2檢驗(yàn)兩兩比較，二者在乳腺癌組織中的表達(dá)均高于正常乳腺組織和乳腺良性增生組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；二者在正常乳腺組織和乳腺良性增生組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1和圖1、2。

表1 Cyclin D1和TGF-β1在正常乳腺組織、乳腺良性增生和乳腺癌組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 Cyclin D1和TGF-β1表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系Cyclin D1和TGF-β1在乳腺癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶中的表達(dá)高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與乳腺癌臨床分期呈正相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑、組織學(xué)類型及組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Cyclin D1和TGF-β1蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖2 TGF-β1在乳腺癌細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)(Max Vision法，×100)

2.3 Cyclin D1與TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性在60例Cyclin D1表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌組織中，有53例患者TGF-β1表達(dá)陽(yáng)性，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，乳腺癌組織中Cyclin D1蛋白表達(dá)強(qiáng)度和TGF-β1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.385，P<0.05)。

3 討論

Cyclin D1作為細(xì)胞周期調(diào)控基因，也是一個(gè)癌基因，其參與細(xì)胞周期中DNA的合成，其表達(dá)升高可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞有絲分裂的G1/S期進(jìn)程加快，使細(xì)胞分裂失去控制，從而發(fā)生惡變。Mauro等[6]研究顯示了乳腺癌細(xì)胞中的雌激素水平狀態(tài)可以影響Cyclin D1蛋白的表達(dá)，這個(gè)結(jié)果間接表明了乳腺癌中雌激素蛋白的表達(dá)與Cyclin D1之間可能存在著某種關(guān)聯(lián)性，此在后來(lái)的研究中[7]也得到證實(shí)。Cyclin D1與雌激素的密切關(guān)系也預(yù)示了乳腺癌患者的病情發(fā)展及預(yù)后評(píng)估。有研究顯示Cyclin D1在腫瘤早期組織中的表達(dá)較高，這似乎提示了良好的預(yù)后與Cyclin D1的高表達(dá)呈正相關(guān)性[8]。然而，韓濤等[9]在分析了Cyclin D1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1在臨床分期較高的晚期乳腺癌患者中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于早期乳腺癌患者，而且患者的5 a生存率也大大降低。此項(xiàng)研究卻表明Cyclin D1的表達(dá)與三陰性乳腺癌的預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)性。近年來(lái)，關(guān)于Cyclin D1與其他惡性腫瘤的關(guān)系也時(shí)有研究報(bào)道。在本研究中，86例乳腺癌組織中，有60例Cyclin D1表達(dá)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為69.77%，遠(yuǎn)高于其在正常乳腺組織(46.67%)及乳腺良性增生組織(31.67%)中的表達(dá)陽(yáng)性率，而且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生及臨床分期的進(jìn)展，Cyclin D1表達(dá)也明顯升高，但其表達(dá)陽(yáng)性率與患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)與否、腫瘤直徑大小以及組織學(xué)分類及分級(jí)均無(wú)相關(guān)性。這提示了Cyclin D1與乳腺癌的進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有顯著正相關(guān)性，提示Cyclin D1與乳腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。

TGF-β1屬于TGF-β超家族，目前認(rèn)為TGF-β1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有兩面性，對(duì)于正?；蛟缙谀[瘤細(xì)胞而言，它可以使細(xì)胞阻滯在細(xì)胞有絲分裂G1期或者延長(zhǎng)從G0期進(jìn)入S期的時(shí)間；但在腫瘤晚期進(jìn)展過(guò)程中，由于信號(hào)通路的異常改變，TGF-β1卻可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，促使腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[10]。有體外研究表明，一定水平的TGF-β1可通過(guò)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路促使肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力[11]。本研究中，TGF-β1在乳腺癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率為79.07%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常乳腺及乳腺良性增生組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，本研究顯示TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈相關(guān)性，與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑大小及組織學(xué)分類分級(jí)無(wú)相關(guān)性，這表明TGF-β1可能促使乳腺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

目前針對(duì)Cyclin D1和TGF-β1在乳腺癌中的表達(dá)相關(guān)性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。Cyclin D1和TGF-β1均作用于細(xì)胞有絲分裂G1期，而且二者在腫瘤的早期和晚期表達(dá)水平均不一致，對(duì)預(yù)后的影響也都不相同。此前，有針對(duì)Cyclin B1與TGF-β1的研究發(fā)現(xiàn)二者在食管癌細(xì)胞中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Cyclin B1的過(guò)表達(dá)可能使TGF-β1表達(dá)下降[12]。更有研究發(fā)現(xiàn)AuroraA-h-CPEB通路可能會(huì)引起Cyclin B1和CDKs的過(guò)度表達(dá),而且Cyclin B1/CDC2復(fù)合物的高活性同時(shí)也伴有Cyclin D1的過(guò)度表達(dá)[13]。本研究結(jié)果在一定程度上提示Cyclin D1和TGF-β1之間也可能存在某種調(diào)節(jié)通路。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者中，Cyclin D1和TGF-β1蛋白表達(dá)存在正相關(guān)性，但具體的調(diào)節(jié)路徑及信號(hào)通路還有待分子遺傳學(xué)水平的進(jìn)一步研究。

綜上所述，Cyclin D1與TGF-β1在人乳腺癌組織中呈過(guò)表達(dá)，且與乳腺癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及乳腺癌TNM分期呈正相關(guān)性；二者的高表達(dá)可能提示與乳腺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)可作為乳腺癌高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的判斷。同時(shí)，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的針對(duì)Cyclin D1與TGF-β1的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑將被應(yīng)用于臨床研究及治療，可使部分乳腺癌患者從靶向治療中獲益。